Name: Determinação das taxas de decaimento transcrição de todo o genoma em quiescentes e proliferação de fibroblastos humanos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Aprenda a monitorar taxas de decaimento de transcritos em fibroblastos humanos proliferativos e quiescentes. Este método diferencia decaimento de abundância, revelando mecanismos de regulação gênica em biologia molecular.

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HAC foi o estudioso Milton E. Cassel da Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Este trabalho foi financiado por subsídios para HAC, do Instituto Nacional de ciências médicas de geral centro da concessão excelência GM071508 P50 (P.I. David Botstein), PhRMA Foundation grant 2007RSGl9572, nacional Science Foundation Grant OCI-1047879 agosto de David, Instituto Nacional de General Medical Sciences R01 GM081686, Instituto Nacional de ciências médicas gerais R01 GM0866465, o Eli &#38; Edythe Broad centro de medicina regenerativa &#38; investigação em células estaminais, centro de saúde/UCLA CTSI NIH das mulheres Iris Cantor Grant UL1TR000124 e a leucemia linfoma sociedade. Pesquisa reportada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de câncer do institutos nacionais da saúde sob prêmio número P50CA092131. Os financiadores não tinham qualquer papel no projeto de estudo, coleta de dados e análise, a decisão de publicar ou preparação do manuscrito. HAC é um membro do Eli &#38; Edythe amplo centro de medicina regenerativa &#38; investigação em células estaminais, o Instituto de Biologia Molecular de UCLA e o programa interdepartamental de bioinformática da UCLA.

