Name: Análise quantitativa da imunofluorescência toda a montagem das populações do Progenitor cardíaca em embriões de rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Aprenda análise volumétrica quantitativa por imunofluorescência em montagem total para estudar populações de células progenitoras cardíacas em embriões de rato. Este método permite avaliar dinâmicas teciduais durante a organogênese cardíaca com reprodutibilidade automatizada.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH/NHLBI R56 HL128646 e Mindich criança saúde e Instituto de desenvolvimento (MCHDI) em ISMMS (para N.D.). E.B. é suportado por um NIH/NIDCR estágio T32 HD075735. Microscopia e análise de imagem, realizou-se no núcleo microscopia o Icahn School of Medicine, no Monte Sinai, que é suportado em parte pelo Instituto do câncer Tisch no Mount Sinai P30 CA196521 – câncer centro de concessão de apoio.

todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso na escola de medicina Icahn no Monte Sinai e institucional Cuidado Animal.
 1. colheita e processamento de embriões de palco de crescente cardíaca <ol><li>Mate um rato fêmea fértil com um macho garanhão fértil.</li>
	<li>Verificar a presença de uma cópula vaginal plug usando uma sonda sem corte ou fórceps. Meio-dia o dia da deteção do plug é considerada embrionária dia (E) 0,5 (ver figura 1A para a linha do tempo completa). 
	Nota: Plugues devem ser marcadas para de manhã, como eles são perdidos ao longo do dia.</li>
	<li>Na manhã do dia 8 th (E8.25), sacrificar a barragem grávida por inalação de CO 2, ou de acordo com os regulamentos locais e institucionais. 
	Nota: Sincronismo exato pode ser dependente de estirpe e deve ser determinado empiricamente por morfologia.</li>
	<li>Spray no abdômen do mouse com etanol a 70% para limpar a área e minimizar derramamento. Expor as vísceras através da realização de uma incisão abdominal através da pele e a parede do corpo.</li>
	<li>Localizar o útero e remova cuidadosamente o corno uterino inteiro do animal. Comece cortando acima um oviduto, aparar gordura longe do útero enquanto prosseguir até o fim do colo do útero. Atravessar o colo do útero e continuar a extremidade superior das outra oviduto, corte para liberar o útero todo.</li>
	Prato de <li>lugar do útero em um de 10 cm com fosfato tampão salino (PBS, pH 7,4) para lavar o excesso de sangue. Sub disse o útero cortando o mesometrium entre cada deciduum, que contém os embriões. Transferir os embriões para um prato de 6cm com PBS fresco.</li>
	<li>Sob um microscópio de dissecação, use pinça fina (#5) para remover o tecido uterino longe do tecido decidual.</li>
	<li>Usando fórceps, corte cuidadosamente a ponta da metade embrionária do deciduum para revelar o embrião. Beliscar o deciduum para expulsar o embrião e cuidadosamente Retire o embrião.</li>
	<li>Dissecar os tecidos extraembryonic afastados o máximo possível sem danificar a morfologia do embrião ( figura 1B).</li>
	<li>Use uma pipeta de transferência para colocar os embriões em um tubo de 1,5 mL com PBS fresco e colocar no gelo. Repita 1.7-1.9 para os embriões restantes antes de continuar.</li>
	<li>Aspirado PBS e lave uma vez com PBS. Aspire o PBS. 
	Nota: Tente remover PBS tanto quanto possível, sem danificar ou secagem os embriões. Remoção manual de soluções é recomendada em todas as medidas para evitar a perda de embriões.</li>
	<li>Correção de embriões com 4% paraformaldeído (PFA) em PBS por 1h no RT. 
	Nota: Os embriões podem ser corrigidos durante a noite (O/N) em 4 ° C.</li>
	<li>Lavar três vezes com PBS. Manter os embriões em 4 ° C até que esteja pronto para prosseguir com imunofluorescência. 
	Nota: Pausar o ponto. Embriões podem ser armazenados com segurança em PBS a 4 ° C durante várias semanas.</li>
</ol> 2. Coloração de imunofluorescência Nota: as condições de incubação abaixo podem ser ajustadas para acomodar os diferentes interesses. Recomenda-se uso de agitação suave ou balançando para todas as etapas de incubação longos.
<ol><li>Remover PBS e adicionar 1 mL de tampão de bloqueio (saponina de 0,5%, 1% albumina de soro bovino (BSA) em PBS).</li>
	<li>Incubar pelo menos 4 h no RT Isso também pode ser feito O/N em 4 ° C.</li>
	<li>Remover o tampão de bloqueio e adicione a mistura de anticorpo primário, diluída em tampão de bloqueio. Incubar O/N a 4 ° C. 
