Multiplexar Cytokine perfilação de Mouse estimulada Splenocytes usando uma plataforma baseada em Cytometric Bead imunoensaio

O objetivo geral deste protocolo é quantificar vários alvos de citocinas simultaneamente em sobrenadantes de cultura de tecidos coletados de esplenócitos de camundongos estimulados usando um imunoensaio multiplex baseado em esferas e um citômetro de fluxo. Este método pode ser usado para responder a questões-chave no campo da imunologia, como, por exemplo, quais são os perfis exclusivos de citocinas que orquestram a resposta imune no contexto de estados de doença específicos? A principal vantagem desta técnica é que a quantificação simultânea de vários anelídeos pode ser realizada usando muito menos volumes de amostra do que os formatos ELISA tradicionais e, ao mesmo tempo, reduzindo a ligação inespecífica.

Demonstrando o procedimento estará Nicholas Johnsen, um pesquisador associado de nossa equipe de desenvolvimento de produtos. Comece este procedimento com a preparação de amostras biológicas, conforme descrito no protocolo de texto. Para preparar os grânulos pré-misturados imobilizados com anticorpos, sonicar o frasco de grânulos pré-misturados por um minuto em um banho de sonicador à temperatura ambiente.

Em seguida, vórtice por 30 segundos antes de usar. Se nenhum banho de sonicador estiver disponível, aumente o tempo do vórtice para um minuto. Para a preparação padrão, adicione 250 microlitros de tampão de ensaio para reconstituir o coquetel Mouse Th Cytokine Standard liofilizado.

Misture brevemente em vórtice e deixe o frasco para injetáveis descansar em temperatura ambiente por 10 minutos. Transfira o coquetel padrão para um tubo de microcentrífuga de polipropileno identificado como C7. Isso será usado como o padrão superior. Rotule seis tubos de microcentrífuga de polipropileno como C1 a C6. Adicione 75 microlitros de tampão de ensaio a cada um desses tubos.

Em seguida, transfira 25 microlitros do padrão superior, C7, para o tubo C6 e misture bem por vórtice. Este será o padrão C6. Continue realizando diluições seriais de um a quatro, usando uma nova ponta de pipeta para cada tubo para adicionar 25 microlitros do padrão anterior aos 75 microlitros de tampão de ensaio no próximo tubo padrão mais baixo.

Siga cada adição por vórtice. Use o tampão de ensaio como o padrão de zero picogramas por mililitro. Para realizar o ensaio, deixe todos os reagentes aquecerem à temperatura ambiente antes de usar.

Placas filtrantes de polipropileno são usadas nesta demonstração. É absolutamente essencial que a placa seja mantida na vertical durante todo o procedimento de ensaio, incluindo as etapas de lavagem, para evitar a perda dos grânulos. Umedeça previamente o papel de filtro adicionando 100 microlitros de tampão de lavagem 1X a cada poço e deixe as placas descansarem por um minuto em temperatura ambiente.

Remova o volume do buffer usando o coletor de vácuo. Seque o excesso de tampão de lavagem do fundo do prato pressionando o prato em uma pilha de toalhas de papel limpas. Em seguida, coloque a placa em cima da tampa da placa invertida.

Para amostras sobrenadantes de cultura de células, adicione 25 microlitros de tampão de ensaio a todos os poços. Adicione 25 microlitros de cada padrão aos poços padrão. Por fim, adicione 25 microlitros de cada amostra aos poços de amostra.

Vortex as contas misturadas por 30 segundos. Em seguida, adicione 25 microlitros das esferas misturadas a cada poço, agitando o frasco de contas intermitentemente para evitar que as contas se assentem. Sele a placa com um selador de placas.

Depois de selado, embrulhe toda a placa, incluindo a tampa da placa invertida, com papel alumínio. Coloque a placa em um agitador de pratos, prenda-a e agite a aproximadamente 500 RPM por duas horas em temperatura ambiente. Sem inverter, coloque a placa no coletor de vácuo e aplique o vácuo como antes.

Em seguida, adicione 200 microlitros de tampão de lavagem 1X a cada poço. Remova o conteúdo dos poços da placa de ensaio por filtração a vácuo. Seque o excesso de tampão de lavagem do fundo do prato com um absorvente ou toalhas de papel antes de repetir esta etapa mais uma vez.