Todos os experimentos descritos foram aprovados pelos conselhos de avaliação institucional na Universidade de Princeton e a Universidade da Califórnia, em Los Angeles.
1. prepare fibroblastos proliferando e inibida pelo contato para curso de tempo ActD
Nota: Este protocolo utiliza uma timecourse com quatro momentos. Três amostras biologicamente independentes podem ser coletadas por commit através da recolha de placas de cultura de tecidos diferentes em um experimento, ou o experimento pode ser repetido várias vezes com diferentes culturas de células. Em nossa experiência, um prato de cultura de tecido de 10 cm (diâmetro) (uma placa) fornece RNA suficiente para análise. Se necessário, vários pratos de cultura de tecido podem ser agrupados para cada amostra a aumentar o número de células em cada commit. Além disso, o mesmo experimento pode ser executado com fibroblastos isolados de diferentes indivíduos como Replica biológico verdadeiramente independente.
<ol>
	<li>Estabelece culturas quiescentes e proliferação de células para a análise de decomposição de transcrição. Para pilhas proliferating, separam as células a cada três dias enquanto as células inibidora de contato estão se tornando inibida pelo contato.
	<ol>
		<li>Para as células de contato-inibida, mude o meio de cada 2 dias durante 7 dias. Dividi as pilhas proliferating 2 dias antes dos fibroblastos inibida pelo contato estão prontos para a coleção. Um exemplo de um esquema de cultura de células é mostrado na Figura 1. As etapas restantes nesta seção fornecem um protocolo detalhado para estabelecer e divisão das células.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Isole os fibroblastos dérmicos primários da pele neonatal de acordo com protocolos estabelecidos13. Fibroblastos de passagem para garantir uma população homogênea. Nota: Fibroblastos podem ser congelados e descongelados, se necessário.</li>
	<li>Descongele ou replate fibroblastos, se necessário. Cresce fibroblastos em DMEM com 10% de soro sob condições estéreis em uma incubadora de cultura de tecidos em 37 ° C e 5% de CO2. Use os fibroblastos que foram produzidos para menos de 10 passagens. Fibroblastos devem ser &#60; confluente de 80% no dia de dividir células tornar as populações proliferando e quiescentes.</li>
	<li>Para dividir um prato de cultura de tecido em várias placas, escaldar PBS, tripsina e meio com o soro em um banho de água de 37 ° C por 20 min.</li>
	<li>Aspirar ou usar uma pipeta para remover o meio de cada placa de cultura de tecidos com células para ser replated.</li>
	<li>Pipeta quente PBS em cada prato (10 mL da solução para uma placa de 150 mm, 5 mL de solução para uma placa de 100 mm, 2 mL para um poço de 6 placa bem) e 1 mL para um poço de um prato bem 12.</li>
	<li>Aspirado ou pipeta para remover PBS de cada placa de cultura de tecido.</li>
	<li>Delicadamente, Pipetar 1 x Trypsin-EDTA em cada prato (8 mL de solução para uma placa de 150 mm, 3 mL de solução para uma placa de 100 mm, 2 mL para um poço de um prato bem 6 e 1 mL para um poço de um prato bem 12). Nota: Fazer 1 x Trypsin-EDTA diluindo estéril 10 x Trypsin-EDTA em PBS estéril. A solução final 1 x deve ser EDTA de tripsina e 0,02% 0,05%.</li>
	<li>Incube a tripsina com células por 5 min.</li>
	<li>Bata levemente a placa para desalojar as células da placa.</li>
	<li>Pipetar para Ressuspender as células em suspensão uma única célula.</li>
	<li>Células em solução de tripsina de transferir para um tubo cônico, contendo o mesmo volume de DMEM com 10% de soro (8 mL de solução para uma placa de 150 mm, 3 mL de solução para uma placa de 100 mm, 2 mL para um poço de um prato bem 6 e 1 mL para um poço de um 12 bem da placa).</li>
	<li>Spin para baixo as células a 4 ° C por 5 minutos a 1.000 x g para remover a tripsina.</li>
	<li>Ressuspender as células em um volume adequado do meio e contagem com um hemacytometer para determinar a concentração de células.</li>
	<li>Sementes de 5 x 105 células por placa de cultura de tecidos de 100 mm para se proliferando e células inibida pelo contato.</li>
	<li>Usando esse método, estabelece as amostras de proliferação e inibida pelo contato exigidas para análise (Figura 1).</li>
</ol>
2. ActD tempo curso
<ol>
	<li>Resuspenda ActD na concentração das ações de 1 mg/mL (para 1 mg de fatura, uso, 950 µ l de PBS estéril e 50 µ l de DMSO estéril). Nota: Soluções estoque congeladas da fatura devem ser estáveis por um mês a-20 ° C. Soluções diluídas devem ser descartadas e não armazenadas de continuar a utilizar.</li>
	<li>Adicionar ActD ao volume apropriado de escaldadas médio para toda a cultura biológica célula replicar as placas que foram definidas para 0, 120, 240 e 480 min momentos (Figura 2). Adicione ActD na concentração de 15 µ g / mL de meio. Misture bem, Aspire fora o antigo médio e adicionar ActD contendo meio para as células.
	<ol>
		<li>Para um estoque de 1 mg/mL, adicionar 15 µ l fatura para cada mL do meio, por exemplo, para 10 mL de meio para uma placa de 100mm, adicione 150 µ l ActD.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Para coletar a amostra de commit zero, aspire suavemente o ActD médio e pipetar pré-aquecido PBS para as células. Pipetar 10 mL de solução para uma placa de 150 mm, 5 mL de solução para uma placa de 100 mm, 2 mL para um poço de um prato bem 6 e 1 mL para um poço de um prato bem 12.</li>
	<li>Aspire suavemente ou pipeta fora da PBS. Nota: Todas as etapas que envolvem o isolamento do RNA devem ser realizadas com água livre de RNase, livre de RNase microcentrifuga tubos e pipetas RNase-livre. Luvas devem ser usadas e alteradas com frequência ao trabalhar com o RNA.</li>
