Determinação das taxas de decaimento transcrição de todo o genoma em quiescentes e proliferação de fibroblastos humanos

O objetivo geral deste procedimento é monitorar as taxas de decaimento do transcrito em fibroblastos proliferativos e quiescentes. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia molecular, como se as mudanças na expressão gênica resultam de mudanças na taxa de decaimento do transcrito. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece informações sobre a taxa de decaimento do transcrito, não apenas a abundância do transcrito.

Para iniciar o protocolo, estabeleça culturas proliferativas e quiescentes de fibroblastos. Os fibroblastos em proliferação devem ser tripsinizados regularmente. As culturas quiescentes podem ser estabelecidas permitindo que as placas atinjam a confluência com mudanças regulares do meio.

Adicione ActD 150 microlitros ao meio pré-aquecido de 10 mililitros para todas as placas de cultura de células biológicas replicadas. Adicione ActD a uma concentração de 15 microgramas por mililitro de meio. Misture bem a solução.

Aspire o meio antigo e adicione meio contendo ActD às células. Para coletar a amostra de ponto de tempo zero, aspire suavemente o meio ActD e pipete entre cinco e 10 mililitros de PBS pré-aquecido em uma placa de 100 milímetros, cinco mililitros de solução para uma placa de 100 milímetros, dois mililitros para um poço de uma placa de seis poços e um mililitro para um poço de uma placa de 12 poços. Aspire suavemente o PBS.

Em seguida, adicione a solução de isotiocianato de fenol-guanidina diretamente na placa de cultura de tecidos. Pipete a mistura de células da solução de isotiocianato de fenol-guanidina para cima e para baixo várias vezes para fazer uma mistura homogênea. Colete cada ponto de tempo após o tempo apropriado, usando o método descrito anteriormente.

Incubar as amostras à temperatura ambiente durante cinco minutos para garantir a dissolução completa dos complexos proteicos de ARN. Em seguida, introduza transcritos controlados de pico que podem ser detectados com a metodologia usada. Introduzir estes controlos em cada amostra numa quantidade e concentração conhecidas.

Usando uma pipeta, transfira a mistura da solução de isotiocianato de fenilguanidina para um tubo de microcentrífuga de 2,0 mililitros. Em seguida, adicione 0,2 mililitros de clorofórmio à mistura de solução de isotiocianato de fenilguanidina para cada mililitro de solução de isotiocianato de fenilguanidina usada. Agitar vigorosamente o tubo de microcentrífuga durante 15 segundos e, em seguida, incubar o isotiocianato de fenilguanidina de clorofórmio.

Após a incubação, centrifugar as amostras a 12 000 vezes g durante 20 minutos a quatro graus Celsius. A amostra deve ser separada em três camadas. Transfira a camada aquosa para um novo tubo de microcentrífuga de 2,0 mililitros usando uma micropipeta e tome cuidado para não perturbar a interfase durante este processo.

Descarte as frações interfásicas e orgânicas. Em seguida, adicione um volume igual de 2-propanol à fração aquosa e inverta o tubo 10 vezes. Adicione até um microlitro de 20 miligramas por mililitro de glicogênio aquoso por 20 microlitros de amostra, especialmente se o rendimento for baixo.

Incubar as amostras à temperatura ambiente durante 10 minutos. Após a incubação, gire as amostras. Certifique-se de que, no final da centrifugação, o RNA precipitou para formar uma pelota de tempo no fundo do tubo.

Com uma pipeta, remova e descarte o sobrenadante, tomando cuidado especial para não perturbar o pellet de RNA branco. Adicione um mililitro de etanol a 75% por um mililitro de reagente de solução de isotiocianato de fenilguanidina para lavar o pellet. Centrifugar as amostras a 12 000 vezes g durante 10 minutos.

Depois de remover a maior parte do sobrenadante, use uma pipeta para remover o máximo de etanol possível, mas não perturbe o pellet. Gira as amostras para pellet todo o excesso de etanol. O pellet de RNA é menos compacto nesta etapa e tende a se mover.

Após a centrifugação, remova todo o excesso de etanol do tubo sem mexer no pellet. Deixe o pellet de RNA secar ao ar por cinco minutos. Adicione 50 microlitros de água livre de nuclease ao pellet de RNA e ressuspenda o pellet em água livre de nuclease.

Trate as amostras de um microlitro de Deanase para remover o DNA e, em seguida, inative a Deanase e os cátions. Armazene as amostras de RNA em tubos de microcentrífuga de 2,0 mililitros a menos 80 graus Celsius. Quantificar o RNA e verificar a pureza do RNA usando um espectrofotômetro.

Depois de verificar a pureza, analise o RNA com um gel de agarose a 1% para visualizar a extensão da degradação. Duas bandas claras representando 18S e 28S rRNA devem ser claramente visíveis. Se essas bandas não forem visíveis, o RNA pode ser degradado.

Em seguida, monitore a abundância de transcritos nas alíquotas de coleta de RNA em comparação com o padrão interno enriquecido usando qPCR em tempo real. Microarrays, sequenciamento de RNA ou northern blots também podem ser usados. As intensidades de fluorescência ao longo do tempo correspondem à expressão gênica.

Enquanto os fibroblastos se tornam inibidos pelo contato, o colágeno 3A1 que codifica o transcrito, um gene muito importante para a criação da matriz extracelular depositada durante a cicatrização de feridas, torna-se mais estável e não se decompõe tão rapidamente. Não se esqueça de que trabalhar com fenol pode ser extremamente perigoso e é importante não deixá-lo tocar sua pele. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como monitorar as taxas de decaimento de transcritos em fibroblastos proliferativos e quiescentes.

Mudanças na taxa de decaimento do transcrito podem ser um mecanismo importante de triangulação gênica.