Name: Compensação de toda a montagem e coloração de Siliques e órgãos de flor de Arabidopsis (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Aprenda a dissecar flores e siliques de Arabidopsis com técnicas de montagem completa e coloração para observação de estruturas reprodutivas. Este método permite rastrear múltiplos estágios do desenvolvimento floral simultaneamente.

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Este trabalho foi apoiado pela Universidade de Zurique, um IEF Marie Curie Grant (conceder n. TransEpigen-254797 de A.H.), um avançado Grant do Conselho Europeu de investigação (conceder n. Medea-250358 de U.G.) e um projeto de pesquisa e desenvolvimento tecnológico (grant MecanX de U.G.) de SystemsX.ch, a iniciativa Suíça em biologia de sistemas.

1. a flor e a fixação de síliqua
<ol><li>Colheita de flores e siliques de plantas sincronizados na abertura das primeiras flores. Nota: Nas condições experimentais utilizadas aqui, plantas começam a floração aproximadamente 21 dias após o transplante das placas de Murashige e Skoog (MS) para o solo. As sementes são estratificadas por 3 – 4 dias a 4 ° C e germinadas/cultivadas em placas de MS em 22 ° C/16 h luz e 18 ° C/8 h escura por 8 a 10 dias, antes de transplantar as mudas em solo rico em nutrientes em vasos mantidos sob as mesmas condições (Figura 1). O número de repetições varia de acordo com o objetivo específico de investigação, mas é recomendado um mínimo de 5 inflorescências (a partir de 5 plantas individuais) para cada tratamento. Se as flores são a unidade experimental, é recomendado um mínimo de 10 flores por replicar.</li>
	<li>Cortar as inflorescências ou flores (Figura 1E-H), usando uma tesoura pequena (por exemplo, tesoura de unha) e colocá-los imediatamente em um tubo de microcentrifugadora (para fixação única inflorescência/flor) ou um tubo cónico (para fixações coletivas) contendo recém feita do Carnoy, metanol/ácido acético ácido ou fixadores de FPA50 (dependendo da aplicação, veja abaixo) no gelo. Nota: As amostras devem estar completamente mergulhadas no fixador.</li>
	<li>Deixe o tecido dentro do fixador para 4h durante a noite a 4 ° C. Nota: Infiltração de vácuo pode ser usada para acelerar a penetração do fixador no tecido, mas isto pode ser prejudicial para a preservação da estrutura do tecido. Os autores não implementar a infiltração de vácuo.</li>
	<li>Retire o fixador, Adicionar suficiente etanol a 70% para cobrir as amostras e devolvê-los a 4 ° C, durante pelo menos 24 h; as amostras podem ficar indefinidamente nesta solução. Depois de retirar o etanol, dirijam-se para a próxima etapa; dissecação, ou clareira de SDS.</li>
</ol>2. dissecação sob o microscópio estereoscópico
<ol><li>Coloque acabadas etanol a 70% em vidro de um fabricante relógio colocado em um pequeno prato de Petri para apoio.</li>
	<li>
Lugar da inflorescência/flor/síliqua sobre este recém feito fixador e dissecar sob o microscópio estereoscópico usando fórceps e uma seringa com uma agulha.
	<ol>
<li>Use de um criador de relógio vidro ou dispositivo similar que permite que as amostras de estar totalmente coberto com etanol (recomendado) para a dissecação de inflorescências e destruindo os órgãos florais de flores maduras (sépalas, pétalas e estame pode ser dissecado nesta fase ) para evitar o risco de secagem de amostras.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Disse siliques e pequenos botões de flores em um slide, conforme descrito abaixo.
	<ol>
<li>Colocar o vidro do relógio da sua cafeteira com amostras pre-processed de lado e usar um slide normal para a última dissecção.</li>
		<li>Mover a amostra de interesse para o slide e adicionar 10 µ l de etanol a 70% fresco. Trabalhar rapidamente a última dissecção e adicionar 10 µ l de etanol, se necessário, para manter a amostra húmida sem líquido excessivo.</li>
		<li>Para liberar os grãos de pólen de estames, consulte Etapa 5.1. Para dissecação carpelos e óvulos, siga o procedimento descrito na Figura 2. Este procedimento aplica-se a todas as fases de desenvolvimento do carpelo, incluindo o estágio de desenvolvimento do siliques verdes. Nota: Não adicionar etanol se houver suficiente ao reporte de etanol de mover as amostras; dissecar as amostras muito pequenas é muito mais fácil em uma quantidade mínima de líquido. Sempre manter apenas os órgãos de interesse (sépalas, pétalas, estames, carpelos, óvulos, as sementes ou grãos de pólen) no slide. Esse procedimento irá assegurar uma espessura uniforme entre a lâmina e lamela, correspondente à espessura do órgão sob exame, resultando em uma maior homogeneidade e, portanto, a eficiência de exames microscópicos (maior número de espécimes de alvo no mesmo plano focal).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Use um pequeno pedaço de papel mata-borrão para absorver e remover tanto etanol quanto possível. Rapidamente, prossiga para a etapa seguinte (seção 3, 4 ou 6) antes da amostra seca para fora.</li>
</ol>3. com base em hidrato de cloral compensação e compensação combinada de coloração
Nota: Os melhores resultados para a compensação baseada em hidrato de cloral são obtidos com FPA50 fixada de material.
<ol><li>Lugar de 20 µ l de solução de compensação (hidrato de cloral/glicerol, modificado médio do Hoyer, 4½ do Herr ou soluções de IKI-4½ do Herr) no slide espécime-rolamento. Usando um par de seringas com agulhas hypodermal, posicione os espécimes conforme necessário, reduzindo o espaço entre eles e lançando aqueles onde o órgão de interesse virado para baixo. Remova qualquer bolha de ar restante, usando a agulha.</li>