	<li>Adicione solução de isotiocianato de guanidina-fenol (1 mL/10-cm placa com 4 x 105 4 x 107 células) diretamente para a placa de cultura de tecidos. Nota: Solução de isotiocianato de guanidina-fenol é uma solução de monofásico que mantém a qualidade do RNA enquanto lise de células e separando proteínas, DNA e RNA. Cuidado: Isotiocianato de fenol e guanidina são corrosivos. Use proteção adequada.</li>
	<li>Pipetar o fenol-guanidina isotiocianato solução-célula a mistura acima e para baixo várias vezes para fazer uma mistura homogênea. Nota: A solução de isotiocianato de guanidina-fenol lisada pode ser armazenada a 4 ° C durante a noite ou a-20 ° C por até um ano.</li>
	<li>Recolha a cada ponto do tempo decorrido a quantidade adequada de tempo usando o método descrito em etapas 2.3-2.6.</li>
</ol>
3. isolamento do RNA Total da solução de isotiocianato de guanidina-fenol lisado
<ol>
	<li>Incube as amostras à temperatura ambiente por 5 min garantir a completa dissolução de complexos de RNA-proteína. Nota: Os passos do protocolo de solução de isotiocianato de guanidina-fenol podem ser executados à temperatura ambiente a menos que indicado o contrário.</li>
	<li>Introduza as transcrições de pico-no controle que podem ser detectadas com a metodologia utilizada.</li></ol>Introduza esses controles em cada amostra em uma quantidade conhecida e concentração. Nota: O externo RNA controle consórcio (ERCC) pico-no controle mistura14 foi desenvolvida especificamente como um pico no controle para RNA-Seq Ele também pode ser usado para os borrões do Norte ou em tempo real qPCR. Pico-no controles projetados especificamente para microarray tecnologias também estão disponíveis (ver Tabela de materiais).
	<li>Transfira a mistura de solução de isotiocianato de guanidina-fenol para um tubo de microcentrifugadora de 2,0 mL com uma pipeta. Adicionar 0,2 mL de clorofórmio à mistura de solução de fenol-guanidina isotiocianato para cada 1 mL de solução de isotiocianato de guanidina-fenol usada (por exemplo, adicionar 0,3 mL de clorofórmio para mistura de solução de isotiocianato de guanidina-fenol 1,5 mL).</li>
	<li>Agitar o tubo microcentrifuga vigorosamente por 15 s e então incubar a mistura de isotiocianato de guanidina-fenol-clorofórmio à temperatura ambiente por 3 min.</li>
	<li>Girar as amostras a 12.000 x g por 20 minutos a 4 ° C. Nota: Após a rodada inicial, a amostra deve separar em 3 camadas - uma camada orgânica vermelha na parte inferior, uma interfase branco/rosa no meio e uma camada aquosa clara na parte superior (Figura 3).</li>
	<li>Transferi a fase aquosa para um novo tubo de microcentrifuga 2,0 mL utilizando uma micropipeta. Nota: Tenha cuidado para não perturbar a intérfase durante este processo. É okey deixar algum da fração aquosa. É melhor deixar um pouco da fração aquosa do que para também incluir algumas das camadas da interfase, como incluindo a interfase camada poderia contaminar o RNA com DNA. A camada aquosa será aproximadamente metade do volume inicial, então cerca de 0,9 mL se a mistura de clorofórmio/solução de isotiocianato de guanidina-fenol foi de 1,8 mL.</li>
	<li>Descarte a interfase e frações orgânicas.</li>
	<li>Adicionar um volume igual de 2-propanol a fração aquosa e inverter o tubo 10 vezes. Adicione até 1 µ l de solução aquosa de 20 mg/mL de glicogênio por 20 µ l de amostra, especialmente se o rendimento é esperado para ser baixo, porque menos de 106 células foram coletadas. Nota: Isto irá resultar em uma pelota densa, sólida que é fácil de monitorar após as etapas de centrifugação que seguem.</li>
	<li>Incube as amostras à temperatura ambiente por 10 min.</li>
	<li>Girar as amostras a 12.000 x g por 20 minutos a 4 ° C. Garantir que, no fim deste spin, o RNA precipitou-se para formar um sedimento branco no fundo do tubo.</li>
	<li>Com uma pipeta, remover e descartar o sobrenadante tomar cuidado especial para não perturbar a pelota do RNA branca. Nota: A ponta da pipeta solto realizada na mão pode ser usada para remover o excesso etanol. Se a pelota do RNA é perturbada, mas não descartada, o investigador pode repetir a girar e remover o sobrenadante novamente. Evite descartando a pelota como isto exigirá o investigador para repetir todo o procedimento.</li>
	<li>Prepare uma solução de água de 75% de etanol e 25% livre de nuclease. Adicione 1 mL de etanol a 75% por 1 mL de reagente de solução de isotiocianato de guanidina-fenol para lavar o sedimento.</li>
	<li>Girar as amostras a 12.000 x g por 10 min a 4 ° C.</li>
	<li>Depois de retirar a maior parte do sobrenadante, use uma pipeta para remover tanto etanol quanto possível, enquanto ainda está tomando cuidado para não perturbar a pelota. Nota: A pelota do RNA é menos compacta neste passo e tende a subir. Cuidado ao manusear a pelota neste momento para evitar a perda do RNA.</li>
	<li>Gire as amostras 12.000 x g por 2 min à temperatura ambiente a pelota todo excesso de etanol.</li>
	<li>Retire todo excesso de etanol o tubo utilizando uma micropipeta, tendo o cuidado de não perturbar a pelota.</li>
	<li>Deixe o ar de pelota do RNA secar por 5 min.</li>
	<li>Adicionar 50 µ l de água livre de nuclease para a pelota do RNA e resuspenda o pellet em água livre de nuclease.</li>
	<li>Tratar as amostras com 1 µ l DNase (2 unidades / µ l) para remover o DNA e então inativar DNase e cátions (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Armazenar as amostras de RNA em tubos de microcentrifuga 2,0 mL a-80 ° C.</li>