	Nota: Ver os materiais de seção para descrição de anticorpos utilizados e sugeriu diluições. Diluições de anticorpo devem ser determinadas empiricamente. O uso de Nkx2-5 como uma mancha de referência para o crescente cardíaco é recomendado e é a chave para jusante imagem etapas de análise e segmentação.</li>
	<li>Remover os anticorpos primários por aspiração.</li>
	<li>Lavagem 3 vezes durante 1 h com 0,1% Triton em PBS.</li>
	<li>Remover a lavagem e adicione a mistura de anticorpo secundário diluída em tampão de bloqueio. Incubar durante 3 h no RT. Isso também pode ser feito O/N em 4 ° C.</li>
	<li>Lavagem 3 vezes durante 1 h com 0,1% Triton em PBS. Isso também pode ser feito O/N em 4 ° C.</li>
	<li>Corante de contraste com 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) em PBS durante 10 min. 
	Nota: Este corante de contraste pode realizar simultaneamente com anticorpo secundário.</li>
	<li>Lavar 2 vezes por 5 min cada com 0,1% Triton em PBS.</li>
	<li>Suspender lentamente embriões em meios de montagem anti-desvaneça-se (2% p/v n-propil galato (nPG), 90% glicerol, 1X PBS; Consulte a seção de materiais para mais detalhes). Permitem equilibrar a pelo menos 1 h antes da montagem. Agite delicadamente tubo periodicamente para ajudar embriões cair na solução de antidesvanece-se. 
	Nota: Pausar o ponto. Embriões podem ser armazenados na solução antidesbotamento durante vários dias até que esteja pronto para montagem e imagem.</li>
</ol> 3. Embriões de montagem para microscopia <ol><li>preparar microscópio desliza para a montagem usando fita dupla-pau ou espaçadores do silicone. Se usando fita dupla-pau, fazer duas pilhas paralelas de 5-6 camadas de cerca de 15-20 mm separados. Isso vai deixar espaço suficiente para colocar os embriões e fixar a lamela ( Figura 1).</li>
	<li>Colocar uma gota de 15 µ l de anti-desvaneça-se no slide, entre a fita dupla-pau. Cuidadosamente, transferir um embrião para o slide. 
	Nota: mais de um embrião pode ser colocado em um slide. No entanto, as etapas subsequentes de orientação são mais difíceis com vários embriões, e durações de tempo imagem pode levar ao foto-clareamento.</li>
	<li>Sob um microscópio de dissecação usando pinça fina, posicione o embrião tais que o lado anterior voltado para longe o slide com o eixo do corpo alinhado com o eixo longo do slide. Ver Figura 1 para um esquema da instalação do montagem.</li>
	<li>Cuidadosamente coloque uma lamela sobre a amostra um lado a descansar sobre uma pilha de fita dupla-pau e usando fórceps para Baixe suavemente a lamela até a outra fita entra em contato. 
	Nota: Passos 3.3 e 3.4 são fundamentais para garantir a correta orientação do embrião para a imagem latente. Diminuindo a lamela ao longo da direção anterior do seu posterior, o embrião não deve rolar e região cardíaca crescente vai ficar orientado para longe do slide, que é ideal para a imagem latente em um microscópio invertido.</li>
	<li>Usar uma pipeta para adicionar adicional anti-desvaneça-se entre o slide e lamela para manter a amostra de morrer durante o armazenamento/imagens.</li>
</ol> 4. Imagem latente confocal <ol><li>adquirir imagens com o objetivo de ampliação mais elevado que permite a região inteira cardíaca crescente ser capturado em um campo de visão. Use taxas de amostragem de Nyquist para determinar as dimensões de x-y-z-voxel. A maioria dos fabricantes de microscópio terá um &#34; otimizar &#34; botão para garantir a amostragem de Nyquist. 
	Nota: Mancha para Nkx2-5 é benéfico aqui, como ele vai delinear toda a região cardíaca de crescente. Tamanhos menores de Z-passo (sobreamostragem) produzirá resultados de modelagem 3D de melhor mas pode originar vezes estendida de aquisição e/ou clareadores de algumas amostras.</li>
	<li>Configurar parâmetros usando práticas de melhor imagem padrão de imagem. Ou seja, usar a menor intensidade possível do laser para alcançar boa relação sinal-ruído para cada fluoróforo e escolher ganho e compensar os níveis que geram uma ampla faixa dinâmica sem saturar o sinal. 
	Nota: Ser coerente com a imagem de parâmetros entre as amostras que serão comparadas diretamente. Isto é especialmente importante para análise 3D a jusante e quantificação.</li>