	<li>Baixe uma lamela lateralmente gentilmente colocá-lo, pressionando suavemente e esperar até que a solução de limpeza preenche o espaço entre. Adicione solução de compensação mínima, se necessário, para preencher todo o espaço sob a lamínula.</li>
	<li>Coloque o slide sobre um suporte de corrediça e deixá-lo sob a coifa. Proceda às observações microscópicas após pelo menos 4 h e durante 4 a 5 dias seguintes.</li>
</ol>4. combinado Alexander manchando e Herr 4½ clareira de anteras
Nota: O protocolo original de Alexander baseia-se em liberar os grãos de pólen no slide antes de coloração. Uma eficiente e mais informativo, modificado Alexander manchando e procedimento de compensação são a coloração dos grãos de pólen maduros dentro de anteras maduras mas não-deiscente.
<ol><li>Escolha os botões de flores recém-colhidas que estão prestes a abrir com anteras não-deiscente. Nota: Não tome mais novos botões de flores porque Alexander coloração destina-se a grãos de pólen maduros e não mancha eficientemente imaturos grãos de pólen. É recomendado um mínimo de 5 flores por tratamento de inflorescências e plantas diferentes colhidas.</li>
	<li>Prepare uma placa de 96 poços com solução de Alexander suficiente para submergir uma flor em botão. Expor as anteras, removendo as sépalas e pétalas e mergulhe-os em solução de Alexander. Mantenha as amostras sob a coifa para 1 a 3 h.</li>
	<li>Substitua a solução de Alexander 4½ solução do Herr e coloque a placa de multi bem sob a coifa para uma incubação durante a noite.</li>
	<li>Usando fórceps, mova os botões da flor apurados para um novo slide. Uma vez que pode ocorrer algum reporte solução de Alexandre, use um toalhete de papel para remover tanto clareira solução possível.</li>
	<li>Dissecar os estames e remover todos os outros tecidos. Siga as etapas na seção 3, usando solução de 4½ do Herr.</li>
</ol>5. remover o Exine de grãos de pólen
Nota: Recomendamos o uso de fixador do Carnoy para coloração de DAPI.
<ol><li>Siga os procedimentos de fixação e dissecação descritos nas seções 1 e 2. Até agora, um deve ter um para muitos estames no slide dentro de uma quantidade mínima de etanol a 70%.</li>
	<li>Use um papel mata-borrão para remover o excesso etanol e adicionar 5-10 µ l da solução DAPI. Usando um par de seringas com agulhas, libere os grãos de pólen dentro essa pequena quantidade de solução (por exemplo, usar uma seringa para imobilizar o estame e o outro para liberar os grãos de pólen). Adicione outro 5 µ l de DAPI se a solução secar.</li>
	<li>Remover todos os detritos do estame é uma etapa crítica, tal que somente os grãos de pólen são deixados entre a lâmina e a lamela.</li>
	<li>Local uma lamela sobre a corrediça do espécime-rolamento de abaixá-la para o lado e adicionar a quantidade mínima de solução DAPI necessária para preencher o espaço. Coloque um dedo sobre a lamela, e sem pisar na também muito fazer uma rápida, firme e curta o movimento de deslizamento. Nota: Para medir a força necessária e a amplitude do movimento deslizante, esta etapa deve ser praticada várias vezes, verificar os resultados de cada vez ao microscópio.</li>
	<li>Adicionar a solução DAPI se necessário e melhorar o lugar que o slide em uma caixa úmido no escuro a 4 ° C por 15 min a 1 h. seguir para observar amostras sob campo amplo fluorescência ou microscopia confocal, no prazo de 24 h. Tente combinar este procedimento com SDS de compensação para verificar se ainda mais mentos podem ser obtidos.</li>
</ol>6. sódio Dodecil sulfato (SDS) de compensação
Nota: Dependendo do órgão floral para ser analisado e em habilidades do pesquisador para dissecar espécimes muito macias e pequenas, o tratamento de SDS pode ser realizado antes (por pesquisadores experientes) ou após a dissecação passo (para menos experientes pesquisadores) em metanol-ácido acético fixada material.
<ol><li>Use o vidro de um fabricante relógio, uma lâmina côncava ou um tubo de microcentrifugadora para incubar amostras dissecadas ou não-dissecado em SDS 1% e 0,2 N NaOH solução durante a noite em temperatura ambiente.</li>
	<li>Manuseie com cuidado porque a amostra é muito macia e tem uma aparência transparente. Enxágue várias vezes com água. Nota: Os restos da solução SDS podem levar a precipitação ao adicionar a solução de coloração, por exemplo, anilina azul.</li>
	<li>Para as amostras não-dissecado, siga o procedimento de dissecação descrito na secção 2, usando a água em vez de etanol a 70%. Depois de dissecar o tecido desejado, remover todos os restos e detritos e qualquer excesso de água com um toalhete de papel, em seguida, adicionar 20 a 40 µ l de solução de coloração e proceder com passo 6.5.</li>
	<li>Para amostras dissecadas, cuidadosamente mover a amostra a partir da solução de lavagem e colocá-lo numa lâmina limpa e adicionar 20 a 40 µ l de solução de coloração.</li>
	<li>Coloque delicadamente uma lamela no slide por abaixá-la para o lado. Tome cuidado para não esmagar a preparação. Se o tecido estiver muito mole, lugar nenhum fina separador em entre a lâmina e lamela em seus cantos (por exemplo, fita ou uma lamela quebrada), deixando um espaço de câmara, como entre lâmina e lamela, tal que o lamela não esmaga a amostra.</li>
	<li>Coloque todos os slides dentro de uma caixa úmida, cubra com papel alumínio e coloque-a 4 ° C, durante pelo menos 1 h. seguir para observar a amostra usando widefield fluorescência ou microscopia confocal, no prazo de 24 h.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