4. análise da abundância de transcrição
<ol>
	<li>Verificar RNA pureza usando um espectrofotômetro e quantificar o RNA. Nota: A relação da absorvência em 260 nm a 280 nm deve ser aproximadamente 2.0 para o RNA.</li>
	<li>Analise RNA com um gel de agarose a 1% ou uma tecnologia equivalente para visualizar a extensão da degradação. Nota: Duas claras bandas representando 18S e rRNA 28S deve ser claramente visíveis (Figura 4). Se essas bandas não são visíveis, o RNA pode ser degradado. Dicas de tiro problemas para degradação do RNA são fornecidas na discussão.</li>
	<li>Abundância de transcrição monitor nas alíquotas recolhidas do RNA em comparação com o cravado no padrão interno usando microarrays15, RNA-Seq16, em tempo real qPCR17, ou norte borrões18.
	<ol>
		<li>Determine a abundância para cada transcrição em cada ponto de tempo em comparação com um controle cravado em abundância conhecida. Nota: Para microarrays, os valores serão as intensidades de fluorescência. Para os borrões do Norte, bandas do filme de raios-x podem ser quantificadas. Para qPCR em tempo real, a abundância de transcrição pode ser determinada por comparação com padrões conhecidos com o 2- σσCT método19. Para RNA-Seq, valores normalizados podem ser determinados como FPKM ou fragmentos por quilobase do exon por milhão leituras mapeado. Para taxas de decaimento isoforma específica, RNA-Seq dados podem ser analisados utilizando metodologias isoform reconhecem como DEXSeq20. Taxas de decaimento isoforma específica melhor são determinadas com RNA-Seq Se eles são determinadas com dados de microarray, os dados devem ser analisados em uma base de sonda-por-sonda ao invés de uma base de gene-gene-por. O analista deve ter cuidado ao interpretar a informação de um número limitado de sondas. Por exemplo, pode haver 5 ou menos sondas que são informativas sobre uma isoforma específica. Neste caso, o analista precisará determinar se o comportamento de tais sondas é suficientemente consistente para que os resultados são confiáveis.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Execute em tempo real qPCR na RNA isolado17 nas amostras coletadas para analisar genes rapidamente em decomposição, como c-Myc e um gene lentamente decadente como GAPDH, ganhar confiança essa decadência de transcrição taxas foram detectadas com precisão. Nota: Para confirmação, sondas isoform-específicos em tempo real qPCR podem ser desenvolvidas e usadas para monitorar a abundância de isoformas específicas ao longo do tempo21.</li>
</ol>
5.Determinação constante de decaimento taxa
<ol>
	<li>Para cada commit, log-transformar os valores de abundância para cada transcrição (gene-específico ou isoforma específicos). Nota: Log-transformando os valores irão converter as curvas de decaimento exponencial para linhas que podem ser cabidas com um decaimento linear modelo22.</li>
	<li>Se encaixa no perfil de expressão para cada transcrição (gene-específico ou isoforma específicos) para um modelo linear de decadência. A fórmula para esse modelo é f (t) = C - r * t. Nesta equação, C é uma constante que representa o montante inicial de uma transcrição, r é a taxa de declínio e t é o tempo desde o início do experimento. Desta equação, determinar a taxa de deterioração, como r*ln(10) (ver referência11). Nota: O pacote de software maSigPro é uma abordagem baseada em regressão, projetada para detectar diferenças de perfil de expressão de gene significativo no tempo curso dados23. Resultados para maSigPro e código de exemplo estão disponíveis em: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/maSigPro/inst/doc/maSigProUsersGuide.pdf.</li>
	<li>Filtre os genes que não conseguem encaixar um modelo log-linear de decadência. Isso pode ser feito com um teste F ANOVA. Nota: O teste F é baseado na estatística F, que é definida como a variação entre os meios de amostra divididos pela variação dentro de amostras. Corrigi os valores de p para comparações múltiplas aplicando o linear Step-up Benjamini e Hochberg falsa descoberta procedimento24. Um q-valor maior que 0,05 com o F-teste pode ser usado como um limite para os genes que não conseguem encaixar um modelo log-linear de decadência.</li>
	<li>Executar um teste F ANOVA para determinar as transcrições com um termo de interação significativa entre uma condição categórica de ciclo celular e o tempo (taxa falsa da descoberta, FDR &#60; 0,05).</li>
</ol>