</ol> 5. Análise e modelagem 3D quantitativa de imagem Nota: Para este protocolo, imagens foram analisadas usando o pacote de software hottie. Análise semelhante pode ser possível usando pacotes alternativos. A descrição abaixo abrange o pipeline de análise para um canal de referência (ou seja, Nkx2-5) e um canal experimental (ou seja, YFP). Canais adicionais podem ser analisados através da repetição dessas etapas. Um conjunto de dados de exemplo tem sido desde que pode ser usada para replicar a análise abaixo.
<ol><li>Carregar conjuntos de dados de imagem raw em vista Imaris Arena e abrir arquivo para embrião desejada na exibição Surpass. Dados devem carregar em vista 3D no modo de MIP (máx.). Abra a janela de ajuste de exibição e selecione somente o canal de referência.</li>
	<li>Ajustar o limite da imagem, se necessário para melhor visualização. Para esta análise, ajustar o gamma se a relação sinal-ruído é demasiado baixa para segmentação. 
	Nota: Se executar correção de gama, que são ajustes não-linear, as imagens ajustadas não podem ser usadas para medições de intensidade ou comparações. Nesta fase, você pode executar mais imagem Pre-processing (ou seja, correção de iluminação, Desfoque Gaussiano ou outros filtragem), se sua relação sinal-ruído não é satisfatória. Se você optar por fazer o pre-processamento, você deve executar as mesmas etapas de pré-processamento para todas as imagens em seu dataset.</li>
	<li>Criar uma nova superfície para o canal de referência usando o diálogo de superfície algoritmo.
	<ol><li>Selecione o &#34; apenas uma região de interesse do segmento &#34; checkbox.</li>
		<li>Ajuste a região de caixa delimitadora para que contém a região de interesse (ROI, ou seja, a área cardíaca crescente) como delineados pela mancha referência.</li>
		<li>Selecione o canal de referência no menu suspenso de canal de origem. A configuração padrão para alisar (igual ao tamanho de voxel de z) é geralmente suficiente, mas pode exigir otimização empírica. Para esta análise, usar suavização igual a metade do voxel-tamanho z.</li>
		<li>Executar Limiarização por intensidade absoluta. Para garantir que a superfície não se estende para além do sinal do canal, ajustar o limite inferior usando os controles deslizantes. 
		Nota: Para determinadas imagens onde as células podem ser delineadas facilmente, você pode incluir o &#34; divisão tocando objetos &#34; algoritmo, para separar ainda mais seu sinal de fundo.</li>
		<li>Filtrar objetos por voxel número ou volume e rejeitar a objetos de fundo (pequena ou encontradas em áreas fora da área de Nkx2-5) que o algoritmo pode ter gerado. Terminar o algoritmo.</li>
	</ol></li> <li>Usando a superfície recém criada, criar um canal para o canal experimental de mascarado.
	<ol><li>Com que respeita o selecionado, escolha o &#34; máscara Sel... ͟ &#34; função da janela Edit.</li>
		<li>Selecione o canal experimental de interesse (ou seja, YFP). Certifique-se de que o &#34; duplicar canal antes de aplicar a máscara &#34; esteja selecionada.</li>
	</ol></li> <li>No ajuste de exibição a janela, selecione apenas o canal mascarado. Criar uma nova superfície para o canal mascarado, seguindo os passos 5.3-5.3.5. 
	Nota: Neste ponto pode ser útil ajustar a aparência de cada máscara para facilitar a visualização do modelo 3D: selecione cada superfície e selecione a guia cor ajustar a cor de Base e transparência, conforme necessário. Cores de superfície não mesclar quando se sobrepunham.</li>
	<li>Para obter os dados volumétricos, com cada superfície selecionado selecione a guia estatísticas. No &#34; Detailed &#34; subguia, escolher &#34; valores médios &#34; do menu drop-down. O volume total da superfície pode ser encontrado na coluna soma da tabela gerada. 
	Nota: Se a superfície gerada contém fragmentos errôneos (ou seja, os fragmentos do sinal de fundo não são excluídos durante a segmentação ou áreas descontínuas da superfície principal), pode ser necessário calcular o volume total manualmente, ou filtrar as superfícies por volume ou número de voxels e certifique-se de que apenas os segmentos de sinal são incluídos no cálculo. O volume de cada porção da superfície pode ser encontrado selecionando &#34; todos os valores &#34; de menu drop-down. Ao selecionar cada valor fará a região correspondente aparecer amarelo, o que auxilia na determinação de valores para excluir.</li>
</ol>