A existência de muitos botões de flores dentro de um único inflorescência de Arabidopsis, abrangendo todas as fases do desenvolvimento de flor, oferece uma oportunidade única para estudos vista caracterizar um efeito de um tratamento ou uma característica do desenvolvimento simultaneamente em diferentes fases do desenvolvimento da flor. Um ponto de referência boa entre diferentes plantas individuais é a abertura da primeira flor da inflorescência a principal. As plantas são tratadas de forma a que a floração é s...

Flores estão entre os mais importantes definindo órgãos das angiospérmicas. Plantas apareceu há alguns anos 90 milhões1e diversificou-se tão rápido que sua rápida aparição foi descrita como um "abominável mistério" por Charles Darwin2. Os interesses dos investigadores da planta em desenvolvimento da flor são diversos. Algumas pesquisas centrou-se na compreensão da origem evolutiva da flor como um todo, ou a evolução das propriedades específicas de anatômicas, estruturais e funcionais de flores3,4,5,6 . A alta variação na forma floral e estrutura, bem como os modos de reprodução sexual e assexual, confiando neles, fazer a flor de uma estrutura altamente complexa. Isto levou a diversos esforços para caracterizar as anatomia e características estruturais dos órgãos florais, usando técnicas de microscópica luz e o elétron que poderiam ser combinadas com investigações genéticas e moleculares7. Além disso, como a fonte de frutos e sementes, as flores são de suma importância para a nutrição humana e animal. Portanto, a caracterização de desenvolvimento de flores e frutas tem muitas implicações para a investigação aplicada, incluindo a segurança alimentar de uma população humana crescente e estratégias de conservação ecológica sob uma mudança de ambiente8 , 9 , 10.
Desenvolvimento da flor em Arabidopsis começa com indução de flor e a transformação do meristema vegetativa para uma meristema de inflorescência (grupo de flores). Primordia flor é iniciada lateralmente no flanco do meristema inflorescência11. O primordia órgão floral forma progressivamente em espirais concêntricos de fora para o centro da flor e eventualmente evoluir para sépalas, pétalas, estames e carpelos7. Estes órgãos florais cumprir distinta nutritiva, protetora e funcional (por exemplo, atração de polinizadores) funções em diferentes espécies de plantas, com os órgãos sexuais, sustentando o desenvolvimento de gametófitos masculinos e femininos, respectivamente,12 , 13. os gametófitos, por sua vez, cada diferenciam um par do sexo masculino (esperma) e gametas femininas (ovo e célula central), que unem a dupla fertilização para formar a próxima geração, o zigoto e o endosperma primário, um terminal tecido apoiando o desenvolvimento do embrião14,15. Desenvolvimento de frutos e sementes apoiar o crescimento, maturação e preservação do embrião e, eventualmente, a sua dispersão. Extensas pesquisas tem sido realizada para caracterizar o desenvolvimento de flor e embrião em espécies de plantas diversas, especialmente nas espécies modelo Arabidopsis7,16,17.
Primeiras análises microscópicas de desenvolvimento da flor basearam-se na observação técnicas, tais como a parafina ou resina incorporação e seccionamento, combinado com a luz ou microscopia eletrônica e processamento de amostra demorada. Estas técnicas microscópicas tradicionais eram frequentemente usadas em combinação com as investigações de genéticas moleculares, tais como análises microscópica de mutantes, a localização do RNA por hibridação in situ ou imuno-detecção de proteínas. Recentes progressos em microscopia de fluorescência de campo amplo e confocal, no estado-da-arte em 3D auxiliado por computador imagem análises e o contínuo refinamento dos métodos moleculares que podem ser usados em espécimes de toda a montagem minimamente processados, levou a uma necessidade de técnicas de processamento eficiente e mínimo de amostra que são preferencialmente passíveis de análises quantitativas. Nos últimos anos, tem sido feitos progressos significativos no desenvolvimento de técnicas de compensação em toda a montagem espécime animal. Eles processam a amostra transparente usando reagentes aquosa ou açúcar-à base de ureia (por exemplo, escala, SeeDB, cúbicos)18,19,20, ou removendo seletivamente lipídios (usando o detergente SDS) após incorporação de amostras em hidrogel estável; a remoção de lipídios pode ser alcançado por difusão passiva (por exemplo, modificação clareza protocolo21, pacto-PARS-aros22) ou ativamente por eletroforese (original clareza protocolo23 e PRESTO ACT24). Encorajado por este progresso rápido, também estão surgindo algumas técnicas derivadas para uso em plantas.
