Métodos de alternativas In Vitro para a determinação da integridade estrutural do capsídeo Viral

O objetivo geral desses métodos é obter mais informações sobre os efeitos de um tratamento na infectividade ou integridade do capsídeo do norovírus humano. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da inativação viral não envelojada. Como o que está acontecendo com a capacidade do capsídeo viral de infectar uma célula após um determinado tratamento.

A principal vantagem desses métodos é que eles podem fornecer informações mecanicistas adicionais sobre a ação de qualquer tratamento sobre o vírus. Embora esse método possa fornecer informações sobre as estratégias de inativação do norovírus humano, ele também tem potencial para ser aplicado a outros vírus não envelopados, como rinovírus ou hepatite, A.To começar, diluir a proteína purificada do norovírus humano do capsídeo principal, montada nos capsídeos a 50 microgramas por mililitro em solução salina tamponada com fosfato 1X. Use um volume máximo de 15 microlitros nos tubos de PCR com tampa individual.

Certifique-se de que o tubo contém pelo menos 600 nanogramas de capsídeo e que há 600 nanogramas de capsídeo por combinação de ligante de tratamento. Em seguida, pré-aqueça o termociclador no tratamento térmico desejado. Em seguida, pré-aqueça um termociclador adicional a quatro graus Celsius para resfriamento imediato.

Adicione os tubos com solução de capsídeo ao termociclador pelo tempo desejado. Após o aquecimento, transfira imediatamente os tubos para o ciclador pré-resfriado de quatro graus Celsius por cinco minutos. Gire brevemente os tubos na centrífuga para levar todas as gotículas para o fundo do tubo.

Diluir as soluções de capsídeo tratadas e PBS para três microgramas por mililitro. Certifique-se de que haja pelo menos 200 microlitros de capsídeo tratado diluído. Em seguida, aplique 100 microlitros de solução de capsídeo em cada poço, certifique-se de que haja pelo menos dois poços por tratamento.

Além disso, inclua dois poços de controle com 100 microlitros de PBS para cada ligante. Isso fornece a absorbância de fundo do ensaio. Cubra a placa com uma tampa e sele as bordas com filme de parafina para reduzir a evaporação.

Deixe a placa durante a noite em uma incubadora agitada a quatro graus Celsius ou por duas horas em temperatura ambiente. Após a incubação, remova as soluções de capsídeo tratadas da placa. Em seguida, adicione 200 microlitros por poço de tampão de bloqueio.

Incube por duas horas em temperatura ambiente ou selado a quatro graus Celsius durante a noite. Enquanto isso, diluir o aptâmero biotinilado a um micromolar em água livre de nuclease. Certifique-se de que haja solução suficiente para 200 microlitros no total para cada tratamento.

Além disso, dilua o HPGA biotinilado escolhido para 30 microlitros por mililitro no tampão de bloqueio. Novamente, certifique-se de que haja solução suficiente para um volume total de 200 microlitros para cada tratamento. Após a incubação, remova o tampão de bloqueio e lave a placa três vezes com 200 microlitros por poço de PBST.

Bata o prato de cabeça para baixo em toalhas de papel esterilizadas para secar a umidade residual. Em seguida, a 100 microlitros por poço das soluções de ligação ao ligante, garantindo que haja dois poços por combinação de ligante de tratamento térmico, incube a placa coberta em um agitador orbital a cerca de 60 RPM por uma hora em temperatura ambiente. Após a lavagem dos poços, conforme descrito no protocolo de texto, adicione 100 microlitros por poço de 0,2 microgramas por mililitro de estreptavidina, peroxidase de rábano e PBS.

Incube por 15 minutos em temperatura ambiente com agitação suave em um agitador orbital antes de lavar os poços novamente. Então, após outra lavagem, adicione 100 microlitros por poço de substrato TMB e deixe a cor se desenvolver por cinco a 15 minutos. Observe os poços para obter cores.

Certifique-se de desenvolver consistentemente pelo mesmo tempo entre as placas replicadas e esteja ciente da faixa de absorbância do leitor de placas usado. Pare o desenvolvimento da reação com 100 microlitros por poço de um ácido fosfórico molar. Leia imediatamente a placa a 450 nanômetros.

Crie um novo procedimento operacional padrão de tamanho no software do instrumento DLS, conforme detalhado no protocolo de texto. Em seguida, selecione a seta verde de execução no software e nomeie a amostra. Dilua as partículas semelhantes a vírus tratadas termicamente ou VLPs de um a 10 em 1X PBS para concentração final de cinco microgramas por mililitro.

Em seguida, filtre a amostra com um tamanho de poro de um mícron para remover as partículas de poeira. O DLS é muito sensível à poeira, pois partículas grandes espalham muito mais luz do que partículas pequenas. Transfira 50 microlitros das VLPs diluídas para uma cubeta descartável de pequeno volume.

Insira a cubeta na câmara de amostra do instrumento. Inicie a execução e use as guias de ajuste cumulante do correlogram e conselhos de especialistas para avaliar a qualidade dos dados. Durante a execução, verifique se o polidisperso do valor do índice é menor que 0,3, representando uma medida de qualidade.

Na guia multivisualização, certifique-se de que o coeficiente de correlação seja constante e próximo, mas não mais do que um em um curto período de tempo e caia drasticamente em zero em um momento posterior, característico do tamanho da partícula. Use a guia de aconselhamento especializado para obter feedback sobre a qualidade dos dados durante as medições. Após a conclusão da medição, verifique novamente se o polidisperso do valor do índice é inferior a 0.3.

