Medir o efeito de produtos químicos sobre o crescimento e a reprodução de Caenorhabditis elegans
October 5th, 2017
Um protocolo básico para avaliar a toxicidade de produtos químicos em um animal modelo, Caenorhabditis elegans, é descrito. O método é conveniente e útil para o desenvolvimento de produtos farmacêuticos, bem como para a avaliação de risco de diversos poluentes ambientais.
O objetivo geral deste procedimento é medir o efeito de produtos químicos, como o inibidor da topoisomerase etoposídeo, no crescimento e reprodução do animal modelo Caenorhabditis elegans. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da toxicologia, como avaliação toxicológica para o desenvolvimento de medicamentos e avaliação de risco de tóxicos ambientais. A principal vantagem dessa técnica é que a toxicidade de vários produtos químicos pode ser verificada em sistemas não mamíferos, portanto, essa técnica é conveniente e econômica.
Demonstrando o procedimento estará So Young Lee, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Para começar, prepare duas garrafas de vidro limpas de 200 mililitros adicionando 0,6 gramas de cloreto de sódio, 0,5 gramas de peptona, 3,4 gramas de ágar, 195 mililitros de água destilada e um agitador magnético a uma garrafa. Em seguida, adicione um agitador magnético à outra garrafa vazia.
Autoclave as garrafas por 15 minutos a 121 graus Celsius e, em seguida, resfrie as garrafas em banho-maria por 30 minutos a 55 graus Celsius. Em seguida, ao frasco cheio, adicione 0,2 mililitros de cloreto de cálcio molar, 0,2 mililitros de cinco miligramas por mililitro de colesterol, 0,2 mililitros de sulfato de magnésio molar e cinco mililitros de fosfato de potássio molar. Em seguida, misture a solução por agitação magnética em uma placa quente a 55 graus Celsius.
Despeje metade do meio NGM misturado na garrafa vazia de 200 mililitros. Em seguida, adicione um mililitro de DMSO a uma garrafa e use agitação magnética para misturá-lo novamente. Guarde a outra garrafa em banho-maria a 55 graus Celsius.
Em seguida, alíquota de três mililitros do meio contendo DMSO para placas de Petri de 35 por 10 milímetros. Retire a outra garrafa do banho-maria e use agitação magnética para misturá-la. Em seguida, adicione um mililitro de etoposídeo 75 milimolar.
E depois de misturar novamente, repita o procedimento de alíquota. Resfrie as placas NGM contendo produtos químicos, deixando-as em temperatura ambiente por aproximadamente três horas e armazene-as a quatro graus Celsius até o uso. Para o teste químico, espalhe 100 microlitros de E.coli OP50 inativada pelo calor em cada placa NGM.
Deixe as placas secarem durante a noite em uma incubadora C.elegans a 20 graus Celsius. Transfira os ovos de C.elegans sincronizados com a idade para uma placa NGM suplementada com 1% de DMSO ou etoposídeo 750 micromolar. Coloque os C.elegans em uma incubadora a 20 graus Celsius por quatro dias.
Observe e tire imagens microscópicas de C. elegans sob microscópio estéreo todos os dias. Além disso, tire uma imagem microscópica do micrômetro do estágio do microscópio para calibração do tamanho do verme. Para medir o comprimento do corpo de C. elegans tratados com DMSO ou etoposídeo em cada ponto de tempo, no ImageJ, abra a imagem do micrômetro do estágio do microscópio.
Em seguida, usando a ferramenta Linha reta, arraste uma linha de 1.000 micrômetros na imagem. Clique em Analisar e, em seguida, em Definir escala e insira 1.000 e micrômetros na caixa Distância conhecida e na caixa Unidade de comprimento, respectivamente. Em seguida, marque Global e clique em OK. Abra as imagens do worm usando Arquivo e, em seguida, Abrir.
Em seguida, usando a ferramenta Linha à mão livre, desenhe uma linha ao longo do recurso de cada verme. Obtenha os dados de comprimento do corpo clicando em Analisar e, em seguida, em Medir. Repita essas etapas para 50 minhocas.
Incubar os ovos sincronizados com a idade na placa NGM contendo DMSO ou etoposídeo a 20 graus Celsius por 64 horas até o estágio adulto jovem. Transferir cinco vermes adultos para novas placas NGM sem produtos químicos ou novas placas NGM contendo o mesmo pré-tratamento químico e incubá-las durante 24 horas. Transfira os adultos para novas placas NGM, como acabamos de demonstrar, e conte o número de ovos todos os dias.
Além disso, conte os vermes que rastejaram, morreram ou eclodiram internamente. Realize cálculos de acordo com o protocolo de texto. Como mostrado aqui, o tratamento com etoposídeo em 24 a 96 horas retardou significativamente o crescimento de C. elegans.