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Os autores têm sem interesses concorrentes para divulgar.

Quiescência pode ser induzida por sinais externos, incluindo a retirada de mitógenos ou soro, falta de aderência de célula e inibição de contato. Inibição de contato, um dos vários métodos possíveis para indução de quiescência, é um processo altamente evolutivamente conservado em que células sair do ciclo celular proliferativo em resposta ao contato célula a célula. Aqui focamos na inibição de contato como um exemplo de um método para induzir quiescência. Estudos anteriores relataram que contato célula-célula pode afetar...

Níveis de estado estacionário de transcrições refletem a contribuição de decaimento de transcrição e síntese de transcrição. Regulamentada e coordenada transcrição decaimento é um importante mecanismo para controlar processos biológicos1,2,3,4. Por exemplo, taxas de decomposição de transcrição foram mostradas para contribuir para a série temporal de eventos após a ativação pela citoquina inflamatória fator de necrose tumoral5.
Mostramos anteriormente que a transição entre a proliferação e quiescência em fibroblastos humanos primários está associada a alterações dos níveis de transcrição de muitos genes6. Algumas destas mudanças refletem as diferenças na atividade de fatores de transcrição entre estes dois Estados.
Mudanças na taxa de decaimento de uma transcrição também podem contribuir para as alterações do nível de expressão de uma transcrição em dois Estados diferentes7,8. Baseado em nossos achados anteriores que a transição entre a proliferação e quiescência está associada a alterações nos níveis de vários microRNAs9, perguntamos se existe também uma contribuição do decaimento de transcrição diferencial nas alterações em expressão gênica em proliferando contra fibroblastos quiescentes.
A fim de monitorar a estabilidade de transcrição, determinamos a taxa de decaimento de transcrições todo o genoma em proliferando contra células quiescentes. Para conseguir isso, temos monitorado taxas de decaimento em proliferando contra fibroblastos quiescentes introduzindo um inibidor da nova transcrição e monitorar a taxa em que as transcrições individuais desapareceram ao longo do tempo. A vantagem dessa abordagem é que, em comparação com métodos que simplesmente monitorar geral expressão gênica, inibindo a síntese de transcrição novo, seremos capazes de determinar a taxa de decaimento para essas transcrições separadamente da taxa em que forem transcrito.
ActD tratamento para inibir a transcrição de nova e determinar taxas de decaimento de transcrição tem sido aplicado com sucesso em vários estudos anteriores. ActD tem sido usada para dissecar a importância da estabilidade de RNA nas mudanças na abundância de transcrição que resultam do tratamento com citocinas pró-inflamatórias5. Uma abordagem similar também tem sido utilizada para dissecar as diferenças na taxa de decaimento de transcrição em proliferando contra células diferenciadas de C2C12 como a adoptarem uma diferenciada músculo fenótipo10. Como outro exemplo, global mRNA meias-vidas também foram detectados em pluripotentes e tronco embrionárias diferenciadas do mouse células11. Nestes exemplos, decaimento do mRNA tem demonstrado ser importante para a regulação da abundância de transcrição e para a transição de células a célula diferentes Estados.
Aplicando os métodos descritos abaixo, descobrimos que mudanças nas taxas de decomposição de transcrição em aproximadamente 500 genes quando comparando os fibroblastos em proliferação e quiescente Estados12. Em particular, nós descobrimos que os destinos do microRNA miR-29, que é ativador nas células quiescentes, são estabilizados quando células de transição de quiescência. Aqui descrevemos a metodologia que usamos para determinar taxas de deterioração nas células proliferando e quiescentes. Esta metodologia é útil para comparar taxas de decaimento do mRNA global em duas distintas mas condições semelhantes quando é solicitada informação sobre decaindo rapidamente os genes. Ele também pode ser usado para abordar outras questões tais como o efeito das condições de cultura celular na decadência de transcrição, por exemplo, em duas dimensões contra três culturas dimensionais. Taxas de decomposição podem ser determinado genoma-largo com métodos como microarrays ou RNA-Seq. Alternativamente, em tempo real qPCR ou mancha do Norte pode ser usada para determinar as taxas de decomposição de forma gene-por-gene ou isoform-por-isoforma. Estas taxas podem ser usadas para calcular a meia-vida de cada gene monitorado e identificar genes com taxas de decomposição que são diferentes em duas condições.

<table><tbody><tr><td>Centrífugas para tubos de microcentrífuga capazes de atingir 12.000 x g e 4&deg; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipamento para a execução de géis de</td><td></td><td></td><td></td>agarose</tr><tr><td>Placas de cultura de tecidos estéreis e tubos cónicos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>VWR</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas estéreis, pipetadores e pontas de pipetas para cultura de tecidos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas descartáveis sem Rnase, pontas de pipeta e tubos embalados individualmente para isolamento e análise</td><td></td><td></td><td></td>de RNA</tr><tr><td>Luvas descartáveis a serem usadas ao manusear reagentes e amostras</td><td></td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>RNA RNaseZap</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td>Para descontaminação de superfícies de trabalho de</td></tr><tr>tubos <td></td><td></td><td></td>eppendorf RNase<td>2,0 ml</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA&nbsp; Solução 10X</td><td>Millipore Sigma</td><td>9002-07-07</td><td></td></tr><tr><td>Estéril PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Actinomicina D</td><td>Millipore Sigma</td><td>A1410-2 mg</td><td>inibe a transcrição</td></tr><tr><td>Estéril DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>31-761-00ML</td><td>solvente para actinomicina D</td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ICN19400225</td><td>MP Biomedicals, Inc produto</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2618500</td><td>grau de biologia molecular</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP28184</td><td>grau de biologia molecular</td></tr><tr><td>Glicogênio livre de RNase (solução aquosa de 20 mg/ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0551</td><td>transportador para precipitação de RNA</td></tr><tr><td>Kit TURBO sem DNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1907</td><td>remove DNA com DNase, então, em uma etapa subsequente,&nbsp; inativa o DNA e remove cátions divalentes</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ICN820721</td><td>MP Biomedicals, Inc produto</td></tr><tr><td>Corante de carregamento para gel de RNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0641</td><td>adequado até mesmo para desnaturar</td></tr><tr><td>marcadores</td> <td>de eletroforese Millenium RNAThermo Fisher Scientific</td><td>AM7150</td><td>RNA ladder</td></tr><tr><td>One-color RNA Spike-in Kit</td><td>Agilent Technology</td><td>5188-5282</td><td>Exemplo de controle de pico para análise de microarray Agient</td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>grau de biologia molecular, para tampão TAE</td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-500</td><td>para tampão TAE</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Grau de</td> eletroforese Scientific <td>BP120-500</td><td>, para géis</td></tr><tr><td>Brometo de etídio</td><td>Millipore Sigma</td><td>E7637</td><td>para biologia molecular</td></tr><tr><td>Controles externos de RNA Consórcio RNA Spike-in Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4456740</td><td>Controle de pico para RNA Seq</td></tr><tr><td>TruSeq Kit de preparação da biblioteca de mRNA encalhado A (48 amostras, 12 índices)</td> <td>Illumina</td><td>RS-122-2101</td><td>para RNA Seq</td></tr><tr><td>Placa PCR de 96 poços de 0,3 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-0600</td><td>para qPCR em tempo real</td></tr><tr><td>Selos adesivos Microseal B</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001</td><td>para qPCR em tempo real</td></tr><tr><td>Reservatórios de reagentes sem Rnase/Dnase</td><td>VWR</td><td>89094-662</td><td>para qPCR em tempo real</td></tr><tr><td>Sem Rnase/Dnase Oito tiras e tampas de tubos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM12230</td><td>para qPCR</td></tr> <tr><td>em tempo realSuperScript Transcriptase Reversa</td><td>Invitrogen</td><td>18090010</td><td>para qPCR em tempo real</td></tr><tr><td>AMPure XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>para qPCR em tempo real</td></tr></tbody></table>

