Name: Multiplexar Cytokine perfilação de Mouse estimulada Splenocytes usando uma plataforma baseada em Cytometric Bead imunoensaio (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Aprenda a quantificar múltiplas citocinas simultaneamente em sobrenadantes de esplenócitos de camundongo estimulados usando imunoensaio multiplex baseado em micropartículas e citometria de fluxo. Este método permite analisar perfis citocínicos específicos para compreender respostas imunes em diferentes contextos de doenças.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores gostaria de reconhecer as contribuições dos biomarcadores e imuno-ensaios de equipe de desenvolvimento de produto para o desenvolvimento do ensaio. Além disso, gostaríamos de agradecer Vigene Tech, Inc. para seus esforços de colaboração na criação de pacotes de software de análise de dados.

todas as experiências em animais foram realizadas de acordo com as recomendações de NIH contidas o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório e foram aprovadas pelo IACUC no BioLegend.
 <img alt="Diagrama de fluxo de trabalho de ensaio de cultura celular; etapas de ligação de anticorpos, ciclos de lavagem e configuração de citometria de fluxo." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56440/56440fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Resumo de procedimento de ensaio de placa do filtro. O protocolo para realizar o ensaio usando placas de filtro é representado como um diagrama representando componentes chave do ensaio e etapas de incubação. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56440/56440fig1large.jpg" target="_blank"> clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
 1. preparação da amostra biológica Nota: O local escolhido anatômico e volume de coleta de sangue é deixada ao critério de cada investigador individual e não afetará o resultado do ensaio. No entanto, uma vez que eles são obtidos, as amostras devem ser manuseadas de acordo com as etapas listadas abaixo.
<ol><li>De Preparação de amostras de soro <ol><li>coletar o volume desejado de sangue num tubo de colheita preferencial e permitir que coagula pelo menos 30 min.</li>
		<li>Centrifugar a amostra durante 10 minutos a 1.000 x g, à temperatura ambiente.</li>
		<li>Retire o soro e ensaio imediatamente ou alíquota em tubos de polipropileno microcentrifuga e armazenar as amostras em ≤ -20 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Preparação de amostras de Plasma <ol><li>recolher o volume desejado de sangue usando ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) revestido tubos de colheita de sangue.</li>
		<li>Centrifugar durante 10 minutos a 1.000 x g, à temperatura ambiente dentro de 30 min de coleção.</li>
		<li>Remover plasma e ensaio imediatamente ou alíquota para tubos de polipropileno microcentrifuga e armazenar as amostras em ≤ -20 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Preparação do amostras sobrenadante de cultura de tecidos <ol><li>centrifugar a amostra durante 10 minutos a 1.500 x g a 4 ° C para remover células e restos.</li>
		<li>Recolher o sobrenadante e ensaio imediatamente ou alíquota para tubos de polipropileno microcentrifuga e armazenar no ≤ -20 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Descongelamento de congelados amostras biológicas <ol><li>descongelar completamente qualquer amostras biológicas previamente congeladas no gelo e o vórtice brevemente antes do uso. Evitar mais de 2 ciclos de congelamento/descongelamento. 
		Nota: As amostras utilizadas neste protocolo foram obtidas pelo cultivo splenocytes de rato BALB/c (1 x 10 6 células em 37 ° C + 5% CO 2 sob várias condições: unstimulated, LPS (100 ng/mL), αCD3 (1 µ g/mL-revestida) + αCD28 (1 µ g/mL solúvel), PMA (20 ng/mL) + Ionomycin (500 ng/mL). Sobrenadantes de cultura foram coletadas após 48 h e processados conforme descrito na seção 1.3.</li>
	</ol></li></ol> 2. Preparação do reagente <ol><li>Grânulos de Preparation of Pre-mixed Antibody-Immobilized <ol><li>Sonicate pré-misturados grânulos do frasco por 1 min em um banho de sonicador em temperatura ambiente e em seguida vortex para 30 antes de s de usar. Se nenhum banho sonicador está disponível, aumentar o tempo de vórtice para 1 min.</li>
	</ol></li> <li>Preparação de tampão de lavagem <ol><li>trazer a 20 x tampão de lavagem (20x PBS com 1% Tween-20) fornecido com o kit à temperatura ambiente e vórtice para trazer todos os sais em solução.</li>
		<li>Diluir 25 mL de tampão de lavagem com 475 mL de água desionizada de 20x. Parcela não utilizada armazenar entre 2 ° C e 8 ° C por até um mês.</li>
	</ol></li> <li>Preparação da matriz B (para uso com soro e Plasma amostras apenas) <ol><li>Adicionar 5,0 mL de tampão de ensaio (PBS com 1% de BSA) incluído no kit para o frasco contendo liofilizado Matrix B. permitir pelo menos 15 min para reconst completa itution, então o vórtice para misturar bem. Reconstituído sobra Matrix B pode ser armazenado em ≤-70 ° C por até um mês.</li>
	</ol></li></ol> 3. Preparação padrão Nota: cada analito neste painel tem uma concentração padrão superior de 10.000 pg/mL.
<ol><li>Adicionar 250 µ l de Buffer de ensaio para reconstituir o liofilizado Mouse Th citocina padrão Cocktail. Misture por brevemente num Vortex e permitir que o frasco para sentar-se à temperatura ambiente durante 10 min.</li>
	<li>Transferir o coquetel padrão para um tubo de polipropileno microcentrifuga rotulado " C7 ". Isso será usado como o padrão de topo.</li>
	<li>Tubos de polipropileno microcentrifuga rótulo 6 como C6, C5, C4, C2, C3 e C1.</li>
	<li>Adicionar 75 µ l de Buffer de ensaio para cada um destes tubos.</li>
	<li>Transferir 25 µ l do C7 padrão superior ao tubo de C6 e mistura bem vortexing. Este será o padrão C6.</li>
	<li>Continuar realizando serial diluições de 1:4 usando uma pipeta nova dica para cada tubo, adicionar 25 µ l da norma anterior para o µ 75 l de Buffer de ensaio no próximo menor tubo padrão seguido num Vortex para obter padrões C5, C4, C3 , C1 e C2. Usar o Buffer de ensaio como o padrão de 0 pg/mL (C0).</li>
</ol> 4. Diluição da amostra Nota: experimentos piloto preliminares usando este ensaio com várias diluições podem ser necessários para determinar o fator de diluição mais apropriado para um determinado conjunto de amostras biológicas. Um fator de diluição adequada irá produzir cálculos da concentração da amostra que se encontram dentro dos limites da curva padrão. As etapas a seguir servem como diretrizes e poderão ter de ser determinado empiricamente dependendo do tipo de amostra.
<ol><li>Diluir soro ou plasma amostras 2 dobras com Buffer de ensaio (EG. diluir 50 µ l de amostra com 50 µ l de Buffer de ensaio) em tubos de polipropileno microcentrifuga. 
	Nota: Se mais diluição da amostra é necessária, diluições devem ser feitas com a matriz B em vez de buffer de ensaio para garantir a precisão das medições. Adicionando as amostras de soro ou plasma sem diluição resultarão na precisão do ensaio baixa e podem obstruir a placa do filtro. Matriz B é composto por soro de rato em pool empobrecido de alvos de ensaio endógeno. É usado como um diluente de amostra de soro ou plasma para evitar efeitos de matriz, que são conhecidos para a sensibilidade analítica de afeto de imunoensaios.</li>
	<li>Teste de pilha amostras de sobrenadante de cultura sem diluição. 
	Nota: Os níveis de analito podem variar grandemente de amostra para amostra. Se necessário, diluir as amostras sobrenadante usando uma fresca preparação de seu correspondente meio de cultura celular ou Buffer de ensaio.</li>
</ol> 5. Procedimento de ensaio Nota: O ensaio pode ser executado em placas de filtro de polipropileno, tubos de micro FACS ou microplacas de fundo-V. O procedimento de ensaio de placa do filtro é recomendado devido à boa amostra para amostra consistência, ensaio robustez e facilidade de manuseio. Este procedimento requer uma unidade de filtração de vácuo para lavagem (fornecida pelo usuário final).
<ol><li>Permitem que todos os reagentes aquecer a temperatura ambiente (20-25 ° C) antes do uso.</li>
	<li>Conjunto da placa do filtro na capa de um prato invertido em todos os momentos durante as etapas de instalação e incubação de ensaio, para que o fundo do prato não tocar superfícies como pode causar vazamento.</li>
	<li>Manter a placa na posição vertical durante o procedimento de ensaio inteiro, incluindo as etapas de lavagem, para evitar a perda de grânulos de.</li>
	<li>Manter a placa no escuro ou embrulhado com papel alumínio para todas as etapas de incubação.</li>
	<li>Executar todas as normas e amostras como duplicatas, dispostas no prato em ordem sequencial.</li>
	<li>Pre-molhar a placa filtro adicionando-se 100 µ l de tampão de lavagem 1x a cada poço e deixe descansar por 1 min à temperatura ambiente (se estiver usando o filtro de fundo microplacas).</li>
	<li>Volume de tampão remover utilizando um tubo de vácuo (5-10 s). Não exceda 10 " Hg de vácuo. Lavagem do excesso de borrão Tampão da parte inferior da placa, pressionando a placa sobre uma pilha de toalhas de papel limpo. Coloque a placa em cima da tampa da placa invertida. 
	Nota: As etapas 5.1-5.2 podem ser omitidas se realizar o ensaio usando uma V-microplaca ou micro FACS tubos.</li>
	<li>Para amostras sobrenadante de cultura de células, adicione 25 µ l de Buffer de ensaio para todos os poços. Adicione 25 µ l de cada norma aos poços padrão. Adicionar 25 µ l de cada amostra os amostra poços.</li>
