Análise quantitativa da imunofluorescência toda a montagem das populações do Progenitor cardíaca em embriões de rato

O objetivo geral deste método é avaliar quantitativamente a localização e distribuição das células progenitoras cardíacas durante a organogênese cardíaca. Este método pode ajudar a responder a respostas-chave no campo do desenvolvimento cardíaco, permitindo-nos observar a localização das populações de progenitores cardíacos durante o desenvolvimento embrionário normal. As principais vantagens dessa técnica são que as imagens volumétricas podem fornecer informações quantitativas sobre a dinâmica do nível do tecido e que o pipeline de análise pode ser automatizado para melhorar a reprodutibilidade.

Embora esse método forneça informações sobre a organogênese cardíaca inicial, ele também pode ser aplicado ao estudo geral da embriogênese precoce ou à morfogênese de outros órgãos de interesse. Na manhã do oitavo dia embrionário, desinfete o abdômen de camundongos grávidas com 70% de etanol e faça uma incisão abdominal na pele e na parede corporal. Começando acima de um oviduto, disseque cuidadosamente a gordura ao longo da lateral do útero até o colo do útero.

Faça uma incisão no colo do útero e continue até a extremidade superior do outro corte do oviduto para liberar todo o útero. Lave o excesso de sangue do útero em um prato de 10 centímetros contendo PBS fresco e corte o mesométrio entre cada deciduom. Transfira os embriões para uma placa de seis centímetros contendo PBS fresco sob um microscópio de dissecação e use uma pinça fina número cinco para remover o tecido uterino do tecido decidual.

Em seguida, corte cuidadosamente a ponta da metade embrionária do deciduom para revelar os embriões, beliscando o deciduom para empurrar e puxar cuidadosamente o primeiro embrião para fora. Disseque o máximo possível de tecido embrionário extra sem danificar a morfologia do animal e use uma pipeta de transferência para colocar o embrião em um tubo de 1,5 mililitro contendo PBS fresco no gelo. Quando todos os embriões tiverem sido colhidos, aspire o PBS de cada tubo e lave os embriões com PBS fresco.

Depois de aspirar completamente o PBS de cada tubo, fixe os embriões em paraformaldeído a 4% por uma hora em temperatura ambiente, seguido de três lavagens com PBS fresco e, em seguida, armazene os embriões a quatro graus Celsius. Comece substituindo o PBS por um mililitro de tampão de bloqueio para uma incubação de quatro horas em temperatura ambiente. No final da incubação, substitua o tampão de bloqueio pela mistura de anticorpos primários apropriada e tampão de bloqueio diluído para uma incubação noturna a quatro graus Celsius.

Na manhã seguinte, aspire o excesso de anticorpo e lave os embriões três vezes por uma hora por lavagem em 0,1% de Tritão em PBS. Após a terceira lavagem, adicione a mistura de anticorpos secundários apropriada aos embriões para uma incubação de três horas à temperatura ambiente, seguida de três lavagens, conforme demonstrado. Em seguida, contra-core os embriões com DAPI em PBS por 10 minutos, seguido de duas lavagens de cinco minutos, depois suspenda lentamente os embriões em meio de montagem anti-desbotamento, permitindo que os embriões se equilibrem por pelo menos uma hora com movimentos suaves periódicos para ajudar as amostras a cair na solução.

Antes de montar os embriões, faça duas pilhas paralelas de cinco a seis camadas de fita adesiva dupla com 15 a 20 milímetros de distância em uma lâmina de microscópio por embrião e coloque uma gota de 15 microlitros de meio anti-desbotamento em cada lâmina entre as pilhas de fita. Transfira cuidadosamente um embrião para cada gota e use um microscópio de dissecção e uma pinça fina para posicionar os embriões com os lados anteriores voltados para longe da lâmina e com o eixo do corpo alinhado com o eixo longo das lâminas. Para colocar as lamínulas, primeiro descanse um lado do vidro em uma pilha de fita adesiva dupla e use uma pinça para abaixar suavemente a lamínula até que ela entre em contato com a outra pilha de fita.