determinação das taxas de decaimento transcrição de todo o genoma em quiescentes e proliferação de fibroblastos humanos

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Quiescência é um estado temporário, reversível, em que células cessaram a divisão celular, mas mantém a capacidade de proliferar. Vários estudos, incluindo a nossa, têm demonstrado que a quiescência está associada a generalizada alterações na expressão gênica. Algumas destas mudanças ocorrem através de alterações no nível ou atividade associada a proliferação de factores de transcrição, tais como E2F e MYC. Nós demonstramos que o decaimento do mRNA também pode contribuir para alterações na expressão gênica entre células proliferando e quiescentes. Neste protocolo, descrevemos o procedimento para estabelecer culturas quiescentes e proliferação de fibroblastos humanos prepúcio dérmica. Em seguida, descrevemos os procedimentos para inibir nova transcrição em células proliferando e quiescentes com actinomicina D (ActD). ActD tratamento representa uma abordagem simples e reprodutível para desassociar nova transcrição do decaimento de transcrição. Uma desvantagem da fatura de tratamento é que o curso de tempo deve ser limitado a um curto espaço de tempo porque ActD afeta a viabilidade celular. Níveis de transcrição são monitorados ao longo do tempo para determinar as taxas de decomposição de transcrição. Este procedimento permite a identificação de genes e isoformas que apresentam deterioração diferencial em proliferando contra fibroblastos quiescentes.

Nós já relatado os resultados das análises de microarray de taxas de decaimento de transcrição em proliferação e inibida por contato primários fibroblastos humanos ao longo de um curso de 8 horas12. É fornecida uma lista de genes com uma mudança significativa na estabilidade de transcrição comparando fibroblastos proliferando e inibida pelo contato em complementar a tabela 1. As intensidades de fluorescência no tempo zero e um longo tempo após o tr...

Descreveremos um protocolo para gerar proliferando e quiescentes fibroblastos dérmicos humanos primários, taxas de decomposição de transcrição de monitoramento e identificação de genes diferencialmente em decomposição.

Determinação das taxas de decaimento transcrição de todo o genoma em quiescentes e proliferação de fibroblastos humanos