	<li>Para medição de amostras de soro ou plasma, adicione 25 µ l de matriz B aos poços padrão. Adicione 25 µ l de Buffer de ensaio para os poços da amostra. Adicione 25 µ l de cada norma aos poços padrão. Adicionar 25 µ l de cada amostra de plasma ou de soro diluído nos poços de amostra.</li>
	<li>Vortex misturado de grânulos para 30 µ l adicionar 25 s., de grânulos mistos para cada poço, agitando a garrafa de grânulo intermitentemente para evitar grânulo fixando-se. O volume final deve ser 75 µ l em cada poço após a adição dos grânulos.</li>
	<li>a placa com um aferidor de placa do selo. Embrulhe o prato inteiro, incluindo a tampa da placa invertida, com folha de alumínio. Coloque a placa de um agitador de placa, fixá-lo e agitar a aproximadamente 500 rpm por 2 h à temperatura ambiente. Para evitar fugas, não aplique pressão positiva para o aferidor de placa.</li>
	<li>Sem inversão, coloque a placa sobre o distribuidor de vácuo e aplicar vácuo como antes e acrescentar 200 µ l de tampão de lavagem 1x a cada poço.</li>
	<li>Remover o conteúdo dos poços de placa de ensaio por filtração em vácuo. Borre o tampão de lavagem em excesso da parte inferior da placa com um absorvente ou toalhas de papel. Repita essa etapa mais uma vez. 
	Nota: Se o ensaio é realizado usar um V-fundo microplacas ou micro FACS tubos pular etapas 5.12 e 5.13. Em vez disso, centrifugar a placa a 1.000 x g durante 5 min à temperatura ambiente, em seguida, remover o sobrenadante com uma pipeta multicanal.</li>
	<li>Adicionar 25 µ l de anticorpos de deteção (consulte a tabela de materiais) para cada poço.</li>
	<li>a placa com um aferidor de placa fresca do selo. Embrulhe o prato inteiro, incluindo a tampa da placa invertida, com folha de alumínio.</li>
	<li>Colocar a placa num agitador de placa e agitar a aproximadamente 500 rpm por 1h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Sem aspirar, adicione 25 µ l de reagente de SA-PE diretamente a cada poço. Sem diluição do reagente é necessária.</li>
	<li>a placa com um aferidor de placa fresca do selo. Embrulhe o prato inteiro, incluindo a tampa da placa invertida, com folha de alumínio.</li>
	<li>Colocar a placa num agitador de placa e agitar a aproximadamente 500 rpm durante 30 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Repita o passo acima 5.13.</li>
	<li>Adicionar 200 µ l de 1x tampão de lavagem a cada poço. Re-suspender as contas num agitador de placa de 1 min.</li>
	<li>Usando uma pipeta multicanal, transferir amostras da placa do filtro para tubos de FACS ler amostras em um citômetro de fluxo. 
	Nota: Volume de amostra pode ser aumentado de 200 µ l para 300 µ l, adicionando um extra 100 µ l de tampão de lavagem 1x a cada tubo para evitar a amostra seca em execução. Se amostras necessárias podem ser armazenadas em 4 ° C protegido da luz e analisados no dia seguinte. No entanto, armazenamento de amostra prolongada pode levar a sinal reduzido.</li>
</ol> 6. Set-up citômetro de fluxo Nota: a fim de gerar dados fiáveis, o citômetro de fluxo deve ser configurado corretamente antes de aquisição de dados. Este processo irá variar para usuários individuais em alguns aspectos, dependendo da configuração do instrumento particular em que o ensaio é realizado. Um processo de instalação generalizada para um citômetro capaz de medir a PE e APC e equipado com ambos um laser de 488 e 633 nm é discutido abaixo.
<ol><li>Iniciar o software de aquisição e citômetro de fluxo de acordo com o fabricante ' instruções é fornecidas com o instrumento.</li>
	<li>Criar uma trama de ponto com selo FSC (dispersão para a frente) no eixo x e SSC (dispersão lateral) para o eixo y. Definir o FSC e SSC para modo linear.</li>
	<li>Criar um segundo ponto enredo com PE no eixo x e APC para o eixo y. Este plano deve ser definido como um modo de exibição com base em log.</li>
	<li>Vortex do frasco de grânulos crus incluídos no kit de 30 s para re-suspender as contas. Estes grânulos contêm um corante APC interno e são compreendidos de duas populações de tamanho.</li>
	<li>Transferência de 400 µ l dos grânulos crus para um novo tubo de FACS.</li>
	<li>Definir a taxa de fluxo do citômetro de fluxo para baixo.</li>
	<li>Executar os grânulos crus, ajustando cuidadosamente o ganho e a tensão para o SSC e FSC, para que ambas as populações tamanho destes grânulos são visivelmente separados e fáceis de portão.</li>
	<li>Ajustar o limite FSC para excluir eventos indesejados (ou seja, bolhas de detritos ou ar).</li>
	<li>Enredo no FSC vs CCD, desenhar um portão que inclui todas as populações do grânulo. 
	Nota: Os grânulos crus contêm duas populações de tamanho dos grânulos, a menor " um grânulos " e o maior " grânulo B " regiões.</li>
	<li>Exibir as populações fechado do grânulo do terreno FSC vs CCD sobre o segundo ponto enredo com PE no eixo x e APC para o eixo y.</li>
	<li>Ajustar a tensão de PGTO para o canal de fluorescência APC para que o sinal da APC para todas as populações de esferas tem uma intensidade de fluorescência mediana (IFM) que se situa entre 1 x 10, 1 e 5 x 10 3.</li>
	<li>Vortex o frasco da instalação PE grânulos para 30 s para re-suspender os grânulos.</li>
	<li>Contas de transferência de 400 µ l do PE para um novo tubo de FACS.</li>
	<li>Contas de substituir os grânulos crus tubo do citômetro de fluxo com o PE tubo.</li>
	<li>Ajustar a tensão do tubo (PMT) fotomultiplicador para a PE fluorescência canal configuração para que o IFM dos grânulos PE cai entre o intervalo de lote-específico encontrada indicados no rótulo do frasco de grânulos de PE. 
	Nota: Os grânulos de instalação PE contêm grânulos do tamanho de uma população (" um grânulos " somente).</li>
</ol> 7. Aquisição de dados Nota: os procedimentos exatos associados com a aquisição de dados em um determinado instrumento podem variar e dependem o citômetro de ' s especificações de configuração e o software de interface utilizado. As instruções abaixo destinam-se, portanto, para destacar as etapas necessárias a adoptar no ensaio independentemente o citômetro empregado no ensaio de.
<ol><li>Verifique se a taxa de citômetro de fluxo ainda está definida para baixo.</li>
	<li>Definir o número de eventos do grânulo, a aquisição de cerca de 300 por analito. Para um 13-plex painel isso equivale a adquirir 3.900 eventos combinados de ambas as populações de tamanho do grânulo (grânulos de A + B).</li>
	<li>Vortex cada amostra por 5 s antes da análise.</li>
	Amostras <li>leitura. Ao ler as amostras, definir o citômetro de fluxo para o modo de instalação, primeiro e esperar até que a população do grânulo é estabilizada antes de mudar para o modo de aquisição.</li>
	<li>Use nomes simples com numeração consecutiva para arquivos de dados para facilitar a análise de dados.</li>
	<li>Exportar somente os eventos fechados (A + B talão regiões) ao invés de eventos totais.</li>
	<li>Armazenar todos os arquivos do FCS na mesma pasta para cada ensaio. Se executando vários ensaios, criar uma pasta separada para cada ensaio.</li>
</ol> &lt; classe p= "jove_title" &gt; 8. Proceder à análise de dados Nota: arquivos do FCS gerados sobre o citômetro de fluxo devem ser analisados usando o software de análise de dados, que pode ser baixado gratuitamente 14.
<ol><li>Instalar o software de análise de dados em um PC.</li>
	<li>Transferir todos os arquivos de ensaio FCS para o computador que contém o software de análise.</li>
	<li>Conecte o dongle de chave de licença (incluído no kit) em uma porta USB do computador.</li>
	<li>Lançar o software de análise de dados.</li>
	<li>Clique azul " adicionar arquivos " botão localizado na parte superior da tela.</li>
	<li>Navegue até a pasta que contém os arquivos de FCS do ensaio na janela pop-up que aparece.</li>
	<li>Clique e arraste todos os arquivos de ensaio FCS da janela pop up para a visualização de software. Devem aparecer em uma lista todos os arquivos.</li>
	<li>Clique o verde " próximo " botão no canto inferior direito do visor. Clique e segure para arrastar a pequena curva padrão azul botões (C7 a C0) para seus arquivos correspondentes do FCS da lista para definir a curva padrão.</li>
	<li>Clique o verde " próximo " botão no canto inferior direito da tela para abrir a associada janela pop-up.</li>
	<li>No lado esquerdo da janela associada, digite os nomes de ambos os A e regiões de grânulo B ensaio analito alvos e sua ID de associado do grânulo (encontradas no manual fornecido com o ensaio), em ordem crescente.</li>
	<li>Selecione a ferramenta associada da parte superior da janela pop up e usá-lo para desenhar 2 portões na trama do FSC vs CCD, um próximo as contas A e um segundo próximo os grânulos de B.</li>
	<li>Revisão do APC vs PE dispersão plota que aparecem abaixo a trama do FSC vs CCD que aparecem. Haverá 6 bandas de analito em grânulos A (terreno à esquerda) e 7 bandas de analito em grânulos B (direito terreno). 
	Nota: Portões podem ser redesenhados manualmente selecionando a ferramenta borracha no topo e clique para excluir um determinado Portal. A ferramenta associada pode ser selecionada e usada para aplicar manualmente um portão para a região de banda desejada.</li>
	<li>Clique o verde " Okey " botão para fechar a associada janela pop-up e retornar à lista de arquivos FCS.</li>
	<li>Definir nenhum diluições que foram feitas em amostras biológicas por direito clicando em um determinado arquivo, selecionando " diluição dobre " no menu, e o valor correto de entrada.</li>
	<li>Clique o verde " executar " botão no canto inferior direito do visor para gerar as curvas padrão para o ensaio e calcular as concentrações das amostras biológicas desconhecidas.</li>
</ol>

