4.5: O Ensaio de Migração Transwell

O ensaio de migração transwell é uma técnica clássica que permite aos cientistas quantificar o movimento celular. A migração refere-se à capacidade de uma célula de se mover individualmente ou em grupos. Os movimentos celulares são possíveis por meio da reestruturação precisa de seu citoesqueleto e a migração geralmente ocorre em resposta a estímulos que atuam como pistas.

Hoje, discutiremos o ensaio de migração transwell, que utiliza uma configuração de câmara simples para avaliar a migração em resposta a pistas de atração.

Começaremos fornecendo algumas informações básicas sobre a câmara transwell.

O aparelho foi projetado pela primeira vez pelo Dr. Stephen Boyden em 1961, que o usou para estudar a migração de leucócitos. Portanto, esse método também é conhecido como ensaio de câmara de Boyden.

Em uma câmara de Boyden simples, a parede externa é dos poços, como as de uma placa de 96 poços. Dentro de cada poço, um transpoço, que é uma inserção cilíndrica, é colocado. O inserto possui uma membrana de policarbonato de tamanho de poro definido. Quando colocado no poço, divide a câmara em dois compartimentos. O compartimento superior é onde as células cujo comportamento migratório deve ser estudado serão semeadas, e o reservatório inferior é onde a solução de quimioatraente é colocada. Por definição, um quimioatraente é uma molécula que tem a capacidade de promover a motilidade celular "atraindo células".

Devido a essas forças atrativas, as células no compartimento superior migram através dos poros para o reservatório inferior. Se as células tiverem propriedades aderentes, como algumas células de melanoma, após o movimento, elas "grudarão" na parte inferior da membrana. Nesse caso, a membrana pode ser fixada, corada e as células podem ser contadas ao microscópio. Por outro lado, as células não aderentes, como os espermatozoides, migrarão para o reservatório inferior. Nesse caso, as células da solução do reservatório podem ser contadas com a ajuda de um hemocitômetro.

Embora a configuração para este ensaio seja simples, há várias coisas que você precisa considerar antes do experimento. Vamos rever alguns deles.

Começando com a solução de semeadura, você deve certificar-se de que a densidade seja otimizada para observar a migração celular. Poucas células podem resultar em migração indetectável e densidades maiores superpovoarão a membrana, dificultando a enumeração da migração. A segunda consideração é o tamanho do poro da pastilha. Deve ser cuidadosamente escolhido dependendo do tipo de célula. Se o tamanho do poro for muito pequeno, as células não conseguirão passar.

Alternativamente, se o tamanho do poro for muito grande, as células simplesmente cairão, o que não é migração. Por fim, deve-se estar atento à concentração de quimioatraentes e ao tempo de incubação a ser permitido para a migração, pois são interdependentes. A concentração ideal com tempo de incubação apropriado, durante o qual o gradiente de concentração é mantido entre os compartimentos, induz a migração celular devido à quimio-atração. Por outro lado, incubações prolongadas podem ser acompanhadas por um equilíbrio de quimioatraente em toda a câmara, levando à perda de gradiente químico, o que pode confundir a análise dos resultados obtidos.

Com essas considerações em mente, vamos discutir um protocolo usado para medir a migração de células aderentes.

As células a serem analisadas são preparadas em um meio livre de protease, uma vez que as proteases podem desnaturar importantes receptores de membrana e, em última análise, afetar a migração. Depois que as células são preparadas, a suspensão deve ser diluída até uma densidade de semeadura ideal. Para preparar a câmara, os transpoços são colocados em poços em uma placa multipoços. A suspensão celular deve ser pipetada no transwell sem tocar na membrana ou introduzir bolhas de ar.

A solução quimioatraente é pipetada no reservatório inferior, certificando-se de que a solução toque a membrana do inserto. O tempo de incubação para a migração dependerá das considerações experimentais. Após a incubação, as membranas são fixadas mergulhando o inserto em etanol a 70%. Depois de deixar o inserto secar, a solução de coloração celular é adicionada.

Em seguida, as células são incubadas por aproximadamente 30 minutos em temperatura ambiente. Após a incubação, as inserções são lavadas com a ajuda de tampão de lavagem. Finalmente, a membrana pode ser excisada e colocada em uma lâmina de microscópio. As células na parte inferior da membrana representam o número de células que migraram na presença e ausência de quimioatraentes.

Já que agora você tem uma ideia do protocolo, vamos dar uma breve olhada em como os pesquisadores estão usando esse método em suas explorações.

Uma das aplicações mais comuns deste ensaio é avaliar as propriedades quimioatraentes de compostos desconhecidos. Aqui, os cientistas estavam interessados em examinar os caminhos de natação de espermatozóides de rãs na presença de alurina, que é uma substância secretada por ovos de anfíbios. Para fazer isso, eles primeiro pipetaram espermatozóides de sapo ativos para o topo das inserções do transwell. Na parte inferior, eles adicionaram allurin. Depois de permitir que as células migrassem, eles contaram os espermatozoides na solução reservatório sob um microscópio. Usando essa técnica, eles foram capazes de gerar uma curva de concentração-resposta que descreve o efeito da concentração de allurin na migração de espermatozoides.

Quando uma célula é atacada por patógenos, ela envia quimioatraentes para recrutar células imunes que migram, se ligam e, posteriormente, resolvem a infecção. Para testar esse fenômeno, esses cientistas cultivaram células epiteliais na parte inferior das inserções. Posteriormente, eles infectaram essas células com diferentes cepas de bactérias. Finalmente, eles introduziram células imunes na câmara superior. Sabe-se que as células infectadas produzem vários quimioatraentes que induzem a migração de células imunes. Os resultados deste experimento demonstraram diferentes graus de migração de neutrófilos em resposta a diferentes tipos de infecção bacteriana.

Por fim, a invasão de células cancerígenas e a metástase através da matriz extracelular sempre intrigaram os biólogos celulares. Aqui, os cientistas queriam determinar como quimioatraentes específicos podem contribuir para essa migração por meio de uma matriz 3D. Eles modificaram geneticamente dois pools separados de células: um expressando proteína fluorescente verde e outro fluorescente vermelho. Eles então pipetaram uma mímica de matriz extracelular para o topo dos transwells.

Uma vez solidificados, eles inverteram o transwell e semearam dois pools de células na parte inferior da membrana. Em seguida, eles recolocaram o inserto na placa multipoços e pipetaram a solução quimioatraente na câmara superior. Isso fez com que as células na parte inferior se movessem para cima e através da matriz 3D. Com a ajuda de imagens confocais, esses pesquisadores reconstruíram a migração celular em 3D e distinguiram os padrões de migração de dois grupos de células.

Você acabou de assistir ao vídeo da JoVE sobre o ensaio de migração de poços trans. Com a compreensão dos componentes e do protocolo deste método, agora você sabe por que ele é tão amplamente utilizado por biólogos celulares. Apesar da simplicidade dessa configuração, a variedade de configurações que esse método pode adaptar o torna indispensável para estudos de motilidade celular. Como sempre, obrigado por assistir!