<ol><li>Kretzschmar, K., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/abstract/S0092-8674(12)00003-7">Lineage tracing.</a> Cell. 148, 33-45 (2012).</li>
<li>Tam, P., Parameswaran, M., Kinder, S., Weinberger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+allocation+of+epiblast+cells+to+the+embryonic+heart+and+other+mesodermal+lineages%3A+the+role+of+ingression+and+tissue+movement+during+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Camb+Engl%22%5BJournal%5D)">The allocation of epiblast cells to the embryonic heart and other mesodermal lineages: the role of ingression and tissue movement during gastrulation.</a> Dev Camb Engl. 124, 1631-1642 (1997).</li>
<li>Lawson, K., Meneses, J., Pedersen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+of+epiblast+fate+during+germ+layer+formation+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Camb+Engl%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis of epiblast fate during germ layer formation in the mouse embryo.</a> Dev Camb Engl. , 891-911 (1991).</li>
<li>Kinder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orderly+allocation+of+mesodermal+cells+to+the+extraembryonic+structures+and+the+anteroposterior+axis+during+gastrulation+of+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Camb+Engl%22%5BJournal%5D)">The orderly allocation of mesodermal cells to the extraembryonic structures and the anteroposterior axis during gastrulation of the mouse embryo.</a> Dev Camb Engl. 126, 4691-4701 (1999).</li>
<li>Keegan, B. R., Meyer, D., Yelon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+cardiac+chamber+progenitors+in+the+zebrafish+blastula%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Organization of cardiac chamber progenitors in the zebrafish blastula.</a> Development. 131, 3081-3091 (2004).</li>
<li>Saiz, N., Williams, K., Seshan, V., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asynchronous+fate+decisions+by+single+cells+collectively+ensure+consistent+lineage+composition+in+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Asynchronous fate decisions by single cells collectively ensure consistent lineage composition in the mouse blastocyst.</a> Nat Commun. 7, 13463(2016).</li>
<li>Saiz, N., Kang, M., Schrode, N., Lou, X., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Analysis+of+Protein+Expression+to+Study+Lineage+Specification+in+Mouse+Preimplantation+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos.</a> J. Vis. Exp. , e53654(2016).</li>
<li>Cullen-McEwen, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tools+for+analysis+of+the+ureteric+tree+in+the+developing+mouse+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging tools for analysis of the ureteric tree in the developing mouse kidney.</a> Methods Mol. Biol. 1075, 305-320 (2014).</li>
<li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Mount+Dissection+and+Immunofluorescence+of+the+Adult+Mouse+Cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea.</a> J Vis Exp. , (2016).</li>
<li>Calderon, D., Bardot, E., Dubois, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+Early+Heart+Development+to+Instruct+Stem+Cell+Differentiation+Strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Probing Early Heart Development to Instruct Stem Cell Differentiation Strategies.</a> Dev. Dyn. , (2016).</li>
<li>Meilhac, S., Lescroart, F., Blanpain, C., Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+Cell+Lineages+that+Form+the+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect.+Med%22%5BJournal%5D)">Cardiac Cell Lineages that Form the Heart.</a> Cold Spring Harb Perspect. Med. 4, a013888-a013888 (2014).</li>
<li>Kelly, R., Buckingham, M., Moorman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+Fields+and+Cardiac+Morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect.+Med%22%5BJournal%5D)">Heart Fields and Cardiac Morphogenesis.</a> Cold Spring Harb Perspect. Med. 4, a015750-a015750 (2014).</li>
<li>Cai, C. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isl1+Identifies+a+Cardiac+Progenitor+Population+that+Proliferates+Prior+to+Differentiation+and+Contributes+a+Majority+of+Cells+to+the+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Isl1 Identifies a Cardiac Progenitor Population that Proliferates Prior to Differentiation and Contributes a Majority of Cells to the Heart.</a> Dev Cell. 5, 877-889 (2003).</li>
<li>Sbalzarini, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing%3A+Quantifying+is+convincing%3A+Computational+image+analysis+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Anat.+Embryol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing: Quantifying is convincing: Computational image analysis in biology.</a> Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 219, 1-39 (2016).</li>
<li>Myers, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+bioimage+informatics+matters%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Why bioimage informatics matters.</a> Nat. Methods. 9, 659-660 (2012).</li>
<li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing%3F+A+beginners%27+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> J. Cell Biol. 172, 9-18 (2006).</li>
<li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+imaging+software+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Biological imaging software tools.</a> Nat. Methods. 9, 697-710 (2012).</li>
<li>Horn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mind+bomb+1+is+required+for+pancreatic+%CE%B2-cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Mind bomb 1 is required for pancreatic β-cell formation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 7356-7361 (2012).</li>
<li>Bardot, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxa2+identifies+a+cardiac+progenitor+population+with+ventricular+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Foxa2 identifies a cardiac progenitor population with ventricular differentiation potential.</a> Nat Commun. 8, 14428(2017).</li>
<li>Adams, M. W., Loftus, A. F., Dunn, S. E., Joens, M. S., Fitzpatrick, J. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+fluorescence+microscopy+%28LSFM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cytom%22%5BJournal%5D)">Light sheet fluorescence microscopy (LSFM).</a> Curr. Protoc. Cytom. 2015, (2015).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).</li>
<li>Johnson, S., Rabinovitch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+imaging+of+excised+tissue+using+vital+dyes+and+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cytom%22%5BJournal%5D)">Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy.</a> Curr. Protoc. Cytom. , (2012).</li>
<li>Burtscher, I., Lickert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxa2+regulates+polarity+and+epithelialization+in+the+endoderm+germ+layer+of+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Foxa2 regulates polarity and epithelialization in the endoderm germ layer of the mouse embryo.</a> Development. 136, 1029-1038 (2009).</li>
<li>Baron, M. H., Mohn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+embryonic+explant+culture+system+for+analysis+of+hematopoietic+and+vascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Mouse embryonic explant culture system for analysis of hematopoietic and vascular development.</a> Methods Mol. Med. 105, 231-256 (2005).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O protocolo acima descreve uma estratégia para a obtenção de dados quantitativos de imagens de alta qualidade toda montagem imunofluorescência de embriões do rato após a implantação. Quando realizado corretamente, os dados volumétricos 3D gerados através desses passos podem ser usados para a análise comparativa e interseccional de vários domínios dentro do embrião. O sinal de superfície mascarando a abordagem descrita é de uso particular na investigação de populações de células romance em comparação com estruturas de ref...