<ol><li>Stanley, A. C., Lacy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+for+cytokine+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Pathways for cytokine secretion.</a> Physiology (Bethesda). 25, 218-229 (2010).</li>
<li>Nicola, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+pleiotropy+and+redundancy%3A+a+view+from+the+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Cytokine pleiotropy and redundancy: a view from the receptor.</a> Stem Cells. 12, (1994).</li>
<li>Miyajima, A., Hara, T., Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+subunits+of+cytokine+receptors+and+the+functional+redundancy+of+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Common subunits of cytokine receptors and the functional redundancy of cytokines.</a> Trends Biochem Sci. 17, 378-382 (1992).</li>
<li>Costantini, S., Castello, G., Colonna, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Cytokinome%3A+a+new+challenge+for+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformation%22%5BJournal%5D)">Human Cytokinome: a new challenge for systems biology.</a> Bioinformation. 5, 166-167 (2010).</li>
<li>Capone, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+Cytokinome+Profile+Evaluation%3A+A+Tool+to+Define+New+Diagnostic+and+Prognostic+Markers+of+Cancer+Using+Multiplexed+Bead-Based+Immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+Inflamm%22%5BJournal%5D)">Serum Cytokinome Profile Evaluation: A Tool to Define New Diagnostic and Prognostic Markers of Cancer Using Multiplexed Bead-Based Immunoassays.</a> Mediators Inflamm. , 3064643(2016).</li>
<li>Schett, G., Elewaut, D., McInnes, I. B., Dayer, J. M., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+cytokine+networks+fuel+inflammation%3A+Toward+a+cytokine-based+disease+taxonomy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">How cytokine networks fuel inflammation: Toward a cytokine-based disease taxonomy.</a> Nat Med. 19, 822-824 (2013).</li>
<li>Tse, E., Kwong, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+lymphoma%3A+Microenvironment-related+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">T-cell lymphoma: Microenvironment-related biomarkers.</a> Semin Cancer Biol. 34, 46-51 (2015).</li>
<li>Reale, M., Greig, N. H., Kamal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+chemo-cytokine+profiles+in+Alzheimer%27s+and+Parkinson%27s+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Mini+Rev+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Peripheral chemo-cytokine profiles in Alzheimer's and Parkinson's diseases.</a> Mini Rev Med Chem. 9, 1229-1241 (2009).</li>
<li>Vistnes, M., Christensen, G., Omland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+cytokine+biomarkers+in+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Multiple cytokine biomarkers in heart failure.</a> Expert Rev Mol Diagn. 10, 147-157 (2010).</li>
<li>Gobel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+coagulation+factor+XII+drives+adaptive+immunity+during+neuroinflammation+via+CD87-mediated+modulation+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Blood coagulation factor XII drives adaptive immunity during neuroinflammation via CD87-mediated modulation of dendritic cells.</a> Nat Commun. 7, 11626(2016).</li>
<li>Palm, A. K., Friedrich, H. C., Kleinau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal+marginal+zone+B+cells+in+mice%3A+a+novel+subset+with+dormant+self-reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Nodal marginal zone B cells in mice: a novel subset with dormant self-reactivity.</a> Sci Rep. 6, 27687(2016).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Bcl11b+is+specifically+expressed+in+group+2+innate+lymphoid+cells+and+is+essential+for+their+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Bcl11b is specifically expressed in group 2 innate lymphoid cells and is essential for their development.</a> J Exp Med. 212, 865-874 (2015).</li>
<li>Pelly, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-4-producing+ILC2s+are+required+for+the+differentiation+of+TH2+cells+following+Heligmosomoides+polygyrus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-4-producing ILC2s are required for the differentiation of TH2 cells following Heligmosomoides polygyrus infection.</a> Mucosal Immunol. 9, 1407-1417 (2016).</li>
<li>LEGENDplex Multiplex Assays. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.biolegend.com/legendplex">https://www.biolegend.com/legendplex</a> (2017).</li>
<li>Autieri, M. <a target="_blank" href="https://www.hindawi.com/journals/isrn/2012/987629/">Pro- and anti-inflammatory networks in atherosclerosis.</a> ISRN Vascular Medicine. 2012, (2012).</li>
<li>West, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+cytokine+networks+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Emerging cytokine networks in colorectal cancer.</a> Nat Rev Immunol. 15, 615-629 (2015).</li>
<li>Becher, B., Spath, S., Goverman, J. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nri/journal/v17/n1/full/nri.2016.123.html">Cytokine networks in neuroinflammation.</a> Nat Rev Immunol. 17, 49-59 (2017).</li>
</ol>