Este papel de métodos focado no modelo Arabidopsis, descrevemos o procedimento para a adequada dissecção de botões florais, flores e siliques jovens e a limpeza de toda a montagem amostras para coloração diversa e procedimentos de observação usando clássica ou um recente método de compensação baseada em SDS. Exemplos de amido, callose e mancha de cromatina são dadas. Embora esses procedimentos podem precisar de mais melhorias e adaptações quando usado com outras espécies, esperamos que irão definir o cenário para uma pesquisa mais adicional sobre esses métodos simples, mas essenciais que são o ponto de partida de muitos projetos de pesquisa.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagentes e Materiais</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Scharlau</td><td>ET00102500</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Acético</td><td>Applichem</td><td>A3686,2500</td><td>100% Grau de Biologia</td></tr><tr><td>Molecular Ácido Acético</td><td>Glacial Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td>Grau de Biologia Molecular</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Scharlau ME03062500</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução de formaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Ácido propiônico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81910-250 ml</td><td></td></tr><tr><td>Hidrato de cloral</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15307</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Roth</td><td>3783.1</td><td></td></tr><tr><td>Goma arábica</td><td>Fluka</td><td>51198</td><td></td></tr><tr><td>Ácido láctico</td><td>Fluka</td><td>69773</td><td></td></tr><tr><td>Fenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77607-250ML</td><td>Usamos fenol líquido (use a densidade para encontrar o volume necessário para sua solução)</td></tr> <tr><td>Óleo de cravo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8392-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Roth</td><td>4436.1</td><td></td></tr><tr><td>Iodo</td><td>Fluka</td><td>57665</td><td></td></tr><tr><td>Iodeto de potássio</td><td>Merck</td><td>5043</td><td></td></tr><tr><td>Malaquita Verde</td><td>Fluka</td><td>63160</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fucsina</td><td>Fluka</td><td>84600</td><td></td></tr><tr><td>Laranja G</td><td>Sigma</td><td>7252</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil Sulfato de Sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td>Hidróxido</td></tr><tr><td>de Sódio</td> de Grau de Biologia Molecular <td>Sigma-Aldrich</td><td>71690</td><td></td></tr><tr><td>Di-Hidrogenofosfato de Sódio</td><td>Applichem</td><td>A1047,1000</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de Sódio dibásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>04347</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Applichem</td><td>A2937,1000</td><td></td></tr><tr><td>Calcofluor</td><td>Sigma</td><td>F6259</td><td>Branqueador fluorescente 28</td></tr><tr><td>Auramina</td><td>Chroma</td><td>10120</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>tóxico</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Anilina azul</td><td>Merck</td><td>1275</td><td></td></tr><tr><td>MS médio</td><td>Carolina</td><td>19-57030</td><td></td></tr><tr><td>Substrato rico em nutrientes</td><td>Einheitserde</td><td>ED73</td><td></td></tr><tr><td>Vidro</td><td></td><td></td> do relojoeiro <td>Sem marca específica</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de falcão de 15 ml</td><td>VWR</td><td>62406-200</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Dumond</td><td>Actimed</td><td>0208-5SPSF-PS</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>DUMONT BIOLOGY</td><td>0108-5</td><td></td></tr><tr><td>Seringa</td><td>BD</td><td>BD Plastipak 300013</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Agulha de preparação</td><td>BD</td><td>BD Microlance 304000</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio</td><td>Thermo Scientific</td><td>10143562CE</td><td>bordas</td></tr><tr><td>cortadas Lamínulas</td><td>Thermo Scientific</td><td>DV40008</td><td></td></tr><tr><td>Caixa</td><td></td><td></td> úmida <td>Uma caixa de plástico com papel toalha úmido e suportes de slides dentro</td></tr><tr><td><forte>Nome</forte></td><td><forte>Empresa</forte></td><td><forte>Número de catálogo</forte></td><td><forte>Comentários</forte></td></tr><tr><td><forte>Soluções</forte><</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>forte>Fixadores</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Fixador <td></td><td></td><td>de Carnoy (Farmer's)</td><td>Etanol absoluto: ácido acético glacial, 3:1 (ml:ml)</td></tr><tr><td>Metanol/fixador</td><td></td><td></td> de ácido acético <td>50 % (v/v) de metanol, 10 % (v/v) de ácido acético glacial em água desionizada</td></tr><tr><td>Fixador</td><td></td><td></td> FPA50 <td>Formina, ácido propiónico, etanol a 50%; 5:5:90 (ml:ml:ml)</td></tr><tr><td><forte>Soluções de limpeza</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hidrato de cloral/glicerol</td><td></td><td></td><td>Hidrato de cloral : glicerol : água, 8:1:2 (g:ml:ml). Pode ser usado para todos os estágios de desenvolvimento da flor e para o