Após 96 horas de incubação, os vermes tratados com etoposídeo cresceram para 0,86 milímetros de comprimento corporal, enquanto os vermes tratados com veículo cresceram para 1,04 milímetros. O retardo de crescimento também foi observado sob observação estereoscópica, como visto nessas imagens de vermes tratados com etoposídeo, em comparação com vermes tratados com controle. Após 72 horas de incubação, foram observados ovos dos vermes tratados com veículo.
Em contraste, os ovos foram observados após 96 horas de tratamento com etoposídeo, levantando a possibilidade de que o tratamento com etoposídeo tenha atrasado o primeiro nascimento de C. Elegans. Conforme ilustrado nesses gráficos, uma diminuição no número total de ovos pelo tratamento com etoposídeo foi observada quando os vermes adultos jovens foram cultivados, na presença ou ausência de tratamento contínuo com etoposídeo. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em uma semana se for executada corretamente.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como avaliar a toxicidade química em C.elegans, um nematóide modelo.
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Visão Geral
Este artigo descreve um protocolo para avaliar a toxicidade de produtos químicos usando o organismo modelo Caenorhabditis elegans. O método é particularmente útil para desenvolvimento farmacêutico e avaliação de riscos ambientais.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Toxicologia
- Desenvolvimento Farmacêutico
- Ciência Ambiental
Fundo
- Caenorhabditis elegans é um organismo modelo não-mamífero.
- O protocolo avalia o impacto de vários produtos químicos no crescimento e reprodução.
- Fornece um método econômico para testes de toxicidade.
- A técnica pode avaliar tanto produtos farmacêuticos quanto poluentes ambientais.
Objetivo do Estudo
- Medir os efeitos de produtos químicos como o etoposídeo em C. elegans.
- Facilitar avaliações toxicológicas para o desenvolvimento de medicamentos.
- Avaliar os riscos apresentados por tóxicos ambientais.
Métodos Usados
- Preparação do meio de crescimento com cloreto de sódio, peptona, ágar e água destilada.
- Uso de frascos de vidro para cultivo dos organismos.
- Avaliação de métricas de crescimento e reprodução.
- Avaliação da toxicidade química em um ambiente controlado.
Principais Resultados
- O protocolo permite a avaliação sistemática da toxicidade química.
- Demonstra a viabilidade de usar C. elegans para estudos toxicológicos.
- Fornece insights sobre os efeitos de produtos químicos específicos em sistemas biológicos.
- Destaca as vantagens dos sistemas de teste não-mamíferos.
Conclusões
- O método descrito é eficaz para avaliar a toxicidade química.
- Suporta tanto o desenvolvimento de medicamentos quanto avaliações de riscos ambientais.
- Utilizar C. elegans oferece uma abordagem conveniente e econômica.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This protocol enables early-stage toxicological evaluation using a non-mammalian model, supporting drug development and environmental risk assessment with reduced ethical and cost burdens. By measuring growth and reproduction endpoints in C. elegans, it provides quantitative data for mechanistic de-risking of chemical candidates. The approach aids in prioritizing compounds with favorable safety profiles before mammalian testing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of chemical effects on fundamental biological processes like growth and reproduction.
- Operational Value: Offers a scalable, ethically favorable system for initial toxicity screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates reproducible, quantitative phenotypic data on growth retardation and fecundity changes.
- Operational Value: Standardized protocol supports assay reproducibility across laboratories and timepoints.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates assessment of reversible versus irreversible reproductive toxicity, informing risk characterization.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to preclinical evaluation using consistent phenotypic readouts.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within discovery biology to inform lead identification by providing early toxicity signals that guide compound progression.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing regarding chemical impact on developmental and reproductive pathways.
- Screening: Delivers standardized, quantifiable outputs for compound comparison and hit validation.
- Analytics: Provides measurable endpoints such as body length and egg count for dose-response analysis.
- Translational Research: Connects early phenotypic effects to later-stage risk assessment through reversible/irreversible toxicity determination.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable toxicology platform applicable across therapeutic areas and chemical classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by linking chemical exposure to functional phenotypes.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized culture, exposure, and imaging procedures.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by identifying toxic liabilities early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on reversible or irreversible reproductive effects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nematode culture, synchronization, and microscopic phenotyping.
- Dependent on access to stereo microscopes, incubators, and image analysis tools like ImageJ.
- Necessitates standardization of chemical preparation, exposure duration, and environmental controls.
- Adaptation considerations include chemical solubility, stability in medium, and species-specific sensitivity.
- Practical limitations include throughput constraints for large-scale screening and reliance on manual counting for fecundity.