Em seguida, adicione 25 microlitros de anticorpos de detecção a cada poço. Depois de selar a placa com um selador de placa novo, embrulhe toda a placa, incluindo a tampa da placa invertida, com papel alumínio. Coloque a placa em um agitador de placas e agite a aproximadamente 500 RPM por uma hora em temperatura ambiente.

Sem aspirar, adicione 25 microlitros de reagente de ficoeritrina estreptavidina diretamente em cada poço. Sele e embrulhe o prato como antes. Em seguida, coloque a placa em um agitador de placas e agite a aproximadamente 500 RPM por 30 minutos em temperatura ambiente.

Depois de repetir a etapa de filtração a vácuo duas vezes, adicione 200 microlitros de tampão de lavagem 1X a cada poço. Suspenda novamente as contas em um agitador de pratos por um minuto. Usando uma pipeta multicanal, transfira as amostras da placa filtrante para os tubos FACS para ler as amostras em um citômetro de fluxo.

Inicie o citômetro de fluxo e o software de aquisição de acordo com as instruções do fabricante fornecidas com o instrumento. Crie um gráfico de pontos com dispersão direta no eixo X e dispersão lateral para o eixo Y. Defina a dispersão para frente e a dispersão lateral para o modo linear.

Agite o frasco de contas cruas incluídas no kit por 30 segundos para ressuspender as contas. Transfira 400 microlitros das esferas brutas para um novo tubo FACS. Defina a taxa de fluxo do citômetro de fluxo para baixo.

Execute as contas brutas, ajustando cuidadosamente o ganho e a tensão para dispersão direta e lateral, de modo que as populações de ambos os tamanhos dessas contas sejam visivelmente separadas e fáceis de portar. Ajuste o limite de dispersão direta para excluir eventos indesejados. No gráfico de dispersão direta versus dispersão lateral, desenhe uma porta que inclua todas as populações de contas.

Exiba as populações de contas fechadas do gráfico de dispersão direta versus dispersão lateral no gráfico de segundo ponto com PE no eixo X e APC para o eixo Y. Ajuste a tensão PMT para o canal de fluorescência APC para que o sinal APC para todas as populações de esferas tenha uma intensidade de fluorescência mediana, ou MFI, entre 10 e 5.000. Em seguida, vortex o frasco de contas de configuração de PE por 30 segundos para ressuspender as contas.

Transfira 400 microlitros dos grânulos de PE ressuspensos para um novo tubo FACS. Substitua o tubo de grânulos crus no citômetro de fluxo pelo tubo de grânulos de PE. Ajuste a tensão do tubo fotomultiplicador para a configuração do canal de fluorescência PE para que o MFI dos grânulos PE fique entre a faixa específica do lote encontrada listada no frasco de grânulos PE.

Para realizar a aquisição de dados, defina o número de eventos de bead a serem adquiridos para cerca de 300 por anólito. Vortex cada amostra por cinco segundos antes da análise. Em seguida, leia os exemplos.

Ao ler as amostras, defina o citômetro de fluxo para o modo de configuração primeiro e espere até que a população de grânulos esteja estabilizada antes de alternar para o modo de aquisição. Exporte apenas os eventos fechados em vez do total de eventos antes de executar a análise de dados, conforme descrito no protocolo de texto. Curvas padrão representativas para anólitos-alvo foram geradas usando o painel de citocinas T helper de camundongo.

Ensaios executados corretamente demonstrarão curvas com amplas faixas dinâmicas, conforme mostrado aqui. Curvas padrão devem ser executadas cada vez que o ensaio é realizado. Esplenócitos de camundongos foram cultivados sob várias condições por 48 horas.

Os sobrenadantes da cultura foram coletados e, em seguida, as concentrações de 13 alvos foram quantificadas usando o painel de citocinas T auxiliares de camundongo. Os perfis diferenciais de expressão de citocinas, em resposta às condições de estimulação, são claramente visíveis. Uma vez dominado, o trabalho de bancada de laboratório desta técnica pode ser concluído em menos de cinco horas e meia, se executado corretamente.

Os tempos de aquisição de dados e análise a jusante variam de acordo com o número de amostras. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como empregar este protocolo, quantificar as concentrações de anólitos em amostras biológicas usando um imunoensaio citométrico baseado em esferas. Isso inclui preparação de reagentes, etapas de incubação e configuração de citômetro de fluxo para aquisição de dados.