desenvolvimento da silique com microscopia DIC. O melhor fixador é a</td>Goma Hoyer</tr><tr><td></td><td></td><td>Arábica Modificada</td> FPA50 à base de <td>formalina 7,5 g, hidrato de cloral 100 g, glicerol 5 ml, água 30 ml. Pode ser usado para todos os estágios de desenvolvimento da flor e para o desenvolvimento da silique com microscopia DIC. O melhor fixador é o FPA50</td></tr><tr><td>Herr's 4&frac12</td> à base de formalina; fluido <td></td><td></td> de limpeza <td>Ácido lático, hidrato de cloral, cristais de fenol, óleo de cravo, xileno; 2:2:2:2:1, em peso. Pode ser usado para todos os estágios de desenvolvimento da flor (especialmente para o desenvolvimento do estame) e para o desenvolvimento do silique com microscopia DIC. O melhor fixador é a</td></tr><tr>solução <td></td><td></td> FPA50<td>SDS / NaOH</td> à base de formalina <td>Dilua a SDS e a solução estoque de NaOH a 1% de SDS / 0,2 N NaOH (diluição de 10x). Para todas as fases de desenvolvimento da flor e da sílica. O melhor fixador é o fixador metano/ácido acético; Os outros dois fixadores também podem ser usados. Pode ser combinado com calcofluor, auramina, DAPI e solução de coloração azul de anilina.</td></tr><tr><td>SDS solução-mãe</td><td></td><td></td><td>10 % (m/v) de dodecilo sulfato de sódio. Dissolver 10 g de dodecil sulfato de sódio em 80 ml de água desionizada e completar o volume com água desionizada até 100 ml.</td></tr><tr><td>Solução-mãe</td><td></td><td></td> de NaOH <td>Solução de NaOH 2 N: dissolver 4 g de NaOH em 40 ml de água desionizada e completar o volume de 100 ml com água</td></tr><tr><td><forte>soluções combinadas de limpeza e coloração deionizadas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Herr's IKI-4&frac12;</td><td></td><td></td><td>Para um padrão 4&frac12; (9 g no total) adicionar: 100 mg de iodo, 500 mg de iodeto de potássio. Esta solução de limpeza pode ser usada para todos os estágios de desenvolvimento da flor e para o desenvolvimento da sílica, seja para aumentar o contraste ou para caracterizar a dinâmica do amido. Use FPA50 para análise estrutural e fixador de Carnoy para análise quantitativa de amido.</td></tr><tr><td>Coloração</td><td></td><td></td> Alexander <td>Etanol 95% 10ml, verde malaquita (1% em 95% EtOH) 1 ml, ácido fucsina (1% em ddH2O) 5ml, laranja G (1% em ddH2O) 0,5ml, fenol 5g, hidrato de cloral 5g, ácido acético glacial 2ml, glicerol 25ml . Esta limpeza/coloração sozinha ou em combinação com o 4&frac12 de Herr; solução pode ser usada para avaliar o aborto de pólen em flores com grãos de pólen maduros e tricelulares. É usado em material não fixo recém-cortado.</td></tr><tr><td><forte>Soluções de coloração</solução ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>forteCalcofluor</td><td></td><td></td><td>Calcofluor 0,007% em água (g:ml). Originalmente usado como um branqueador óptico. Pode ser usado para corar celulose, polissacarídeos carboxilados e calose nas paredes celulares. Freqüentemente usado para manchar a parte interna do grão de pólen. Todos os três fixadores podem ser usados com esta solução.</td></tr><tr>Solução <td></td><td></td><td>de auramina</td><td>Auramina 0,01% em água (g:ml). Este corante fluorescente lipofílico pode ser usado para colorir cutículas, cutina e exina, entre outros. Todos os três fixadores podem ser usados com esta solução</td></tr><tr><td>Calcofluor-Mistura</td><td></td><td></td> de <td>auramina Solução de auramina : Solução de Calcofluor, 3:1. Pode ser usado para uma coloração combinada por ambas as soluções. Outras proporções podem ser testadas mantendo uma proporção menor de calcofluor em relação à auramina.</td></tr><tr><td>Solução</td><td></td><td></td> DAPI <td>DAPI 0,4 ug / ml, tampão fosfato de sódio 0,1 M (pH 7), 0,1% Triton-X-100, EDTA 1 mM. Esta solução pode ser usada para corar as propagações cromossômicas durante a meiose masculina e feminina e os núcleos celulares de qualquer tecido. Freqüentemente usado para estudar o desenvolvimento do grão de pólen. Carnoy e metanol / ácido acético são os melhores fixadores para esta solução. Fixadores à base de formaldeído, como o FPA50, podem interferir na coloração. Excitação no UV e emissão máxima em torno de 461 nm.</td></tr><tr><td>Tampão fosfato de sódio (0,1 M)</td><td></td><td></td> <td>Receptor de prótons: 0,2 M Na2HPO4, doador de prótons: 0,2 M NaH2PO4, proporção doador de prótons / receptor de prótons: 1,364 (para pH 7)</td></tr> <tr><td>Solução</td><td></td><td></td> de azul de anilina <td>0,1% (p / v) azul de anilina, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% de glicerol. Esta solução pode ser usada para corar calose e celulose de vários estágios de desenvolvimento (por exemplo, deposição de calose em terads masculinos e femininos, tampões de calose em tubos polínicos). Excitação no UV e emissão máxima em torno de 455. Também pode ser excitado a 514 nm com emissão no vermelho para coloração do conteúdo celular.</td></tr></tbody></table>

