Name: Medição da gripe neutralizando Antibody Responses to A(H3N2) vírus em soros humanos por Microneutralization ensaios usando as células MDCK-SIAT1 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Aprenda a medir respostas de anticorpos neutralizantes contra vírus H3N2 em soros humanos usando células MDCK-SIAT1. Este ensaio de microneutralização avalia a imunidade à influenza após vacinação.

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Agradecemos o Dr. Xiuhua Lu, Dr. Feng Liu e MS. Ashley Burroughs da divisão da gripe do CDC para sua revisão crítica e assistência na preparação deste manuscrito. Agradecemos o Dr. Adrian Reber da divisão da gripe do CDC por sua assistência na preparação os gráficos da Figura 3. Por último, agradecemos o Dr. M. Matrosovich, Marburg, Alemanha para fornecer as células MDCK-SIAT1.

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</ol>

Os autores não relatam nenhum conflito de interesses. Os resultados e conclusões contidas nesta publicação são as dos autores e não representam necessariamente as opiniões dos centros para controle de doenças e prevenção e a agência de financiamento.

O ensaio de MN é um dos principais ensaios utilizados para sorologia de gripe para detectar respostas de anticorpos após a infecção da gripe ou vacinação. Títulos gerados a partir de ensaios de MN são usados frequentemente como o resultado primário de muitos estudos de gripe hematológicas. Ensaios de MN são também amplamente utilizados para sero-diagnóstico e avaliação da imunogenicidade da vacina. Internacionais interlaboratório estudos têm sido realizados para comparar os ensaios de MN, realizados em vários laboratório...

Vírus da gripe continuam a causar morbidade e mortalidade na população humana, a cada ano. HA é a glicoproteína de superfície principal de vírus da gripe. Anticorpos neutralizantes direcionamento HA são o principal mecanismo imune que se correlaciona com a proteção da gripe infecção1,2. Ensaios de inibição (HI) de hemaglutinação e ensaios de MN são dois métodos amplamente utilizados para medir respostas de anticorpos no soro humano após gripe infecção ou vacinação3. O ensaio de HI mede anticorpo da inibição da hemaglutinação vírus das células vermelhas do sangue e é considerado um ensaio de substituto. Ao contrário de HI, o ensaio de MN diretamente pode medir os níveis de anticorpos no soro humano que neutraliza a infecção da gripe em culturas de células. Células MDCK são frequentemente usadas no isolamento do vírus da gripe e MN ensaios4.
Vírus da gripe sofrem constantemente deriva antigênica e shift, adquirindo mutações em proteínas HA que podem alterar a especificidade de ligação do receptor do vírus. Desde 2014, novos grupos de A(H3N2) vírus emergiram e continuaram a circular até a temporada atual. A maioria destes vírus pertence ao grupo genético 3C.2a e 3C.3a com base na análise filogenética das proteínas HA. Muitos dos vírus circulantes 3C.2a tinham reduzido a capacidade de hemagglutinate células vermelhas do sangue e, portanto, não podem ser caracterizados por HI ensaios5. Ensaios de neutralização devem ser usados para medir as respostas de anticorpos para esses vírus que não hemagglutinate6. Além disso, estudos têm mostrado que estes vírus A(H3N2) contemporâneas alteraram as propriedades de ligação de receptores em comparação com anteriores A(H3N2) vírus e tendem a se acumular mutações cultura adaptada e polimorfismo quando passadas na cela em vitro culturas de8,7,9. Em comparação com células MDCK convencionais, MDCK-SIAT1 é uma linha de celular desenvolvida por Matrosovich et al . através do transfection estável de células MDCK com cDNA de α2 humano, 6-sialtransferase (SIAT1). Esta linha de célula expressa uma quantidade aumentada de α2, metades 6-siálico galactose e diminuição da quantidade de α2, partes de ácido siálico-3 do que o pai de células MDCK10. Células MDCK-SIAT1 mostraram-se para melhorar as taxas de isolamento de vírus A(H3N2) em relação ao de células MDCK11. Recentemente, Lin et al. relatou-se que para o novo 3C.2a e 3C.3a A(H3N2) gripe vírus humanos, replicações de vírus mais fiel e melhor infecciosidade do vírus foram alcançados quando vírus eram cultivadas em linhas de células MDCK-SIAT1 comparadas com o de células MDCK7. Assim, as células MDCK-SIAT1 são mais adequadas em ensaios de MN para caracterizar respostas de anticorpos para os clusters recentes do vírus A(H3N2).
Aqui descrevemos um ensaio de MN usando células MDCK-SIAT1 para medir respostas de anticorpos para 3C.2a contemporânea e vírus A(H3N2) 3C.3a em soros humanos. Vírus cultivados em células ou ovos podem ser usados neste ensaio. Soros de calor inativada contendo anticorpos neutralizantes primeiro serialmente diluem-se, em seguida incubadas com 100 TCID50/bem de vírus de gripe A(H3N2) para permitir que os anticorpos no sera para ligar ao vírus. Células MDCK-SIAT1 então são adicionadas à mistura de vírus-anticorpo e incubadas por 18-20 h a 37 ° C, 5% de CO2 para permitir que o A(H3N2) vírus infectar células MDCK-SIAT1 e replicar. Após a incubação durante a noite, as placas são fixos e a quantidade de vírus em cada poço é quantificada por um ELISA usando os anticorpos monoclonais antigripe A NP. A detecção de NP indica a presença de infecção pelo vírus e a ausência de anticorpos neutralizantes. Neutralizar o título de anticorpos é definida como a recíproca da maior diluição do soro que fornece a inibição de 50% ≥ de infecciosidade do vírus.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM) com alta glicose</td><td>Ciência da Vida</td><td>11965</td><td>Um componente crítico da Cultura de Células Estéril, Propagação de Vírus e Meio Diluente de Vírus</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA) Fração V, Protase Free</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3117332001</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Ciência da Vida</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Life Science</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin G-418 disulfate salt&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1720-5G&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Science</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Life Science</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>VWR</td><td>67-64-1</td><td>Usado a uma concentração de 80%</td></tr><tr><td>Tampão de Fosfato-Citrato com Perborato de Sódio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBF2806V</td><td></td></tr><tr><td>O-Fenilenodiamina Dicloridrato</td> comprimido <td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBQ1086V</td><td>1 comprimido por 100ml de água de grau de cultura celular</td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A510-P500</td><td>Usado 0,5M concentração final</td></tr><tr><td>Etanol, Desnaturado, 4L</td><td>VWR</td><td>EM-AX0422-3</td><td>Usado a uma concentração de 70%</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Life Science</td><td></td><td></td>1748048</tr><tr><td>RDE II "Seiken"</td><td>Denka Seiken</td><td>370013</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NP mouse monoclonal Ab</td><td>Millipore pool</td><td>MAB 8257 MAB 8258</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG HRP&nbsp;</td><td>KPL</td><td>074-1802</td><td></td></tr><tr><td>Placas de fundo plano de 96 poços</td><td>Thermo Scientific</td><td>3455</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de placas</td><td>Dispositivo molecular</td><td>Spectromax 384 plus</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de cultura de células 162 cm2/Tampa de ventilação</td><td>Corning/VWR</td><td>3151</td><td></td></tr></tbody></table>