O estudo da organogênese tem tempo baseou-se na observação de eventos morfogenéticas no desenvolvimento do embrião. Esses estudos dependem frequentemente o uso de corantes fluorescentes ou repórteres de rastreamento linhagem em combinação com rotulagem das populações de referência definido. 1 , comparando a posição relativa desses rótulos, informações podem ser recolhidas na origem, movimento ou derradeira contribuição de uma população de interesse. Transplante e experimentos de mapeamento de destino usam Marcos morfológicos ou injeção de corantes em non-motile linhagens para definir o ponto de partida das células de interesse, que são então examinadas pela contribuição para o embrião desenvolvido. 2 , 3 , 4 , 5 experiências genéticas de linhagem de rastreamento usam o mesmo conceito com alelos repórter bem definidas que são usadas para populações de células rótulo sem manipulação experimental. Chave para essas abordagens é a capacidade de determinar, com alta resolução espacial, os locais de experimental e rótulos de referência. Estas abordagens têm rendido notável progresso no desenvolvimento de pré-implantação e explantes estudos organogênese. 6 , 7 , 8 , 9
Os eventos do desenvolvimento que sustentam a morfogênese de coração têm sido cada vez mais bem descritos nos últimos anos. 10 uma das principais descobertas nesta área de pesquisa é a descrição de um número de populações de progenitor que podem ser distinguidos pela expressão de marcadores exclusivos. 11 estas populações incluem o primeiro e segundo campos de coração (FHF e SHF), que estão presentes dentro do crescente cardíaco no lado anterior do embrião no dia embrionário (E) 8.25 do desenvolvimento do mouse. 12 estas populações são frequentemente examinadas através de uma combinação de microscopia campo amplo, que fornece informações de nível de tecido e seccionamento serial com ensaios de imunofluorescência, que oferece alta resolução celular mas só informações espaciais bidimensionais. 13 assim, enquanto estes estudos avançaram grandemente a nossa compreensão do desenvolvimento do coração, os métodos disponíveis têm limitado na análise quantitativa de profundidade da morfogênese durante esses estágios, criando a necessidade de abordagens examinar o organização dessas populações a nível de todo o organismo.
Os recentes avanços em microscopia confocal e análise de imagem 3D permitem reconstruções algorítmicas de alta resolução e elevado-produção de células e estruturas em situ com relativa facilidade, assim, abrindo o caminho para estudos detalhados do complexo estruturas celulares. 14 com o aumento do poder computacional e o desenvolvimento de algoritmos gerenciamento de grande volume de dados, ambas necessárias para lidar com o aumento exponencial do tamanho da imagem latente conjuntos de dados, análises podem agora ser totalmente automatizadas. 15 análise automatizada de conjuntos de dados de imagem tem a vantagem de ser imparcial, mas só é tão confiável quanto a qualidade do conjunto de dados entrada; é imperativo, então, que as práticas recomendadas são usadas durante a aquisição e pré-processamento de imagem para garantir a mais alta qualidade, a análise imparcial. 16 protocolos podem ser completamente automatizado e compartilhado para reprodutibilidade, e os algoritmos usados pelo software proprietário estão prontamente disponíveis através de bibliotecas para ser usado por cientistas que têm familiaridade com moderna proprietárias ou open source ferramentas de desenvolvedor. 17
O protocolo a seguir explica os passos necessários para executar tal análise em um modelo bem definido da organogênese, a formação do crescente cardíaca durante o desenvolvimento do coração. Especificamente, este protocolo descreve como (1) colheita e dissecar embriões estágio crescente cardíaca, (2) executar toda montagem imunofluorescência para referência (Nkx2-5) e experimental (Foxa2Cre:YFP18,19) marcadores, (3) Prepare-se e os embriões utilizando microscopia confocal, de imagem e, finalmente, (4) analisar e quantificar as imagens resultantes usando abordagens avançadas tridimensionais. Enquanto o crescente cardíaco é usado como um exemplo aqui, com modificações apropriadas, este protocolo pode ser utilizado para análise de várias linhagens em gástrula de embriões adiantados do palco somite.