compensação de toda a montagem e coloração de siliques e órgãos de flor de arabidopsis

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Devido às suas formidáveis ferramentas para estudos de genéticas molecular, Arabidopsis thaliana é uma das espécies modelo mais proeminentes em biologia vegetal e, especialmente, na biologia reprodutiva de plantas. No entanto, planta morfológica, anatômica e análises ultra-estruturais tradicionalmente envolvem a incorporação demorados e procedimentos para campo claro, varredura e microscopia eletrônica de corte. Recentes progressos em microscopia de fluorescência confocal, estado-da-arte em 3D auxiliado por computador análises microscópicas e o refinamento contínuo de técnicas moleculares para ser usado em amostras de toda a montagem minimamente processadas, conduziu a um aumento da demanda por desenvolvimento de técnicas de processamento de amostra mínima e eficiente. Neste protocolo, descrevemos técnicas para corretamente dissecando Arabidopsis flores e siliques, básicos de técnicas, de compensação e alguns procedimentos de coloração para toda montagem observações de estruturas reprodutivas.

Arabidopsis pertence à família Brassicacea, rolamento inflorescências com flores bissexuais, dispostas em uma panícula (Figura 1). Cada flor tem quatro sépalas, pétalas de quatro, seis estames (quatro longas e dois curtas) e um gineceu syncarpous, consistindo de dois congenitamente carpelos (Figura 1F-H) dispostos em quatro verticilos concêntricos25,26...

Neste protocolo, descrevemos técnicas para a adequada dissecção da Arabidopsis flores e siliques, algumas técnicas básicas de compensação e selecionados coloração procedimentos para observações de toda a montagem de estruturas reprodutivas.

Compensação de toda a montagem e coloração de Siliques e órgãos de flor de Arabidopsis

