Compensação de toda a montagem e coloração de Siliques e órgãos de flor de Arabidopsis

Neste protocolo, descrevemos técnicas para a adequada dissecção da Arabidopsis flores e siliques, algumas técnicas básicas de compensação e selecionados coloração procedimentos para observações de toda a montagem de estruturas reprodutivas.

Este protocolo descreve como dissecar adequadamente botões de flores, flores e siliques jovens. E a subsequente limpeza de montagem total para diversas técnicas de coloração e observação. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da produção de plantas sexuadas.

Como uma análise mutante constante ou qualquer falha induzida ambiental e experimentalmente no desenvolvimento e função da flor. A principal vantagem dessa técnica é permitir a triagem fácil e rápida de muitos estágios de desenvolvimento simultaneamente. A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas de dissecção de órgãos florais são difíceis de aprender porque exigem conhecimento prévio da anatomia floral e habilidades de dissecação.

Para começar, use uma tesoura pequena para remover flores de plantas sincronizadas. E coloque-os imediatamente em tubos de microcentrífuga individuais, contendo um fixador apropriado. Em seguida, remova o fixador e adicione etanol 70% suficiente para cobrir completamente as amostras.

Retorne as amostras a quatro graus Celsius por pelo menos 24 horas. Em seguida, encha o copo de um relojoeiro com etanol 70% recém-feito e coloque-o em uma pequena placa de Petri para suporte. Em seguida, coloque a inflorescência no vidro do relojoeiro e certifique-se de que esteja totalmente coberta pelo etanol.

Usando uma pinça e uma seringa equipada com uma agulha, disseque a flor sob o microscópio estéreo, separando as sépalas, pétalas e estames. Em seguida, coloque o vidro do relojoeiro de lado e use uma lâmina de vidro para a dissecação final. Mova a amostra para a lâmina e adicione 10 microlitros de etanol a 70% recém-produzido.

Faça cortes em cada lado do carpo, girando-o conforme necessário. Em seguida, remova suavemente as válvulas para expor os óvulos. Faça um pequeno corte afiado para separar metade do tecido transmissor do receptáculo e use uma pinça e uma agulha para separar as duas metades.

Remova o estilete de estigma e o pedúnculo com cortes afiados. Usando a pinça e a agulha, vire e organize suavemente os óvulos ainda presos para obter duas fileiras paralelas. Use um pequeno pedaço de papel mata-borrão para remover o etanol da amostra na lâmina de vidro.

Em seguida, adicione 20 microlitros de solução de limpeza à lâmina. Usando um par de seringas com agulhas hipodérmicas, posicione as amostras e remova quaisquer bolhas de ar restantes. Em seguida, coloque suavemente uma lamínula na lâmina e espere até que a solução de limpeza preencha o espaço entre a lamínula e a amostra.

Coloque a corrediça num suporte deslizante e deixe-a sob a hotte. Então, vamos botões de flores recém-colhidos que estão prestes a abrir com anteras não deiscentes. Em seguida, prepare uma placa de 96 poços com solução Alexander suficiente para submergir totalmente os botões florais.

Remova as sépalas e pétalas para expor as anteras e mergulhe-as na solução de Alexander. Deixe a placa descansar sob a hotte durante uma a três horas. Em seguida, substitua a solução Alexander pela solução de quatro e meio de Herr e incube a placa sob a hotte durante a noite.

No dia seguinte, use uma pinça para mover cuidadosamente os botões limpos para uma nova lâmina. Em seguida, disseque os estames e remova todos os outros tecidos das amostras. Em seguida, prossiga com a limpeza à base de hidrato de cloral e a coloração de limpeza combinada usando a solução de quatro e meio de Herr.

Primeiro mova a flor do copo do relojoeiro para a lâmina e use um mata-borrão para remover o excesso de etanol. Adicione cinco a 10 microlitros de solução DAPI. Usando duas seringas com agulhas hipodérmicas, disseque os estames e remova todos os outros órgãos florais.

Em seguida, libere os grãos de pólen na solução DAPI. Remova todos os detritos do estame da lâmina, garantindo que apenas os grãos de pólen sejam deixados na lâmina. A remoção de todos os detritos de estame da lâmina é a etapa mais crítica para a remoção da exina.

Apenas grãos de pólen devem ser deixados entre a lâmina e a lamínula. Em seguida, coloque uma lamínula na corrediça do rolamento da amostra e adicione a quantidade mínima de solução DAPI necessária para preencher o espaço entre a lâmina e a lamínula. Coloque um dedo indicador suavemente na lamínula e faça um movimento rápido e curto.

Coloque a lâmina em uma caixa humana no escuro a quatro graus Celsius por pelo menos 15 minutos. Em seguida, observe a lâmina sob florescência de campo amplo ou microscopia confocal dentro de 24 horas. Mova a amostra dissecada do vidro do relojoeiro para uma placa de vidro com cavidades preenchidas com 1% de SDS e uma solução de hidróxido de sódio 0,2.

Incube durante a noite em temperatura ambiente. A solução de hidróxido de sódio SDS limpará rapidamente as amostras, fazendo com que pareçam transparentes em poucos minutos. Enxágue cuidadosamente a amostra com água e coloque-a em uma lâmina limpa.

Em seguida, adicione 20 a 40 microlitros de solução de coloração à lâmina. Dependendo do órgão floral a ser analisado e das habilidades do pesquisador, este tratamento de SD pode ser realizado antes, para pesquisadores experientes, ou após a etapa de dissecação, para pesquisadores menos experientes. Em seguida, coloque uma lamínula na lâmina, tomando cuidado para não esmagar a preparação.

Em seguida, coloque todas as lâminas preparadas em uma caixa humana coberta com papel alumínio e incube a quatro graus Celsius por uma hora. Finalmente, observe o espécime sob florescência de campo amplo ou microscopia confocal. Após o procedimento de dissecção, descrito no protocolo, os tecidos desnecessários que podem dificultar as observações são removidos e imagens mais detalhadas são obtidas.

Dependendo do objetivo, a coloração com hidrato de cloral pode ser usada para caracterizar o desenvolvimento inicial da flor em todo o nível do botão floral, meiose e gênese de micro-gomedal na antera, desenvolvimento inicial do óvulo e a especificação da célula-mãe megáspora, desenvolvimento feminino go-medificado ou mesmo invasão do tubo polínico da grade central. A coloração combinada de Alexander e a limpeza de quatro anos e meio de Herr permitem a avaliação do aborto de pólen dentro de um determinado lóculo ou antera como um todo. Enquanto os grãos de pólen viáveis mostram um citoplasma vermelho, os abortados mostram um citoplasma vazio e, eventualmente, têm formato irregular e são totalmente esmagados.

A remoção da exina resulta em um aumento da intensidade de coloração dos núcleos e maiores detalhes da organização da cromatina. O uso de uma limpeza de hidróxido de sódio SDS antes da coloração tornou a inflorescência transparente. E resultou em maior coloração de calose nos tecidos florais.

Revelou acúmulos de calose geralmente difíceis de ver. Como a camada de Callose que separa a célula geradora da célula vegetativa. Mesmo quando os grãos de pólen ainda estavam contidos na antera.

Uma vez dominadas, essas técnicas podem ser feitas em menos de 48 horas, se forem executadas corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que os resultados dependem em grande parte de uma boa preparação da amostra, como usar o fixador adequado, realizar a dissecção adequadamente e isolar o tecido de interesse na lâmina.