<table><tbody><tr><td>Sonda romba</td><td>Roboz</td><td>RS-9580</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Roboz</td><td>RS-8100</td><td></td></tr><tr><td>Pinça fina</td><td>Roboz</td><td>RS-5015</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de dissecção</td><td>Roboz</td><td>RS-5912</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>84510</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino Albumina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8022</td><td></td></tr><tr><td>Triton</td><td>RPI</td><td>A4490</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-Nkx2-5</td><td>Santa Cruz</td><td>Biotech sc-8697</td><td>Usado em 1:100-1:500</td></tr><tr><td>Frango anti-GFP</td><td>abcam</td><td>ab13970</td><td>Usado em 1:500</td></tr><tr><td>Coelho anti-Ilhota1</td><td>abcam</td><td>ab109517</td><td>Usado em 1:100</td></tr><tr><td>Coelho anti-Hcn4</td><td>Millipore</td><td>AB5808</td><td>Usado em 1:100</td></tr><tr><td>488 anti-frango</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>703-546-155</td><td>Reconstituído em água e armazenado a -20 & C na concentração final de 50% de glicerol. Usado em 1:500.</td></tr><tr><td>555 anti-cabra</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21432</td><td>Usado a 1:500</td></tr><tr><td>647 anti-coelho</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>711-606-152</td><td>Reconstituído em água e armazenado a -20 &deg; C na concentração final de 50% de glicerol. Usado em 1:500.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>galato de n-propil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2370</td><td>A solução de estoque é de 20% p / v em DMSO. Solução de trabalho preparada misturando 1 parte de PBS 10x com 9 partes de glicerol 100% e adicionando lentamente 0,1 parte de solução estoque.</td></tr><tr><td>Corrediças de microscopia Superfrost Plus</td><td>VWR Scientific</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>lamínulas de 22x22 mm</td><td>VWR Scientific</td><td>48366-227</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 8.4.1</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