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Este protocolo descreve como dissecar adequadamente botões de flores, flores e siliques jovens. E a subsequente limpeza de montagem total para diversas técnicas de coloração e observação. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da produção de plantas sexuadas.Como uma análise mutante constante ou qualquer falha induzida ambiental e experimentalmente no desenvolvimento e função da flor. A principal vantagem dessa técnica é permitir a triagem fácil e rápida de muitos estágios de desenvolvimento simultaneamente. A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas de dissecção de órgãos florais são difíceis de aprender porque exigem conhecimento prévio da anatomia floral e habilidades de dissecação.Para começar, use uma tesoura pequena para remover flores de plantas sincronizadas. E coloque-os imediatamente em tubos de microcentrífuga individuais, contendo um fixador apropriado. Em seguida, remova o fixador e adicione etanol 70% suficiente para cobrir completamente as amostras.Retorne as amostras a quatro graus Celsius por pelo menos 24 horas. Em seguida, encha o copo de um relojoeiro com etanol 70% recém-feito e coloque-o em uma pequena placa de Petri para suporte. Em seguida, coloque a inflorescência no vidro do relojoeiro e certifique-se de que esteja totalmente coberta pelo etanol.Usando uma pinça e uma seringa equipada com uma agulha, disseque a flor sob o microscópio estéreo, separando as sépalas, pétalas e estames. Em seguida, coloque o vidro do relojoeiro de lado e use uma lâmina de vidro para a dissecação final. Mova a amostra para a lâmina e adicione 10 microlitros de etanol a 70% recém-produzido.Faça cortes em cada lado do carpo, girando-o conforme necessário. Em seguida, remova suavemente as válvulas para expor os óvulos. Faça um pequeno corte afiado para separar metade do tecido transmissor do receptáculo e use uma pinça e uma agulha para separar as duas metades.Remova o estilete de estigma e o pedúnculo com cortes afiados. Usando a pinça e a agulha, vire e organize suavemente os óvulos ainda presos para obter duas fileiras paralelas. Use um pequeno pedaço de papel mata-borrão para remover o etanol da amostra na lâmina de vidro.Em seguida, adicione 20 microlitros de solução de limpeza à lâmina. Usando um par de seringas com agulhas hipodérmicas, posicione as amostras e remova quaisquer bolhas de ar restantes. Em seguida, coloque suavemente uma lamínula na lâmina e espere até que a solução de limpeza preencha o espaço entre a lamínula e a amostra.Coloque a corrediça num suporte deslizante e deixe-a sob a hotte. Então, vamos botões de flores recém-colhidos que estão prestes a abrir com anteras não deiscentes. Em seguida, prepare uma placa de 96 poços com solução Alexander suficiente para submergir totalmente os botões florais.Remova as sépalas e pétalas para expor as anteras e mergulhe-as na solução de Alexander. Deixe a placa descansar sob a hotte durante uma a três horas. Em seguida, substitua a solução Alexander pela solução de quatro e meio de Herr e incube a placa sob a hotte durante a noite.No dia seguinte, use uma pinça para mover cuidadosamente os botões limpos para uma nova lâmina. Em seguida, disseque os estames e remova todos os outros tecidos das amostras. Em seguida, prossiga com a limpeza à base de hidrato de cloral e a coloração de limpeza combinada usando a solução de quatro e meio de Herr.Primeiro mova a flor do copo do relojoeiro para a lâmina e use um mata-borrão para remover o excesso de etanol. Adicione cinco a 10 microlitros de solução DAPI. Usando duas seringas com agulhas hipodérmicas, disseque os estames e remova todos os outros órgãos florais.Em seguida, libere os grãos de pólen na solução DAPI. Remova todos os detritos do estame da lâmina, garantindo que apenas os grãos de pólen sejam deixados na lâmina. A remoção de todos os detritos de estame da lâmina é a etapa mais crítica para a remoção da exina.Apenas grãos de pólen devem ser deixados entre a lâmina e a lamínula. Em seguida, coloque uma lamínula na corrediça do rolamento da amostra e adicione a quantidade mínima de solução DAPI necessária para preencher o espaço entre a lâmina e a lamínula. Coloque um dedo indicador suavemente na lamínula e faça um movimento rápido e curto.Coloque a lâmina em uma caixa humana no escuro a quatro graus Celsius por pelo menos 15 minutos. Em seguida, observe a lâmina sob florescência de campo amplo ou microscopia confocal dentro de 24 horas. Mova a amostra dissecada do vidro do relojoeiro para uma placa de vidro com cavidades preenchidas com 1% de SDS e uma solução de hidróxido de sódio 0,2.Incube durante a noite em temperatura ambiente. A solução de hidróxido de sódio SDS limpará rapidamente as amostras, fazendo com que pareçam transparentes em poucos minutos. Enxágue cuidadosamente a amostra com água e coloque-a em uma lâmina limpa.Em seguida, adicione 20 a 40 microlitros de solução de coloração à lâmina. Dependendo do órgão floral a ser analisado e das habilidades do pesquisador, este tratamento de SD pode ser realizado antes, para pesquisadores experientes, ou após a etapa de dissecação, para pesquisadores menos experientes. Em seguida, coloque uma lamínula na lâmina, tomando cuidado para não esmagar a preparação.Em seguida, coloque todas as lâminas preparadas em uma caixa humana coberta com papel alumínio e incube a quatro graus Celsius por uma hora. Finalmente, observe o espécime sob florescência de campo amplo ou microscopia confocal. Após o procedimento de dissecção, descrito no protocolo, os tecidos desnecessários que podem dificultar as observações são removidos e imagens mais detalhadas são obtidas.Dependendo do objetivo, a coloração com hidrato de cloral pode ser usada para caracterizar o desenvolvimento inicial da flor em todo o nível do botão floral, meiose e gênese de micro-gomedal na antera, desenvolvimento inicial do óvulo e a especificação da célula-mãe megáspora, desenvolvimento feminino go-medificado ou mesmo invasão do tubo polínico da grade central. A coloração combinada de Alexander e a limpeza de quatro anos e meio de Herr permitem a avaliação do aborto de pólen dentro de um determinado lóculo ou antera como um todo. Enquanto os grãos de pólen viáveis mostram um citoplasma vermelho, os abortados mostram um citoplasma vazio e, eventualmente, têm formato irregular e são totalmente esmagados.A remoção da exina resulta em um aumento da intensidade de coloração dos núcleos e maiores detalhes da organização da cromatina. O uso de uma limpeza de hidróxido de sódio SDS antes da coloração tornou a inflorescência transparente. E resultou em maior coloração de calose nos tecidos florais.Revelou acúmulos de calose geralmente difíceis de ver. Como a camada de Callose que separa a célula geradora da célula vegetativa. Mesmo quando os grãos de pólen ainda estavam contidos na antera.Uma vez dominadas, essas técnicas podem ser feitas em menos de 48 horas, se forem executadas corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que os resultados dependem em grande parte de uma boa preparação da amostra, como usar o fixador adequado, realizar a dissecção adequadamente e isolar o tecido de interesse na lâmina.

whole-mount-clearing-staining-arabidopsis-flower-organs

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

A composição da parede celular vegetal varia entre os tipos de tecido e pode incluir lignina, celulose, hemiceluloses e pectina. Várias técnicas de coloração foram desenvolvidas para visualizar as diferenças no nível do tipo de célula. Este artigo é uma compilação de técnicas de coloração da parede celular comumente usadas.

