Métodos de alternativas In Vitro para a determinação da integridade estrutural do capsídeo Viral

O objetivo geral desses métodos é obter uma compreensão mais profunda dos efeitos do tratamento sobre a infectividade ou integridade do capsídeo do norovírus humano. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da inativação de vírus não envelopados, como, por exemplo, o que acontece com a capacidade do capsídeo viral de infectar uma célula após um determinado tratamento.

A principal vantagem desses métodos é que eles podem fornecer uma compreensão mecanicista adicional sobre a ação de qualquer tratamento específico sobre o vírus. Embora este método possa oferecer insights sobre estratégias de inativação do norovírus humano, ele também tem potencial para ser aplicado a outros vírus não envelopados, como o rinovírus ou o vírus da hepatite A.

Para começar, dilua a proteína principal da cápside do norovírus humano purificada, montada em cápsides, até 50 microgramas por mililitro em solução salina tamponada com fosfato 1X. Utilize um volume máximo de 15 microlitros em tubos PCR individuais com tampa.

Certifique-se de que o tubo contenha pelo menos 600 nanogramas de cápside e de que haja 600 nanogramas de cápside por combinação de ligante de tratamento. Em seguida, aqueça previamente o termociclador à temperatura desejada para o tratamento térmico. Depois, aqueça previamente um termociclador adicional a quatro graus Celsius para resfriamento imediato.

Adicione os tubos com a solução de capsídeo ao termociclador pelo tempo desejado. Após o aquecimento, transfira imediatamente os tubos para o termociclador pré-resfriado a quatro graus Celsius por cinco minutos. Centrifugue brevemente os tubos para recolher todas as gotículas ao fundo do tubo.

Dilua as soluções de capsídeo tratadas e o PBS para três microgramas por mililitro. Certifique-se de que haja pelo menos 200 microlitros da solução de capsídeo tratado diluída. Em seguida, aplique 100 microlitros da solução de capsídeo em cada poço, garantindo que haja pelo menos dois poços por tratamento. Além disso, inclua dois poços controle com 100 microlitros de PBS para cada ligante. Isso fornece a absorbância de fundo do ensaio. Cubra a placa com uma tampa e selar as bordas com filme de parafina para reduzir a evaporação. Deixe a placa durante a noite em um incubador agitador a quatro graus Celsius ou por duas horas à temperatura ambiente.

Após a incubação, remova as soluções de capsídeo tratadas da placa. Em seguida, adicione 200 microlitros por poço de tampão bloqueador. Incube por duas horas à temperatura ambiente ou, selado, a quatro graus Celsius durante a noite.

Enquanto isso, dilua o aptâmero biotinilado até uma concentração de um micromolar em água livre de nucleases. Certifique-se de que haja solução suficiente para um volume total de 200 microlitros para cada tratamento.

Além disso, dilua a HPGA biotinilada escolhida para 30 microlitros por mililitro no tampão de bloqueio. Novamente, certifique-se de que haja solução suficiente para um volume total de 200 microlitros para cada tratamento.

Após a incubação, remova o tampão bloqueador e lave a placa três vezes com 200 microlitros por poço de PBST. Seque a umidade residual batendo suavemente na parte inferior da placa, virada para baixo, sobre toalhas de papel estéreis. Em seguida, adicione 100 microlitros por poço das soluções de ligação do ligante, garantindo dois poços por combinação de ligante e tratamento térmico, e incube a placa coberta em agitador orbital a aproximadamente 60 RPM por uma hora à temperatura ambiente.

Após lavar as placas conforme descrito no protocolo no texto, adicione 100 microlitros por poço de 0,2 microgramas por mililitro de estreptavidina peroxidase do rábano silvestre em PBS.

Incube por 15 minutos à temperatura ambiente com agitação suave em agitador orbital antes de lavar novamente as placas. Em seguida, após outra lavagem, adicione 100 microlitros por poço do substrato TMB e deixe a cor desenvolver por cinco a 15 minutos. Observe os poços quanto à formação de cor.

Certifique-se de desenvolver consistentemente por um tempo igual entre as placas replicadas e esteja atento à faixa de absorbância do leitor de placas utilizado. Interrompa o desenvolvimento da reação com 100 microlitros por poço de ácido fosfórico um molar. Leia imediatamente a placa em 450 nanômetros.

Crie um novo procedimento operacional padrão de tamanho no software do instrumento DLS conforme detalhado no protocolo textual. Em seguida, selecione a seta verde de execução dentro do software e nomeie a amostra.

Dilua as partículas semelhantes a vírus, ou VLPs, de uma para dez em PBS 1X para obter uma concentração final de cinco microgramas por mililitro. Em seguida, filtre a amostra com um filtro de poro de um mícron para remover partículas de poeira. A DLS é muito sensível à poeira, pois partículas grandes dispersam muito mais luz do que partículas pequenas. Transfira 50 microlitros das VLPs diluídas para uma cubeta descartável de pequeno volume. Insira a cubeta na câmara de amostra do instrumento. Inicie a análise e utilize as guias de ajuste cumulante do correlograma e de orientação especializada para avaliar a qualidade dos dados. Durante a análise, verifique se o valor do índice de polidispersidade é inferior a 0,3, o que representa uma medição de qualidade.

No separador Multiview, certifique-se de que o coeficiente de correlação é constante e próximo, mas não superior a um, em um curto espaço de tempo, e que diminui acentuadamente até zero em um momento posterior, característica do tamanho das partículas. Utilize o separador de orientação especializada para obter feedback sobre a qualidade dos dados durante as medições. Após a conclusão da medição, verifique novamente se o índice de polidispersão tem valor inferior a 0,3.