análise quantitativa da imunofluorescência toda a montagem das populações do progenitor cardíaca em embriões de rato

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

O uso de técnicas de imagem já avançando contribuiu largamente para nossa maior compreensão do desenvolvimento embrionário. Organogênese e desenvolvimento pré-implantação são duas áreas de investigação que se beneficiaram enormemente destes avanços, devido à alta qualidade dos dados que podem ser obtidos diretamente a partir de imagens de pré-implantação embriões ou ex vivo de órgãos. Enquanto os embriões pré-implantação produziram dados com especialmente alta resolução espacial, estágios posteriores foram menos passíveis de reconstrução tridimensional. Obtenção de dados de alta qualidade 3D ou volumétricos para estruturas embrionárias conhecidas em combinação com mapeamento de destino ou rastreamento de linhagem genética permitirá uma análise mais abrangente dos acontecimentos morfogenéticas ocorrendo durante a embriogênese.
Este protocolo descreve uma abordagem de imunofluorescência toda a montagem que permite a rotulagem, visualização e quantificação de populações de células progenitoras dentro o desenvolvimento crescente cardíaca, uma chave estrutura formada durante o desenvolvimento do coração. A abordagem é projetada de tal forma que ambas as informações de nível de células e tecidos podem ser obtidos. Utilizando microscopia confocal e processamento de imagem, este protocolo permite a reconstrução espacial tridimensional do crescente cardíaca, proporcionando assim a capacidade de analisar a localização e organização das populações específicas progenitor durante nesta fase crítica do desenvolvimento do coração. Importante, o uso de anticorpos de referência permite sucessivo mascaramento do crescente cardíaca e subsequentes medições quantitativas das áreas dentro do crescente. Este protocolo permitirá não só um exame detalhado do desenvolvimento inicial do coração, mas com adaptações deverá ser aplicável à maioria dos sistemas de órgãos na gástrula de embrião somite palco do mouse.

A qualidade dos dados finais e análise depende grandemente (1) a integridade e a morfologia dos embriões dissecados, (2) a utilização de anticorpos de alta especificidade e (3) a instalação adequada dos parâmetros de imagem. Os embriões danificados vão confundir o processo de geração de superfície e dificultam a análise quantitativa. Exemplos de embriões devidamente dissecados e encenados são mostrados na Figura 2B. Os embriões podem ser ainda mais dissecados...

Aqui, descrevemos um protocolo para toda montagem imunofluorescência e baseados em imagem volumétrica análise quantitativa de embriões adiantados de rato de palco. Apresentamos esta técnica como uma poderosa abordagem qualitativa e quantitativamente avaliar estruturas cardíacas durante o desenvolvimento, e propor que seja amplamente adaptável a outros sistemas de órgãos.

Análise quantitativa da imunofluorescência toda a montagem das populações do Progenitor cardíaca em embriões de rato

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

O objetivo geral deste método é avaliar quantitativamente a localização e distribuição das células progenitoras cardíacas durante a organogênese cardíaca. Este método pode ajudar a responder a respostas-chave no campo do desenvolvimento cardíaco, permitindo-nos observar a localização das populações de progenitores cardíacos durante o desenvolvimento embrionário normal. As principais vantagens dessa técnica são que as imagens volumétricas podem fornecer informações quantitativas sobre a dinâmica do nível do tecido e que o pipeline de análise pode ser automatizado para melhorar a reprodutibilidade.Embora esse método forneça informações sobre a organogênese cardíaca inicial, ele também pode ser aplicado ao estudo geral da embriogênese precoce ou à morfogênese de outros órgãos de interesse. Na manhã do oitavo dia embrionário, desinfete o abdômen de camundongos grávidas com 70% de etanol e faça uma incisão abdominal na pele e na parede corporal. Começando acima de um oviduto, disseque cuidadosamente a gordura ao longo da lateral do útero até o colo do útero.Faça uma incisão no colo do útero e continue até a extremidade superior do outro corte do oviduto para liberar todo o útero. Lave o

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Nós descrevemos o uso de um ensaio de células de rato ES base para identificar janelas de tempo crítico para Wnt / β-catenina e ativação do sinal BMP durante a indução cardiogênico. O método fornece uma plataforma padronizada, que quantifica a eficiência confiável cardiogênico, e é aplicável ao estudo de linhagens de célula.

Modificado embrionárias de camundongos com células-tronco Ensaio baseado para quantificar a eficiência de indução cardiogênico

Nós descrevemos uma série de métodos para injectar corantes, os vectores de ADN, vírus e células, a fim de controlar tanto o destino celular e fenótipo das células endógenas e enxertados derivados de células embrionárias ou pluripotentes dentro de embriões de ratinho no dia embrionário (E) 9,5 e as fases posteriores de desenvolvimento.