Os autores são empregados pelo BioLegend, que fabrica os reagentes descritos neste manuscrito. Vigene Tech, Inc. desenvolveu o software de análise de dados de LEGENDplex que é usado para analisar os dados gerados a partir do ensaio descrito neste manuscrito.

O formato de ensaio descrito neste protocolo pode fornecer robusta quantificação dos perfis de mediador solúvel em amostras biológicas, desde que o experimentador tem laboratório de boa técnica e adere ao protocolo recomendado.
Há várias etapas que devem ser seguidas para garantir resultados confiáveis. Em primeiro lugar, as normas recombinantes devem reconstituir no buffer de ensaio o recomendado em tempo integral e após apenas diluído em tubos de polipropileno. Tubos de poliestireno podem promover a adesão das proteínas da parede dos tubos, que pode levar a sinais de baixos ao gerar a curva padrão. Em segundo lugar, adequada a tremer durante as etapas de incubação é crítico. Sem a agitação adequada, as características de ligação dos grânulos do ensaio podem ser severamente prejudicadas. Além disso, a lavagem adequada entre as etapas de incubação também é necessária. O experimentador deve assegurar que os reagentes em excesso são removidos dos poços, antes de iniciar o próximo passo no protocolo. Configurações de instrumentos para o citômetro de fluxo usado para interrogar os grânulos de ensaio devem ser também otimizadas. Em particular, configurações de PGTO devem ser ajustadas para assegurar a separação adequada do grânulo e amplos intervalos dinâmicos para as curvas padrão. Finalmente, pouco antes de ser analisado sobre o citômetro, grânulos devem ser vortexed para garantir a suspensão adequada e para evitar a formação de agregados que podem distorcer os resultados.
Este protocolo potencialmente pode ser modificado para analisar o tecido homogenates, bem como os tipos de amostra discutidos neste manuscrito, desde que o pesquisador está disposto otimizar seu protocolo de Lise antes de realizar ensaios de placa grande, completo. Claro, a técnica real irá variar dependendo do tipo de tecido; no entanto, em geral o protocolo deve usar um tampão de pH neutro contendo concentrações fisiológicas de sais iônicos, sem produtos químicos desnaturação e de preferência sem detergentes. Se o detergente deve ser usado, as concentrações de detergente não-iônico devem ser mantidas no mínimo (por exemplo, não mais que 1%). O buffer também deve conter inibidores de protease suficientes para prevenir a degradação proteolítica de proteínas do alvo. Independentemente do protocolo de Lise usado, os preparativos finais devem ser centrifugados para remover partículas antes da análise.
Sobre as limitações do ensaio, as concentrações de analito alvos em tipos de amostra biológica podem variar muito. De forma a quantificar corretamente as concentrações de analito, eles devem ser abrangidos os valores superior e inferior para a curva padrão. Extrapolação dos valores da curva não é necessariamente fiável e não recomendo. Investigadores, portanto, devem otimizar as diluições de amostras particulares em experimentos piloto antes da execução de um ensaio completo-placa. Além disso, a preparação cuidadosa das amostras biológicas para ser analisada é fundamental para o sucesso deste formato de ensaio. Amostras lipémicas, hemolizado, ou contêm restos de proteínas irão afetar interações antígeno anticorpo que definem o princípio básico deste imunoensaio e render resultados que são difíceis de interpretar.
Este ensaio é significativo no que diz respeito a métodos de quantificação existentes por várias razões. Quando executado corretamente, o formato de ensaio pode dosar até 13 analitos de uma amostra usando volumes muito menores do que seria necessário para analisar a amostra usando os tradicionais ensaios de ELISA. Este formato de ensaio também não requer instrumentação dedicada para ser executada. Esta é uma vantagem em comparação com outros imunoensaios baseados em grânulo comercialmente disponíveis como o ensaio pode ser executado usando qualquer número de citômetros comumente usados.
Inquérito científico sobre o papel desempenhado por citocinas e fatores secretados redes em saúde e doença está se expandindo. O formato de ensaio descrito neste manuscrito pode ser uma ferramenta valiosa para investigadores que pretendam compreender esses fenômenos multifacetados e complexos. Programas de investigação biomédica estão começando a explorar o papel das redes de citocina de inflamação de áreas tais como generalizadas não apenas6, mas também no contexto de Estados de doença específica, tais como aterosclerose, câncer e neuroinflammation 15,16,17. Sem dúvida, investigação continuará a crescer nestas áreas, como a busca de novas terapêuticas tratar essas condições crônicas se expande. A necessidade de quantificação precisa e confiável dos mediadores solúveis associados a estas doenças continuará a ser uma prioridade de investigação crítica.