Certifique-se de que a linha de ajuste do cumulante siga os pontos de dados de perto na guia de ajuste dos cumulantes. Crie um novo procedimento operacional padrão de tamanho no software do instrumento DLS, conforme detalhado no protocolo de texto. Selecione a seta de execução no software para abrir e nomear uma nova amostra e permitir que o instrumento atinja o equilíbrio de temperatura.

Transfira a suspensão VLP para uma cubeta de quartzo de pequeno volume, evite bolhas e pipete lentamente contra a parede da cubeta. Depois que o instrumento atingir o equilíbrio de temperatura, insira a cubeta na câmara de amostra. Depois de esperar 10 segundos para que a temperatura da amostra se equilibre, inicie a corrida e, simultaneamente, inicie um cronômetro.

Pare o cronômetro no final da primeira medição. Tome este tempo como o primeiro ponto de tempo. Obtenha pontos de tempo subsequentes a partir dos tempos de medição registrados pelo software.

Realize o tratamento térmico como antes, exceto substitua PBS por heaps de 10 milimolares, pH 7,4 e não dilua mais os capsídeos após o tratamento. Em seguida, pipete toda a gota de 15 microlitros da solução de capsídeo tratada em filme de parafina. Agarre a borda da grade com uma pinça, permitindo que elas fechem na borda para segurar a grade e coloque o lado de carbono da grade voltado para baixo em cima da gota da solução tratada.

Deixe a grade incubada por 10 minutos para permitir que o capsídeo se prenda à grade. Dependendo da pureza da preparação do capsídeo, adicione lavagens da solução heap na forma de gotículas de 10 a 15 microlitros colocadas em linha após a gota do capsídeo tratada. Após 10 minutos, pegue a grade com a gota.

Coloque a grade quase perpendicular a um pedaço de papel de filtro para absorver a gota. Em seguida, use a grade para pegar a gota de 10 a 15 microlitros de buffer de pilhas e segure-a por 30 segundos. Após 30 segundos de tempo de lavagem, retire o pavio com outro pedaço de papel de filtro.

Em seguida, coloque uma gota de 15 microlitros de solução de acetato de uranila a dois por cento no filme de parafina em uma área vazia. Pegue a gota de acetato de uranila com a grade e segure-a por 45 segundos. Em seguida, retire o acetato de uranila, certificando-se de remover a maior parte da solução.

Coloque a grade com o lado de carbono voltado para cima em um pedaço de papel de filtro, tomando cuidado para que a grade não grude na umidade da pinça. Em seguida, coloque o papel de filtro com a grade em uma placa de Petri de vidro aberta. Depois de repetir esse processo para todos os tratamentos, coloque as metades da placa de Petri com as grades em um dessecador durante a noite para secar antes de observar com TEM.

O gráfico a seguir mostra a redução da capacidade de ligação dos capsídeos de norovírus humano ao longo do tempo quando tratados a 68 graus Celsius. Como pode ser visto, a ligação HPGA é o primeiro sinal a desaparecer completamente. Neste ponto, supõe-se que a grande maioria dos capsídeos na solução perdeu a capacidade de se ligar a HPGAs da célula hospedeira e, portanto, não pode ser internalizada na célula.

A ligação do aptâmero espelha a do HBGA, embora seja necessário um pouco mais de tratamento térmico para remover o sinal. Aqui está uma curva de coeficiente de correlação DLS representativa de dados de boa qualidade. No tempo próximo a zero, o corlograma é constante em um valor próximo, mas abaixo de um.

Em seguida, cai drasticamente para zero em um momento característico do tamanho da partícula. Os resultados de tamanho deste experimento provavelmente podem ser confiáveis. Por outro lado, essa curva de coeficiente de correlação é representativa de dados de baixa qualidade.

O correlograma começa em um valor acima de um e gradualmente cai para zero. Os resultados deste experimento não devem ser usados. Aqui, os dados de tamanho de partícula mostram um perfil de agregação claro para capsídeos tratados a 68 graus Celsius com superagregados se formando após cerca de 20 minutos.

O momento em que ocorre a superagregação é característico da suscetibilidade das VLPs a esse tratamento. Esta figura visualiza os resultados do MET para tratamento térmico de capsídeos de norovírus humanos. Aqui, os capsídeos estavam sendo tratados a 60 a 80 graus Celsius da esquerda para a direita.

Como pode ser visto, a morfologia do capsídeo muda claramente com o tratamento, à medida que os capsídeos se agregam e se desnaturam. Um fenômeno semelhante é observado para capsídeos tratados a 68 graus Celsius por zero a 25 minutos. Uma vez dominadas, essas técnicas podem ser feitas em uma a 24 horas se forem executadas corretamente.

Após seu desenvolvimento, essa técnica forneceu um caminho adicional para pesquisadores no campo da virologia alimentar explorarem os mecanismos e efeitos da inativação no capsídeo dos norovírus humanos. Após este procedimento, outros métodos, como RT-PCR em tempo real com e sem pré-tratamento com RNase, página STS de capsídeos virais e ensaios de placa com vírus substitutos cultiváveis, podem ser realizados para obter uma visão geral mais completa da redução viral após um determinado tratamento. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como utilizar a ligação do ligante, o espalhamento dinâmico de luz e a microscopia eletrônica de transmissão para obter mais informações mecanicistas sobre os efeitos do tratamento de inativação no capsídeo do norovírus humano.

Não se esqueça de que trabalhar com alguns dos reagentes utilizados pode ser perigoso e precauções como usar equipamentos de proteção individual e seguir as melhores práticas de segurança do laboratório devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.