Rotulagem celular e injeção em Desenvolvimento embrionárias corações do rato

A análise da expressão de proteínas em válvulas embrionárias jovens de camundongos foi dificultada pelo tecido limitado disponível. Este manuscrito fornece um protocolo para preparar proteínas a partir de regiões de válvulas embrionárias de camundongos em desenvolvimento para análise de western blot.

Isolamento de proteínas a partir da Embryonic Rato Coração Região Válvula Desenvolvimento

Mutações que levam a defeitos cardíacos congênitos se beneficiam da investigação in vivo da estrutura cardíaca durante o desenvolvimento, mas estudos estruturais de alta resolução no coração embrionário de camundongos são tecnicamente desafiadores. Aqui apresentamos um método robusto de imunofluorescência e análise de imagem para avaliar estruturas específicas de cardiomiócitos no coração de camundongo em desenvolvimento.

Análise do Cardiomyocyte Desenvolvimento utilizando imunofluorescência em Embryonic Coração do rato

Este protocolo apresenta um método para realizar, de uma única célula quantitativa análise in situ da expressão de proteínas para o estudo especificação das linhagens em embriões de rato pré-implantação. Os procedimentos necessários para a coleta de blastocistos, toda montagem de detecção de imunofluorescência de proteínas, a imagem latente de amostras em um microscópio confocal, e segmentação nuclear e análise de imagem são descritos.

Análise quantitativa da expressão da proteína para estudar Especificação Lineage no mouse Preimplantation Embriões

Descrevemos um protocolo para obter imagens volumétricas de células marcadas com proteínas fluorescentes profundamente dentro de corações embrionários e pós-natais intactos. Utilizando métodos de limpeza de tecido em combinação com coloração de montagem inteira, células marcadas com proteína fluorescente única dentro de um coração embrionário ou pós-natal podem ser visualizadas com clareza e precisão.

Imagiologia Cleared embrionário e pós-natal Corações na resolução de célula única

Neste método, tecidos embrionários cardíacos são cirurgicamente microdissected, dissociado, fluorescente etiquetado e implantou em tecidos embrionários de anfitrião. Isto fornece uma plataforma para estudar a organização do desenvolvimento nível individual ou tecido sob condições hemodinâmicas gravidez ectópica, e/ou alterados parácrina/justácrina ambientes.

Sistema baseado em microinjeção para na implantação de Vivo do Cardiomyocytes embrionárias no embrião aviária

Apresentamos os protocolos para examinar o desenvolvimento de coração de rato usando microscopia epifluorescente de montagem toda em embriões de rato dissecados de ventricular específica MLC-2v-tdTomato repórter bater-em ratos. Este método nos permite visualizar diretamente a cada estágio da formação ventricular durante o desenvolvimento de coração de rato sem métodos histoquímicos trabalho intensivos.

Análise do desenvolvimento de câmara cardíaca durante a embriogênese de rato usando toda montagem de epifluorescência

O objetivo deste método é gerar células progenitoras cardíacas específicas do campo cardíaco in vitro para estudar a especificação de células progenitoras e propriedades funcionais, e para gerar células cardíacas específicas de câmara para modelagem de doenças cardíacas.

In vitro geração de células progenitoras cardíacas específicas do coração do rato

A entrega celular guiada por ultrassom ao redor do local do infarto do miocárdio em camundongos é uma maneira segura, eficaz e conveniente de transplante de células.

Implante de Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidos por Ultrassom em Camundongos Infartados do Miocárdio

Apresentamos um protocolo detalhado para cultura e imagem de embriões de camundongos que permite imagens 3D + tempo de células progenitoras cardíacas. Este kit de ferramentas de vídeo aborda as principais habilidades necessárias para o sucesso da geração de imagens ao vivo, de outra forma difíceis de adquirir de publicações somente de texto.

Imagem ao vivo de progenitores cardíacos precoces no embrião de camundongo

Aprenda análise volumétrica quantitativa por imunofluorescência em montagem total para estudar populações de células progenitoras cardíacas em embriões de rato. Este método permite avaliar dinâmicas teciduais durante a organogênese cardíaca com reprodutibilidade automatizada.

Análise quantitativa da imunofluorescência toda a montagem das populações do Progenitor cardíaca em embriões de rato

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