Em seu papel como moléculas sinalizadoras solúveis, citocinas mediam os processos altamente coordenados e multifatoriais que governam as respostas imunológicas do hospedeiro. Eles são expressos durante todas as fases do processo inflamatório, de iniciação à resolução e regulam uma rede de interação complexa que inclui sua própria síntese e dos seus receptores celulares1. Esta rede de comunicação é mergulhado com uma complexidade que ultrapassa as relações sinérgicas ou antagônicas que possam existir entre componentes individuais. Com efeito, muitas citocinas são conhecidas para compartilhar funções redundantes ou pelo menos parcialmente sobrepostas2,3.
Abordagens de biologia de sistemas integrados que quantificam simultaneamente vários analitos de citocinas são, atualmente, fornecendo uma compreensão cada vez mais abrangente do único cytokinomes que orquestrar as respostas imunes subjacente a várias doenças 4,5, afirma. Estas doenças Estados variam de inflamação generalizada para câncer, doenças neuro-degenerativas e doenças cardiovasculares6,7,8,9.
Essas redes de citocina podem ser interrogadas eficazmente usando os imunoensaios baseados no grânulo de LEGENDplex. Estes ensaios são baseados no mesmo princípio que o sanduíche do ensaio de imunoabsorção Enzyme-Linked (ELISA) e usam microesferas de fluorescência codificada com captura de anticorpos ligados covalentemente a sua superfície. Estes anticorpos são imobilizados na áreas de superfície muito menores do que os exigidos pelos formatos tradicionais de ELISA. Isso permite que tais ensaios ser executado com muito menos volume de amostra, enquanto ao mesmo tempo reduzir específico vinculação e fornecendo multiplexado análise de vários analitos.
O ensaio descrito neste protocolo utiliza esta tecnologia para dosar até 13 alvos simultaneamente. Dados deste ensaio podem ser obtidos usando uma grande variedade de citômetros comumente disponíveis e ao contrário de outros ensaios disponíveis não requer o uso de instrumentação de ensaio específico dedicado. Com um catálogo de expansão dos painéis de analito validado, estes ensaios têm sido usados em pesquisa biomédica em curso vários projectos10,11,12,13.
Para demonstrar a facilidade e a utilidade do formato de ensaio, neste experimento, que usamos um painel de citocina Mouse T auxiliar para dosar 13 separar concentrações de citocinas sobrenadantes de cultura de tecidos obtidos a partir do mouse splenocytes cultivadas sob múltiplos estimulatórios condições. Além de cultura de tecidos sobrenadantes, este ensaio também pode ser realizado utilizando amostras de soro ou plasma.

<table><tbody><tr><td>Centrífuga Allegra 6R com Adaptador de Transportador MICROPLUS</td><td>Beckman Coulter</td><td>366816</td><td>Para ensaios LEGENDplex é executado em microtubos, placa de 96 poços com fundo em V ou U (opcional)</td></tr><tr><td>LEGENDplex Mouse T helper Painel de citocinas</td><td>BioLegend</td><td>740005</td><td>Multiplex Immunoassay (13-plex)</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD3&epsilon; anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>100314</td><td>Clone 145-2C11, baixa endotoxina, formato livre de azida</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-camundongo CD28</td><td>BioLegend</td><td>102112</td><td>Clone 37.51, baixa endotoxina, formato livre de azida</td></tr><tr><td>Bomba de vácuo</td><td>EMD Millipore</td><td>WP6111560</td><td>Para ensaios LEGENDplex usando placas filtrantes (recomendado)</td></tr><tr><td>Coletor de vácuo</td><td>EMD Millipore</td><td>MSVMHTS00</td><td>Para ensaios LEGENDplex usando placas filtrantes (recomendado)</td></tr><tr><td>Reservatórios de reagentes descartáveis estéreis</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-130</td><td>Ou equivalente</td></tr><tr><td>Tubos MicroFACS de Polipropileno</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-842-90</td><td>Para ensaios LEGENDplex é executado em microtubos, placa de 96 poços com fundo em V ou U (opcional)</td></tr> <tr><td>Kit de Pipeta</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-388-100</td><td>Quatro tamanhos de pipeta (0.2-2&micro; L, 2-20&micro; L, 20-200&micro; L, 100-1000 e micro; L)</td></tr> <tr><td>Pipeta Multicanal</td><td>Fisher Scientific</td><td>FA10011G</td><td>capaz de dispensar 5 &mu; L a 200 &mu; L</td></tr><tr><td>Microplate Shaker</td><td>Fisher Scientific</td><td>88880023</td><td>Ou equivalente</td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>75002410</td><td>Ou equivalente</td></tr><tr><td>Tubos FACS</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9885747</td><td>12 x 75 mm fundo redondo</td></tr><tr><td>PMA (Phorbol 12-miristato 13-acetato)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolissacarídeo (LPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-8274</td><td>Escherichia coli O26:B6</td></tr><tr><td>Ionomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Branson B200 Limpador Ultrassônico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z305359</td><td>Ou equivalente</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z666505</td><td>Tubos de polipropileno de 1,5 mL</td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo</td><td>Vários</td><td>Vários</td><td>Citómetro equipado com um único laser (488nm azul) ou dois lasers (488nm azul ou 532nm verde + 633nm vermelho) capaz de ler comprimentos de onda de emissão a 575nm e 660nm</td></tr><tr><td>Placa de polipropileno de 96 poços</td><td>VWR</td><td>82050-662</td><td>Para ensaios LEGENDplex é executado em microtubos, placa de 96 poços com fundo em V ou U (opcional)</td></tr></tbody></table>

multiplexar cytokine perfilação de mouse estimulada splenocytes usando uma plataforma baseada em cytometric bead imunoensaio

Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform

Imunoensaios baseados em grânulo empregam o mesmo princípio básico como imunoensaios de sanduíche. Captura de grânulos, que podem ser diferenciados pelo tamanho e intensidade de fluorescência allophycocyanin interno (APC), são conjugados com anticorpos específicos para um determinado analito. Em seguida, um painel selecionado de captura definidos conjuntos de grânulo é incubado com uma amostra biológica contendo alvo analitos específicos para os anticorpos de captura. Um anticorpo de detecção biotinilado cocktail é adicionado, o que leva à formação de sanduíches de anticorpo do grânulo-analito-deteção de captura.
Finalmente, é adicionado streptavidin-ficoeritrina (SA-PE), que liga-se anticorpos de deteção biotinilado, fornecendo intensidades de sinal fluorescente proporcionalmente à quantidade de analito acoplado. O PE fluorescente sinal de regiões específicas do analito grânulos é quantificada usando citometria de fluxo, e as concentrações dos analitos específicos são determinadas usando software de análise de dados e a curva padrão gerado no ensaio.
Neste experimento, usamos um painel de cytokine do rato T auxiliar para quantificar simultaneamente a concentração de 13 destinos de cytokine separado em sobrenadantes de cultura de tecidos coletados de rato splenocytes cultivadas sob diferentes condições estimulatórios.