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

O objetivo geral deste procedimento é monitorar as taxas de decaimento do transcrito em fibroblastos proliferativos e quiescentes. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia molecular, como se as mudanças na expressão gênica resultam de mudanças na taxa de decaimento do transcrito. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece informações sobre a taxa de decaimento do transcrito, não apenas a abundância do transcrito.Para iniciar o protocolo, estabeleça culturas proliferativas e quiescentes de fibroblastos. Os fibroblastos em proliferação devem ser tripsinizados regularmente. As culturas quiescentes podem ser estabelecidas permitindo que as placas atinjam a confluência com mudanças regulares do meio.Adicione ActD 150 microlitros ao meio pré-aquecido de 10 mililitros para todas as placas de cultura de células biológicas replicadas. Adicione ActD a uma concentração de 15 microgramas por mililitro de meio. Misture bem a solução.Aspire o meio antigo e adicione meio contendo ActD às células. Para coletar a amostra de ponto de tempo zero, aspire suavemente o meio ActD e pipete entre cinco e 10 mililitros de PBS pré-aquecido em uma placa de 100 milímetros, cinco mililitros de solução para uma placa de 100 milímetros, dois mililitros para um poço de uma placa de seis poços e um mililitro para um poço de uma placa de 12 poços. Aspire suavemente o PBS.Em seguida, adicione a solução de isotiocianato de fenol-guanidina diretamente na placa de cultura de tecidos. Pipete a mistura de células da solução de isotiocianato de fenol-guanidina para cima e para baixo várias vezes para fazer uma mistura homogênea. Colete cada ponto de tempo após o tempo apropriado, usando o método descrito anteriormente.Incubar as amostras à temperatura ambiente durante cinco minutos para garantir a dissolução completa dos complexos proteicos de ARN. Em seguida, introduza transcritos controlados de pico que podem ser detectados com a metodologia usada. Introduzir estes controlos em cada amostra numa quantidade e concentração conhecidas.Usando uma pipeta, transfira a mistura da solução de isotiocianato de fenilguanidina para um tubo de microcentrífuga de 2,0 mililitros. Em seguida, adicione 0,2 mililitros de clorofórmio à mistura de solução de isotiocianato de fenilguanidina para cada mililitro de solução de isotiocianato de fenilguanidina usada. Agitar vigorosamente o tubo de microcentrífuga durante 15 segundos e, em seguida, incubar o isotiocianato de fenilguanidina de clorofórmio.Após a incubação, centrifugar as amostras a 12 000 vezes g durante 20 minutos a quatro graus Celsius. A amostra deve ser separada em três camadas. Transfira a camada aquosa para um novo tubo de microcentrífuga de 2,0 mililitros usando uma micropipeta e tome cuidado para não perturbar a interfase durante este processo.Descarte as frações interfásicas e orgânicas. Em seguida, adicione um volume igual de 2-propanol à fração aquosa e inverta o tubo 10 vezes. Adicione até um microlitro de 20 miligramas por mililitro de glicogênio aquoso por 20 microlitros de amostra, especialmente se o rendimento for baixo.Incubar as amostras à temperatura ambiente durante 10 minutos. Após a incubação, gire as amostras. Certifique-se de que, no final da centrifugação, o RNA precipitou para formar uma pelota de tempo no fundo do tubo.Com uma pipeta, remova e descarte o sobrenadante, tomando cuidado especial para não perturbar o pellet de RNA branco. Adicione um mililitro de etanol a 75% por um mililitro de reagente de solução de isotiocianato de fenilguanidina para lavar o pellet. Centrifugar as amostras a 12 000 vezes g durante 10 minutos.Depois de remover a maior parte do sobrenadante, use uma pipeta para remover o máximo de etanol possível, mas não perturbe o pellet. Gira as amostras para pellet todo o excesso de etanol. O pellet de RNA é menos compacto nesta etapa e tende a se mover.Após a centrifugação, remova todo o excesso de etanol do tubo sem mexer no pellet. Deixe o pellet de RNA secar ao ar por cinco minutos. Adicione 50 microlitros de água livre de nuclease ao pellet de RNA e ressuspenda o pellet em água livre de nuclease.Trate as amostras de um microlitro de Deanase para remover o DNA e, em seguida, inative a Deanase e os cátions. Armazene as amostras de RNA em tubos de microcentrífuga de 2,0 mililitros a menos 80 graus Celsius. Quantificar o RNA e verificar a pureza do RNA usando um espectrofotômetro.Depois de verificar a pureza, analise o RNA com um gel de agarose a 1% para visualizar a extensão da degradação. Duas bandas claras representando 18S e 28S rRNA devem ser claramente visíveis. Se essas bandas não forem visíveis, o RNA pode ser degradado.Em seguida, monitore a abundância de transcritos nas alíquotas de coleta de RNA em comparação com o padrão interno enriquecido usando qPCR em tempo real. Microarrays, sequenciamento de RNA ou northern blots também podem ser usados. As intensidades de fluorescência ao longo do tempo correspondem à expressão gênica.Enquanto os fibroblastos se tornam inibidos pelo contato, o colágeno 3A1 que codifica o transcrito, um gene muito importante para a criação da matriz extracelular depositada durante a cicatrização de feridas, torna-se mais estável e não se decompõe tão rapidamente. Não se esqueça de que trabalhar com fenol pode ser extremamente perigoso e é importante não deixá-lo tocar sua pele. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como monitorar as taxas de decaimento de transcritos em fibroblastos proliferativos e quiescentes.Mudanças na taxa de decaimento do transcrito podem ser um mecanismo importante de triangulação gênica.

determining-genome-wide-transcript-decay-rates-proliferating

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Descrevemos os métodos fotobranqueamento inclusive Recuperação de Fluorescência Após Fotodegradação (FRAP) e perda de fluorescência em Fotodegradação (FLIP) para monitorar a dinâmica de proteínas da cromatina no tronco embrionárias (ES) células. Proteínas da cromatina dinâmica, que é considerado um dos meios para estudar a plasticidade da cromatina, é reforçada em células pluripotentes.