Certifique-se de que a linha de ajuste dos cumulantes acompanha de perto os pontos de dados na guia de ajuste de cumulantes. Crie um novo procedimento operacional padrão de tamanho no software do instrumento de DLS conforme detalhado no protocolo textual. Selecione a seta de execução dentro do software para abrir e nomear uma nova amostra e permita que o instrumento atinja o equilíbrio térmico.

Transfira a suspensão de VLP para uma cubeta de quartzo de pequeno volume, evitando bolhas e pipetando lentamente contra a parede da cubeta. Após o instrumento atingir o equilíbrio térmico, insira a cubeta na câmara de amostra. Após aguardar 10 segundos para que a temperatura da amostra se equilibre, inicie a corrida e simultaneamente comece um cronômetro.

Interrompa o cronômetro ao final da primeira medição. Considere este tempo como o primeiro ponto temporal. Obtenha os pontos temporais subsequentes a partir dos tempos de medição registrados pelo software.

Realize o tratamento térmico como anteriormente, substituindo o PBS por HEPES 10 milimolar, pH 7,4, e não dilua os capsídeos adicionalmente após o tratamento. Em seguida, pipete toda a gota de 15 microlitros da solução de capsídeos tratada sobre filme de parafina. Segure a borda da grade com pinça, permitindo que ela feche sobre a borda para segurar a grade, e posicione a grade com o lado de carbono voltado para baixo sobre a gota da solução tratada.

Deixe a grade incubando por 10 minutos para permitir que o capsídeo se ligue à grade. Dependendo da pureza da preparação do capsídeo, adicione lavagens com a solução de HEPES na forma de gotas de 10 a 15 microlitros colocadas em sequência após a gota de capsídeo tratada. Após 10 minutos, recolha a grade com a gota.

Coloque a grade quase perpendicularmente a um pedaço de papel-filtro para absorver a gota. Em seguida, use a grade para pegar a gota de 10 a 15 microlitros de tampão HEPES e mantenha por 30 segundos. Após 30 segundos de tempo de lavagem, absorva com outro pedaço de papel-filtro.

Em seguida, coloque uma gota de 15 microlitros de solução a dois por cento de acetato de uranila sobre o filme de parafina em uma área vazia. Recolha a gota de acetato de uranila com a grade e mantenha por 45 segundos. Depois, remova por capilaridade o acetato de uranila, certificando-se de eliminar a maior parte da solução.

Coloque a grade com o lado de carbono voltado para cima sobre um pedaço de papel filtro, tomando cuidado para que a grade não adere à umidade das pinças. Em seguida, coloque o papel filtro com a grade sobre ele em uma placa de Petri de vidro aberta. Após repetir este processo para todos os tratamentos, coloque as metades das placas de Petri com as grades em um dessecador durante a noite para secagem antes da observação com MET.

O gráfico a seguir exibe a redução da capacidade de ligação dos capsídeos do norovírus humano ao longo do tempo quando tratados a 68 graus Celsius. Como pode ser observado, a ligação com HPGA é o primeiro sinal a desaparecer completamente. Nesse ponto, presume-se que a grande maioria dos capsídeos na solução perdeu a capacidade de se ligar às HPGA das células hospedeiras e, portanto, não pode ser internalizada pela célula.

A ligação do aptâmero espelha a de HBGA, embora seja necessária uma leve aplicação adicional de calor para remover o sinal. É apresentada aqui uma curva de coeficiente de correlação de DLS representativa de dados de boa qualidade. Em tempos próximos a zero, o correlograma é constante em um valor próximo, mas abaixo de um.

Em seguida, cai acentuadamente para zero em um tempo característico do tamanho da partícula. Os resultados de tamanho obtidos a partir deste experimento provavelmente podem ser confiáveis. Por outro lado, esta curva do coeficiente de correlação é representativa de dados de baixa qualidade.

O correlograma começa em um valor acima de um e diminui gradualmente até zero. Os resultados deste experimento não devem ser utilizados. Aqui, os dados de tamanho de partículas mostram um perfil de agregação claro para capsídeos tratados a 68 graus Celsius, com a formação de superagregados após cerca de 20 minutos.

O momento em que ocorre a superagregação é característico da suscetibilidade das partículas semelhantes ao vírus (VLPs) a esse tratamento. Esta figura mostra os resultados da microscopia eletrônica de transmissão (TEM) para o tratamento térmico de capsídeos de norovírus humano. Aqui, os capsídeos foram submetidos a temperaturas de 60 a 80 graus Celsius, da esquerda para a direita.

Como pode ser observado, a morfologia da cápside muda claramente com o tratamento, já que as cápsides agregam e desnaturam. Um fenômeno semelhante é observado em cápsides tratadas a 68 graus Celsius por zero a 25 minutos.

Uma vez dominadas, essas técnicas podem ser realizadas em um a 24 horas se forem executadas corretamente.

Após seu desenvolvimento, esta técnica proporcionou uma via adicional para pesquisadores na área de virologia de alimentos explorarem os mecanismos e efeitos da inativação sobre o capsídeo de norovírus humanos. Após este procedimento, outros métodos, como RT-PCR em tempo real com e sem pré-tratamento com RNase, eletroforese em gel de SDS de capsídeos virais e ensaios de placa com vírus substitutos cultiváveis, podem ser realizados para obter uma visão mais completa da redução viral após um determinado tratamento. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar a ligação de ligantes, espalhamento dinâmico de luz e microscopia eletrônica de transmissão para obter insights mecanicistas adicionais sobre os efeitos do tratamento de inativação no capsídeo do norovírus humano.

Não se esqueça de que trabalhar com alguns dos reagentes utilizados pode ser perigoso, e precauções, como o uso de equipamento de proteção individual e a adoção das melhores práticas de segurança em laboratório, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.