Este protocolo demonstra como uma plataforma baseada em grânulo imunoensaio pode ser usada para dosar simultaneamente perfis cytokine de amostras biológicas usando um citômetro de fluxo. As amostras biológicas usadas neste exemplo foram sobrenadantes de cultura de células de rato splenocytes que tinha sido previamente incubado sob várias condições de activação, embora o formato de ensaio também foi validado para uso com amostras de soro ou plasma.
Dados gerados a partir do ensaio são usados para construir curvas padrão para todos os analitos no painel multiplexado. O software de análise de dados classifica cada analito específico com base em um único talão tamanho e intensidade APC e quantifica-los usando um repórter de PE. Os intervalos dinâmicos, bem como a sensibilidade do ensaio é demonstrados quando plotados em escala log-log na Figura 2A. O software usa dados de ensaio e um algoritmo de ajuste de curva 5-parâmetro para calcular com precisão não só as concentrações dos analitos em usuário fornecido amostras biológicas mas também os limites de detecção em ambas as extremidades da alta e baixa de todas as curvas padrão (tabela 1 ). O formato descrito neste protocolo também fornece precisão ensaio altamente robusto. Na Figura 2B e 2C , os dados são apresentados mostrando a variabilidade intraensaio de cada analito. Duas concentrações de proteína padrão separado (alta e baixa) foram analisadas em um ensaio com 16 repetições para cada amostra. Figura 2 e 2D representam a variação inter-ensaio do alvo analitos de três ensaios independentes. Como com os experimentos de precisão intra-ensaio, altas e baixas concentrações padrão foram analisadas com 3 repetições em cada um dos experimentos independentes. Variabilidade mínima na concentração de proteínas do alvo calculada é claramente visível.
Para demonstrar a utilidade dos ensaios baseados em grânulo cytometric em interrogar perfis de expressão de citocinas, rato splenocytes foram incubados sob várias condições de activação. Além de um controle unstimulated, células também foram incubadas com LPS, anticorpos anti-CD3/anti-CD28, ou phorbol myristate 12 13-acetato e ionomycin. Sobrenadantes de cultura de células foram coletadas 48 horas mais tarde e analisada usando o painel de citocina Mouse T auxiliar. Os resultados da quantificação deste experimento são representados na Figura 3 e o efeito das condições de estimulação em concentrações de citocinas é claramente delineado.
Os resultados descritos acima são típicos, contanto que o experimentador tem laboratório de boa técnica e segue o protocolo de ensaio fornecido. Fontes de erro neste formato de ensaio podem surgir a partir de desvios em tempos de incubação, volumes de reagentes, lavagem, ou configurações de PGTO indevidas sobre o citômetro de fluxo usado para analisar as amostras. Na Figura 4A uma dispersão enredo de um ensaio bem sucedido mostra 2 populações distintas do grânulo que estão claramente definidas. Isto pode ser contrastado a Figura 4B, onde pobre aderência de lavagem e protocolo conduziram a agregados de grânulo que desfocagem as duas populações. Além disso, conforme atestam os detritos no quadrante inferior esquerdo, total citômetro eventos foram exportados para análise, ao invés do formato preferido de eventos fechados apenas. Adequada citômetro de configurar é fundamental para gerar dados confiáveis neste ensaio. Na Figura 4 adequado PGTO configurações permitem para a resolução de cada um dos 6 analitos no canal de classificação da APC. Configurações de PGTO indevidas resultará em semelhante ao apresentado na Figura 4 , onde o canal APC tem populações grânulo com sobreposição intensidades de classificação de dados. Isso invalidará o ensaio, uma vez que será impossível calcular concentrações de analito sem populações claramente definidas de grânulos de ensaio.
<img alt="Linearidade e variabilidade da quantificação de citocinas; Gráficos; análise de variabilidade intra/interensaio." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56440/56440fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2: intervalos de curva padrão e precisão teste. (A) uma representante curva padrão gerada usando o painel de citocina Mouse T auxiliar. Uma curva padrão deve ser executada com cada ensaio. (B-C) Precisão intra-ensaio. Duas amostras com concentrações diferentes de proteínas do alvo (alta e baixa) foram analisadas em um ensaio com 16 repetições para cada amostra. Dados são representados como a média + desvio padrão. (D-E) Precisão inter-ensaio. Duas amostras com concentrações diferentes de proteínas do alvo (alta e baixa) foram analisadas em três ensaios independentes com 3 repetições para cada amostra. Dados são representados como a média + desvio padrão. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56440/56440fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Gráfico de barras dos níveis de citocinas (pg/mL) em testes de estimulação imunológica: CD3/CD28, LPS, PMA+Iono." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56440/56440fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3: quantificação dos resultados representante. Mouse splenocytes (1 x 106 células) foram cultivadas a 37 ° C + 5% CO2 sob várias condições: unstimulated, LPS (100 ng/mL), αCD3 (1 µ g/mL-revestida) + αCD28 (1 µ g/mL solúvel), PMA (20 ng/mL) + Ionomycin (500 ng/mL). Sobrenadantes de cultura foram coletadas após 48 h, em seguida, quantificados usando o painel de citocina Mouse T auxiliar. Perfis de expressão diferencial de citocinas em resposta a condições de estimulação são claramente visíveis. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56440/56440fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Gráficos de citometria de fluxo mostrando SSC vs. FSC e APC vs. PE, ilustrando a análise da população celular." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56440/56440fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4: resultados de sucesso vs ensaios sem sucesso. (A) ensaios bem sucedidos terão populações distintas do grânulo para as populações de microesfera. (B) ensaios vencidos terá separação de população pobre, agregados do grânulo e muitos eventos coletados. (C) ensaios bem sucedidos têm claramente definidos intensidades no canal de fluorescência de classificação que são fáceis de portão e quantificar. (D) ensaios sem sucesso vão ter mal separados e intensidades de classificação que se sobrepõem várias populações de grânulo, tornando difícil a quantificação. Muitos destes erros podem ser evitados através da cuidadosa adesão ao protocolo de ensaio. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56440/56440fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">Curva padrão</td>
			<td colspan="2">Sensibilidade (pg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analito</td>
			<td>Fórmula de ajuste</td>
			<td>CV</td>
			<td>R2</td>
			<td>Min.</td>
			<td>Max.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-Γ</td>
			<td>5-P.log(4.43, 14.40, 0.54, 9.11, 0.01)</td>
			<td>1,77%</td>
			<td>0,99</td>
			<td>2.1</td>
			<td>18105.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-5</td>
			<td>5-P.log(4.36, 12.68, 0.64, 5.73, 0.36)</td>
			<td>1,32%</td>
			<td>1</td>
			<td>1.9</td>
			<td>14514.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-Α</td>
			<td>5-P.log(4.36, 11.63, 0.79, 5.45, 0.37)</td>
			<td>1,48%</td>
			<td>0,99</td>
			<td>1.9</td>
			<td>20109.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-2</td>
			<td>5-P.log(4.46, 12.62, 0.78, 5.07, 0.34)</td>
			<td>1,34%</td>
			<td>1</td>
			<td>1.9</td>
			<td>25109.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6</td>
			<td>5-P.log(4.58, 11.66, 0.64, 5.77, 0.37)</td>
			</tr></tbody></table>TD&gt;1.70%
			<td>0,99</td>
			<td>2.0</td>
			<td>7022.0</td>
		
		<tr>
			<td>IL-4</td>
			<td>5-P.log(4.27, 12.23, 0.62, 5.72, 0.36)</td>
			<td>1,36%</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>13273.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-10</td>
			<td>5-P.log(4.67, 11.65, 1.20, 6.28, 0.61)</td>
			<td>1,81%</td>
			<td>0,99</td>
			<td>2.2</td>
			<td>5190.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-9</td>
			<td>5-P.log(4.32, 13.86, 0.86, 5.90, 0.45)</td>
			<td>1.82%</td>
			<td>1</td>
			<td>1.9</td>
			<td>12602.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-17A</td>
			<td>5-P.log(4.06, 14.03, 0.47, 6.52, 0.32)</td>
			<td>0,99%</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>12285.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-17F</td>
			<td>5-P.log(4.52, 12.15, 0.61, 5.52, 0.34)</td>
			<td>0,92%</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>14841.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-21</td>
			<td>5-P.log(4.90, 8.03, 1.77, 4.74, 1.11)</td>
			<td>0,79%</td>
			<td>1</td>
			<td>9.0</td>
			<td>12943.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-22</td>
			<td>5-P.log(4.57, 12.56, 0.63, 6.06, 0.39)</td>
			<td>1,16%</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>6408.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-13</td>
			<td>5-P.log(4.40, 11.44, 0.22, 3.19, 1.45)</td>
			<td>1,11%</td>
			<td>1</td>
			<td>2.1</td>
			<td>16728.0</td>
		</tr>
	