Fotobranqueamento Ensaios (FRAP &amp; FLIP) a Medida Dynamics Protein Chromatin em Viver Células-Tronco Embrionárias

Cinética de RNA polimerase II transcricional são medidos em genes específicos em células vivas. mRNAs transcritos do gene de interesse são fluorescente etiquetado e usando a Recuperação de Fluorescência Após Fotodegradação (FRAP) o vivo na cinética de alongamento transcricional são obtidos.

Medição da Cinética de Transcrição mRNA em células Living Single

RNA celular total fornece um modelo pobre para estudar mudanças de curto prazo na síntese de RNA e decadência, bem como a cinética de processamento de RNA. Aqui, descrevemos a marcação metabólica de RNA recentemente transcrito com 4-tiouridina seguido por biotinilação específica do tiol e a purificação do ARN recém transcritos que permitam ultrapassar estas limitações.

Marcação metabólica de RNA recém-transcrita para alta resolução Gene Expression Profiling de síntese de RNA, Processamento e Decay em cultura de células

O nível de estado estacionário de ARNm específicos é determinada pela velocidade de síntese e decaimento do ARNm. Taxas de degradação de mRNA genome-wide ou as taxas de decaimento de mRNAs específicos pode ser medido através da determinação de ARNm de semi-vida. Este protocolo centra-se na medição das taxas de decaimento de mRNA em Saccharomyces cerevisiae.

Medição do mRNA Decay Preços em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Usando<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Cepas

Este protocolo descreve um método para determinar a proteína meia-vida em vida única células aderentes, usando pulso rotulagem e imagem latente de lapso de tempo de fluorescência de proteínas da fusão SNAP-marca.

Célula única quantificação das taxas de degradação de proteínas por microscopia de fluorescência de lapso de tempo em cultura de células aderentes

Desenvolvimento neurológico processos tais como consequência natural do axônio, migração e proliferação são frequentemente perturbadas em doenças neuropsiquiátricas. Assim, apresentamos protocolos para rapidamente e reproducibly avaliar estes processos de desenvolvimento neurológico em NPCs de iPSC-derivado humanos. Estes protocolos permitem também a avaliação dos efeitos da terapêutica e fatores de crescimento relevantes no desenvolvimento do NPC.

Detecção rápida de desenvolvimento neurológico fenótipos nas células precursoras neurais humanas (NPCs)

Este protocolo descreve a utilização combinatória de ChIP-seq, seq-4sU, RNA total-seq e Ribossoma profiling para linhas de células e as células primárias. Permite rastreamento de alterações em fator de transcrição vinculativas, novo de transcrição, processamento de RNA, volume de negócios e tradução ao longo do tempo e exibindo o curso geral dos acontecimentos nas células ativadas e/ou rápida mudança.

Análise em tempo real do fator de transcrição, ligação, transcrição, tradução e volume de negócios para exibir eventos globais durante a ativação celular

Aqui, apresentamos uma ferramenta que pode ser usada para estudar a modulação pós-transcricional de uma transcrição em células epiteliais alveolares primárias usando um sistema de expressão indutível acoplado a uma técnica de eletroporação de pipeta.

Sistema de expressão plasmídeamente controlado transcricionalmente para investigação da estabilidade das transcrições de mRNA em células epiteliais alveolares primárias

Este protocolo descreve o fluxo de trabalho para rotulagem metabólica de células senescentes e não-divisórias com SILAC pulsado, análise de espectrometria de massa não-alvo, e um cálculo simplificado de meias-vidas proteicas.

Medição das Taxas de Rotatividade de Proteínas em Células Cultivadas Senescentes e Não-Divisórias com Rotulagem Metabólica e Espectrometria de Massa

Este protocolo mede quantitativamente a estabilidade e a meia-vida de RNAs potenciadores intergênicos e intragênicos em células-tronco embrionárias de camundongo, utilizando tratamento com Actinomicina D, RT-qPCR e análise de regressão não linear. Estratégias de normalização específicas de posição são incorporadas para modelar com precisão a dinâmica do decaimento do eRNA de forma dependente do contexto.

Avaliação Quantitativa Otimizada da Estabilidade do RNA Potenciador em Células-Tronco Embrionárias de Camundongos

Este artigo apresenta um protocolo LysoTracker de células vivas para medir a remodelação lisossômica durante a senescência em fibroblastos humanos IMR-90.

Perfil Lisossômico com LysoTracker para avaliação quantitativa da senescência celular em fibroblastos humanos

Aprenda a monitorar taxas de decaimento de transcritos em fibroblastos humanos proliferativos e quiescentes. Este método diferencia decaimento de abundância, revelando mecanismos de regulação gênica em biologia molecular.

Determinação das taxas de decaimento transcrição de todo o genoma em quiescentes e proliferação de fibroblastos humanos

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