É particularmente importante posicionar e montar cuidadosamente os embriões. Os embriões que não estão posicionados corretamente serão muito mais difíceis de visualizar e podem exigir processamento adicional para obter bons dados quantificáveis. Use uma pipeta para adicionar meio antidesbotamento adicional entre a lâmina e a lamínula para evitar que a amostra seque durante a imagem e selecione a objetiva de maior ampliação disponível que permita que toda a região do crescente cardíaco seja capturada em um campo de visão.

Em seguida, configure os parâmetros de imagem usando as melhores práticas de imagem padrão e use as taxas de amostragem de Nyquist para determinar as dimensões do voxel XYZ de cada embrião. Para analisar as imagens do embrião, carregue os conjuntos de dados de imagem bruta no software de análise de imagem apropriado e abra o primeiro arquivo na visualização de superação. Os dados serão carregados em uma visualização 3D no modo de projeção de intensidade máxima.

Abra a janela de ajuste de exibição e selecione apenas o canal de referência. Ajuste o limite da imagem conforme necessário. Se a relação sinal-ruído for muito baixa para segmentação, ajuste a gama.

Seguir as melhores práticas durante a aquisição de imagens é fundamental para obter dados adequados e dependerá da configuração específica da microscopia usada. Se forem necessários ajustes na gama, essas imagens não devem ser usadas para comparar intensidades de fluorescência. Use a caixa de diálogo do algoritmo de superfície para criar uma nova superfície para o canal de referência e marque a caixa de origem de interesse somente do segmento.

Ajuste a região da caixa delimitadora para que ela contenha a região de interesse conforme delineada pela mancha de referência e selecione o canal de referência no menu suspenso do canal de origem. Defina a suavização para metade do tamanho do voxel Z e use os controles deslizantes de limite para ajustar o limite inferior à sua intensidade absoluta para garantir que a superfície não se estenda além do sinal do canal. Filtre os objetos por número de voxel ou volume, rejeitando quaisquer objetos de fundo que o algoritmo possa ter gerado e conclua o algoritmo.

Em seguida, selecione a superfície recém-criada e escolha a função de conjunto de máscaras na janela de edição. Selecione o canal experimental de interesse cuidando para que a caixa de seleção Canal duplicado antes de aplicar a máscara esteja marcada e selecione o canal de máscara somente na janela de ajuste de exibição. Em seguida, crie uma nova superfície, conforme demonstrado.

Para obter os dados volumétricos com cada superfície selecionada, abra a subguia de detalhes na guia de estatísticas e selecione os valores médios no menu suspenso. O volume total da superfície será encontrado na coluna de soma da tabela gerada. Aqui, um embrião embrionário de camundongo do dia 8.25 com células progenitoras cardiovasculares ventriculares positivas para GFP marcadas com um anticorpo crescente anticardíaco, como acabamos de demonstrar, é mostrado.

Depois de selecionar o canal de referência para o tecido corado, a intensidade e a gama são ajustadas antes de iniciar o algoritmo de criação de superfícies. A região de interesse é selecionada e o nível de detalhe da superfície é escolhido. A superfície inicial é limitada para incluir todos os sinais verdadeiros na superfície.

A filtragem é então executada para remover pequenos fragmentos de fundo para produzir uma superfície de referência final. Ao selecionar a superfície de referência, o canal de comparação pode ser duplicado e mascarado. A intensidade e a gama para este canal são ajustadas antes de gerar uma segunda superfície através da mesma sequência de passos.

O volume total de cada superfície é então calculado automaticamente e pode ser comparado quantitativa e visualmente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a qualidade dos embriões dissecados, a eficiência do anticorpo, a orientação de montagem e a configuração da imagem afetam a qualidade dos dados finais. Além desse pipeline de análise quantitativa, outros métodos, como a deconvolução, podem ser realizados para produzir dados qualitativos adicionais.

Após seu desenvolvimento, essa tecnologia abriu caminho para pesquisadores em desenvolvimento cardíaco explorarem a dinâmica de novas populações de progenitores cardíacos durante o início da embriogênese.