Tabela 1: encaixe de curva-padrão e a sensibilidade do ensaio. O software de análise de dados foi usado para gerar curvas padrão para todos os analitos contidas no ensaio de multiplex. Esta análise totalmente automatizado aplica-se um robusta encaixe algoritmo para as normas de série de diluição do ensaio de curva 5-parâmetro e também foi usado para definir a sensibilidade do ensaio, usando os limites teóricos de detecção.

Este protocolo descreve a quantificação de alvos múltiplos de citocinas simultaneamente em sobrenadantes de cultura de tecidos coletados de rato estimulada splenocytes usando multiplex do grânulo imunoensaio baseado em plataforma e um citômetro de fluxo.

Multiplexar Cytokine perfilação de Mouse estimulada Splenocytes usando uma plataforma baseada em Cytometric Bead imunoensaio

Bead-based immunoassays employ the same basic principle as sandwich immunoassays. Capture beads, which can be differentiated by size and internal ...

O objetivo geral deste protocolo é quantificar vários alvos de citocinas simultaneamente em sobrenadantes de cultura de tecidos coletados de esplenócitos de camundongos estimulados usando um imunoensaio multiplex baseado em esferas e um citômetro de fluxo. Este método pode ser usado para responder a questões-chave no campo da imunologia, como, por exemplo, quais são os perfis exclusivos de citocinas que orquestram a resposta imune no contexto de estados de doença específicos? A principal vantagem desta técnica é que a quantificação simultânea de vários anelídeos pode ser realizada usando muito menos volumes de amostra do que os formatos ELISA tradicionais e, ao mesmo tempo, reduzindo a ligação inespecífica.Demonstrando o procedimento estará Nicholas Johnsen, um pesquisador associado de nossa equipe de desenvolvimento de produtos. Comece este procedimento com a preparação de amostras biológicas, conforme descrito no protocolo de texto. Para preparar os grânulos pré-misturados imobilizados com anticorpos, sonicar o frasco de grânulos pré-misturados por um minuto em um banho de sonicador à temperatura ambiente.Em seguida, vórtice por 30 segundos antes de usar. Se nenhum banho de sonicador estiver disponível, aumente o tempo do vórtice para um minuto. Para a preparação padrão, adicione 250 microlitros de tampão de ensaio para reconstituir o coquetel Mouse Th Cytokine Standard liofilizado.Misture brevemente em vórtice e deixe o frasco para injetáveis descansar em temperatura ambiente por 10 minutos. Transfira o coquetel padrão para um tubo de microcentrífuga de polipropileno identificado como C7. Isso será usado como o padrão superior. Rotule seis tubos de microcentrífuga de polipropileno como C1 a C6. Adicione 75 microlitros de tampão de ensaio a cada um desses tubos.Em seguida, transfira 25 microlitros do padrão superior, C7, para o tubo C6 e misture bem por vórtice. Este será o padrão C6. Continue realizando diluições seriais de um a quatro, usando uma nova ponta de pipeta para cada tubo para adicionar 25 microlitros do padrão anterior aos 75 microlitros de tampão de ensaio no próximo tubo padrão mais baixo.Siga cada adição por vórtice. Use o tampão de ensaio como o padrão de zero picogramas por mililitro. Para realizar o ensaio, deixe todos os reagentes aquecerem à temperatura ambiente antes de usar.Placas filtrantes de polipropileno são usadas nesta demonstração. É absolutamente essencial que a placa seja mantida na vertical durante todo o procedimento de ensaio, incluindo as etapas de lavagem, para evitar a perda dos grânulos. Umedeça previamente o papel de filtro adicionando 100 microlitros de tampão de lavagem 1X a cada poço e deixe as placas descansarem por um minuto em temperatura ambiente.Remova o volume do buffer usando o coletor de vácuo. Seque o excesso de tampão de lavagem do fundo do prato pressionando o prato em uma pilha de toalhas de papel limpas. Em seguida, coloque a placa em cima da tampa da placa invertida.Para amostras sobrenadantes de cultura de células, adicione 25 microlitros de tampão de ensaio a todos os poços. Adicione 25 microlitros de cada padrão aos poços padrão. Por fim, adicione 25 microlitros de cada amostra aos poços de amostra.Vortex as contas misturadas por 30 segundos. Em seguida, adicione 25 microlitros das esferas misturadas a cada poço, agitando o frasco de contas intermitentemente para evitar que as contas se assentem. Sele a placa com um selador de placas.Depois de selado, embrulhe toda a placa, incluindo a tampa da placa invertida, com papel alumínio. Coloque a placa em um agitador de pratos, prenda-a e agite a aproximadamente 500 RPM por duas horas em temperatura ambiente. Sem inverter, coloque a placa no coletor de vácuo e aplique o vácuo como antes.Em seguida, adicione 200 microlitros de tampão de lavagem 1X a cada poço. Remova o conteúdo dos poços da placa de ensaio por filtração a vácuo. Seque o excesso de tampão de lavagem do fundo do prato com um absorvente ou toalhas de papel antes de repetir esta etapa mais uma vez.Em seguida, adicione 25 microlitros de anticorpos de detecção a cada poço. Depois de selar a placa com um selador de placa novo, embrulhe toda a placa, incluindo a tampa da placa invertida, com papel alumínio. Coloque a placa em um agitador de placas e agite a aproximadamente 500 RPM por uma hora em temperatura ambiente.Sem aspirar, adicione 25 microlitros de reagente de ficoeritrina estreptavidina diretamente em cada poço. Sele e embrulhe o prato como antes. Em seguida, coloque a placa em um agitador de placas e agite a aproximadamente 500 RPM por 30 minutos em temperatura ambiente.Depois de repetir a etapa de filtração a vácuo duas vezes, adicione 200 microlitros de tampão de lavagem 1X a cada poço. Suspenda novamente as contas em um agitador de pratos por um minuto. Usando uma pipeta multicanal, transfira as amostras da placa filtrante para os tubos FACS para ler as amostras em um citômetro de fluxo.Inicie o citômetro de fluxo e o software de aquisição de acordo com as instruções do fabricante fornecidas com o instrumento. Crie um gráfico de pontos com dispersão direta no eixo X e dispersão lateral para o eixo Y. Defina a dispersão para frente e a dispersão lateral para o modo linear.Agite o frasco de contas cruas incluídas no kit por 30 segundos para ressuspender as contas. Transfira 400 microlitros das esferas brutas para um novo tubo FACS. Defina a taxa de fluxo do citômetro de fluxo para baixo.Execute as contas brutas, ajustando cuidadosamente o ganho e a tensão para dispersão direta e lateral, de modo que as populações de ambos os tamanhos dessas contas sejam visivelmente separadas e fáceis de portar. Ajuste o limite de dispersão direta para excluir eventos indesejados. No gráfico de dispersão direta versus dispersão lateral, desenhe uma porta que inclua todas as populações de contas.Exiba as populações de contas fechadas do gráfico de dispersão direta versus dispersão lateral no gráfico de segundo ponto com PE no eixo X e APC para o eixo Y. Ajuste a tensão PMT para o canal de fluorescência APC para que o sinal APC para todas as populações de esferas tenha uma intensidade de fluorescência mediana, ou MFI, entre 10 e 5.000. Em seguida, vortex o frasco de contas de configuração de PE por 30 segundos para ressuspender as contas.Transfira 400 microlitros dos grânulos de PE ressuspensos para um novo tubo FACS. Substitua o tubo de grânulos crus no citômetro de fluxo pelo tubo de grânulos de PE. Ajuste a tensão do tubo fotomultiplicador para a configuração do canal de fluorescência PE para que o MFI dos grânulos PE fique entre a faixa específica do lote encontrada listada no frasco de grânulos PE.Para realizar a aquisição de dados, defina o número de eventos de bead a serem adquiridos para cerca de 300 por anólito. Vortex cada amostra por cinco segundos antes da análise. Em seguida, leia os exemplos.Ao ler as amostras, defina o citômetro de fluxo para o modo de configuração primeiro e espere até que a população de grânulos esteja estabilizada antes de alternar para o modo de aquisição. Exporte apenas os eventos fechados em vez do total de eventos antes de executar a análise de dados, conforme descrito no protocolo de texto. Curvas padrão representativas para anólitos-alvo foram geradas usando o painel de citocinas T helper de camundongo.Ensaios executados corretamente demonstrarão curvas com amplas faixas dinâmicas, conforme mostrado aqui. Curvas padrão devem ser executadas cada vez que o ensaio é realizado. Esplenócitos de camundongos foram cultivados sob várias condições por 48 horas.Os sobrenadantes da cultura foram coletados e, em seguida, as concentrações de 13 alvos foram quantificadas usando o painel de citocinas T auxiliares de camundongo. Os perfis diferenciais de expressão de citocinas, em resposta às condições de estimulação, são claramente visíveis. Uma vez dominado, o trabalho de bancada de laboratório desta técnica pode ser concluído em menos de cinco horas e meia, se executado corretamente.Os tempos de aquisição de dados e análise a jusante variam de acordo com o número de amostras. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como empregar este protocolo, quantificar as concentrações de anólitos em amostras biológicas usando um imunoensaio citométrico baseado em esferas. Isso inclui preparação de reagentes, etapas de incubação e configuração de citômetro de fluxo para aquisição de dados.