Coloração histoquímica de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Celular Secundária parede Elements

Nós fornecemos aqui um protocolo eficiente e confiável para a imunocoloração, hibridação in situ fluorescente, a coloração do DNA seguido de quantitativo, imagem de alta resolução em Arabidopsis thaliana óvulos inteiros de montagem. Este método foi utilizado com sucesso para analisar as modificações da cromatina e arquitectura nuclear.

Um método eficiente para Quantitativa, Análise de células Único de cromatina Modificação e Arquitetura Nuclear em Todo-mount óvulos em<em&gt; Arabidopsis</em

A celulose cristalina é um constituinte importante da parede celular da planta. No entanto, sua quantificação em uma resolução celular é tecnicamente desafiadora.  Aqui, relatamos o uso de tecnologia de luz polarizada e seções de choque radicular para obter informações da composição da parede celular em uma resolução espaço-temporal.

Quantificação de alta resolução Celulose cristalina Acumulação em<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Raízes para monitorar celular específico do tecido da parede Modificações

imagem confocal ao vivo fornece biólogos com uma ferramenta poderosa para estudar o desenvolvimento. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para a imagem confocal ao vivo de desenvolver flores Arabidopsis.

Viva Imagem Confocal de Desenvolvimento de Arabidopsis Flores

Este protocolo descreve um método para observar a embriogênese em Arabidopsis através do apuramento ovule, seguido de inspeção de formação padrão de embrião sob um microscópio.

Um método para caracterizar a embriogênese em Arabidopsis

Nós relatamos um método simples e versátil para executar ao vivo-imagem fluorescente de Arabidopsis thaliana folhas durante um período prolongado de tempo. Nós usamos uma Arabidopsis de plantas transgênicas expressando um gene repórter fluorescente sob o controle de um promotor de imunidade-relacionados como um exemplo para ganhar spatiotemporal compreensão das respostas imunes de planta.

Um método versátil para a montagem de Arabidopsis deixa para Intravital imagem de lapso de tempo

Aqui, descrevemos a geração e aplicação de um conjunto de transgénicos Arabidopsis thaliana linhas permitindo expressão inducible, tecido-específica nos três os meristemas principais, a meristema apical de atirar, a meristema apical de raiz e o cambium.

Inducible, expressão de tipo específico de célula em Arabidopsis thaliana mediada através de LhGR Trans-ativação

Aqui, é descrito um método para tornar os tecidos vegetais transparentes, mantendo a estabilidade das proteínas fluorescentes. Esta técnica facilita a imagem profunda de tecidos vegetais limpos sem seção física.

Limpeza Óptica de Tecidos Vegetais para Imagem de Fluorescência

O presente protocolo descreve um método otimizado para a observação histológica de galhas induzidas por Plasmodiophora brassicae. Seções vibratórias de hipocótilos são limpas antes da imagem de fluorescência para estudar o envolvimento de fatores de transcrição e fitohormônios durante a progressão da doença. Este protocolo supera as limitações de incorporação de resina, possibilitando na planta a visualização de proteínas fluorescentes.

Combinando Microscopia de Limpeza e Fluorescência para Visualização de Mudanças na Expressão Gênica e Respostas Fisiológicas a Plasmodiophora brassicae

Aqui, descrevemos um aprimoramento do método semi-in vitro (SIV) para observação da orientação e recepção do tubo polínico em Arabidopsis thaliana, que aumenta a receptividade dos óvulos. O método SIV cum septum de alto rendimento pode ser acoplado a linhagens de marcadores gametófitos e biossensores codificados geneticamente para monitorar o processo dinâmico de fertilização.

Imagem ao vivo da recepção do tubo polínico de Arabidopsis e dupla fertilização usando o método semi-in vitro do septo de cum

Um método aprimorado para medir o perfil de hidratação polínica em Arabidopsis thaliana é descrito aqui. O novo método oferece maior resolução, não é invasivo e é altamente reprodutível. O protocolo representa uma nova ferramenta para uma dissecação mais fina dos processos que regulam os estágios iniciais da polinização.

Bioensaio de Hidratação Polínica In Vivo de Grão Único de Alta Resolução para Arabidopsis thaliana

Aprenda a dissecar flores e siliques de Arabidopsis com técnicas de montagem completa e coloração para observação de estruturas reprodutivas. Este método permite rastrear múltiplos estágios do desenvolvimento floral simultaneamente.

Compensação de toda a montagem e coloração de Siliques e órgãos de flor de Arabidopsis

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