multiplex-cytokine-profiling-stimulated-mouse-splenocytes-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este procedimento descreve a detecção e isolamento de leucócitos do mouse TH17 que ativamente secretam IL-17 com a estimulação.

Detecção e isolamento de células viáveis ​​rato IL-17 Secretoras de T

Este vídeo demonstra um imunoensaio multiplex baseado em esferas para quantificar vários alvos de citocinas em uma amostra. Uma mistura de microesferas distintas conjugadas a anticorpos específicos de citocinas é usada para ligar as citocinas presentes na amostra. Os repórteres marcados com estreptavidina são imobilizados nas citocinas ligadas usando anticorpos de detecção biotinilados. A citometria de fluxo identifica as citocinas ligadas com base nos tamanhos únicos e nas intensidades de...

Um imunoensaio multiplex baseado em grânulos para quantificar vários alvos de citocinas

Apresenta-se no presente estudo, um ensaio baseado em fluorescência de novo utilizando linfócitos derivados de um ratinho transgénico. Este ensaio é adequado para rastreio de alto rendimento (HTS) de pequenas moléculas dotadas com a capacidade de qualquer inibição ou promoção da activação dos linfócitos.

A Fluorescência baseada em Linfócitos ensaio adequado para high-throughput screening de pequenas moléculas

Análise do filme lacrimal citocinas ajuda no estudo de várias doenças oculares. Grânulo baseado multiplex ensaios são simples e sensível e permitem o teste de alvos múltiplos em amostras com volumes pequenos. Aqui descrevemos um protocolo para lágrima filme cytokine perfis usando o um grânulo baseado multiplex do ensaio.

Grânulo baseado Multiplex ensaio para análise de perfis de citocinas lágrima

Aqui nós descrevemos uma abordagem proteômica de célula única para avaliar imunológico fenotípico e funcional (indução de citocinas intracelulares) alterações nas amostras de sangue periférico, analisadas através de citometria de massa.

Análise de célula única do imunofenótipo e produção de citocinas no sangue periférico através de citometria de massa

O uso de reagentes de referência para ensaio de liberação de citocinas permite perfis de segurança in vitro mais reprodutíveis e padronizados de anticorpos monoclonais imunoterapêuticos. Aqui, descrevemos como os ensaios de liberação de citocinas podem ser usados juntamente com um painel de reagentes de referência para prever a segurança de alguns anticorpos monoclonais terapêuticos.

Usando reagentes de referência para confirmar a robustez dos ensaios de liberação de citocinas para a previsão da segurança do anticorpo monoclonal

O protocolo descreve uma plataforma microfluídica avançada para medir quantitativamente a dinâmica da secreção de citocinas de células mononucleares individuais do sangue periférico humano. A plataforma mede até três citocinas em paralelo (IL-6, TNFα e IL-1β) para cada célula individual estimulada com lipopolissacarídeo como exemplo.

Abordagem microfluídica para resolver a secreção simultânea e sequencial de citocinas de células polifuncionais individuais 

Os imunoensaios baseados no sangue total fornecem uma ferramenta fácil e eficiente em termos de recursos para analisar a imunidade específica do antígeno para fins de diagnóstico e pesquisa. Este artigo fornece um protocolo otimizado baseado em sangue total com co-estimulação dupla para análise abrangente da imunidade do hospedeiro a patógenos fúngicos e virais, incluindo uma versão de baixo volume para pacientes pediátricos e pequenos animais.

Ensaio de sangue total com coestimulação dupla para análise específica do antígeno da imunidade do hospedeiro a patógenos fúngicos e virais

Este relatório descreve um protocolo automatizado para ensaios de imunofluorescência multiplex (mIF) em um corador de lâmina automatizado. Ele demonstra a alta reprodutibilidade da proteômica espacial em autocorantes de tecido padrão de alto rendimento e imageadores de fluorescência de lâmina inteira, o que é ideal para ensaios mIF personalizados em um grande número de lâminas de tecido em pesquisa translacional.

Ensaios automatizados de imunofluorescência multiplex de alto rendimento para pesquisa translacional

Desenvolvemos um protocolo rápido, sensível e reprodutível para o perfil de expressão gênica de patógenos durante uma infecção.

Gene Expression Profiling de micróbios Contaminando utilizando uma plataforma digital de codificação em barra

Aprenda a quantificar múltiplas citocinas simultaneamente em sobrenadantes de esplenócitos de camundongo estimulados usando imunoensaio multiplex baseado em micropartículas e citometria de fluxo. Este método permite analisar perfis citocínicos específicos para compreender respostas imunes em diferentes contextos de doenças.

Multiplexar Cytokine perfilação de Mouse estimulada Splenocytes usando uma plataforma baseada em Cytometric Bead imunoensaio

Explorar mais vídeos