medição da gripe neutralizando antibody responses to a(h3n2) vírus em soros humanos por microneutralization ensaios usando as células mdck-siat1

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Anticorpos neutralizantes contra a hemaglutinina (HA) de vírus da gripe são considerados o principal mecanismo imune que se correlaciona com proteção para infecções de gripe. Ensaios de Microneutralization (MN) são frequentemente usados para medir respostas de anticorpos neutralizantes em soros humanos após vacinação gripe ou infecção. Madine Darby Canine renal (MDCK) as células são o substrato de célula comumente utilizada para ensaios de MN. No entanto, atualmente circulam 3C.2a e 3C.3a A(H3N2) gripe adquiriram o vírus alterado especificidade de ligação do receptor. A linhagem de células MDCK-SIAT1 com metades de aumento α-2,6 siálico galactose na superfície provou para fornecer melhorada infecciosidade e replicações mais fiel do que células MDCK convencionais para estes vírus A(H3N2) contemporâneas. Aqui, descrevemos um ensaio de MN usando células MDCK-SIAT1 que foi otimizado para quantificar os anticorpos neutralizantes para estes vírus A(H3N2) contemporâneas. Neste protocolo, soros de calor inativada contendo anticorpos neutralizantes primeiro serialmente diluem-se, em seguida incubadas com 100 TCID50/bem de vírus de gripe A(H3N2) para permitir que os anticorpos no sera para vincular aos vírus. Células MDCK-SIAT1 então são adicionadas à mistura de vírus-anticorpo e incubadas por 18-20 h a 37 ° C, 5% de CO2 para permitir que A(H3N2) vírus infectar células MDCK-SIAT1. Após a incubação durante a noite, as placas são fixos e a quantidade de vírus em cada bem é quantificada por um ensaio imunoenzimático (ELISA) usando antigripe uma cadeia (NP) os anticorpos monoclonais. Neutralizar o título de anticorpos é definida como a recíproca da maior diluição do soro que fornece ≥ 50% de inibição de infecciosidade do vírus.

Determinação da infectividade das populações de vírus é o primeiro passo no ensaio de MN. A Figura 2 ilustra o layout da placa para determinar a TCID50 das populações de vírus. Para reservas de vírus com infecciosidade desconhecida, o vírus pode ser titulado de várias pre-diluições, por exemplo 10-2 e 10-3, a fim de capturar a melhor curva de titulação para calcular a infectividade do vírus. A quantidade de vírus utilizada no ...

Anticorpos neutralizantes gripe correlacionam com proteção de infecções de gripe. Microneutralization ensaios medem anticorpos neutralizantes em soros humanos e são frequentemente utilizados para sorologia humana da gripe. Descrevemos um ensaio de microneutralization usando células MDCK-SIAT1 para medir os anticorpos neutralizantes para contemporâneas 3C.2a e 3C.3a A(H3N2) vírus após vacinação gripe ou infecção.

Medição da gripe neutralizando Antibody Responses to A(H3N2) vírus em soros humanos por Microneutralization ensaios usando as células MDCK-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

O objetivo geral deste ensaio de microneutralização é medir as respostas de anticorpos neutralizantes aos vírus H3N2 Influenza contemporâneos em soros humanos usando células MDCK-SIAT1. Este método pode ser usado para responder a perguntas-chave para avaliar a imunidade à gripe. Por exemplo, pode determinar se a vacinação contra influenza induz respostas suficientes de anticorpos neutralizantes aos vírus H3N2 circulantes, para prevenir a infecção.A principal vantagem dessa técnica é que ela utiliza células MDCK-SIAT1 e ensaios de microneutralização para detectar respostas de anticorpos para redefinir clusters antigênicos de vírus influenza H3N2. Os estoques de vírus devem ser propagados para altos títulos infecciosos antes do uso em ensaios de microneutralização. Comece este procedimento com a propagação do vírus AH3N2 em células MDCK-SIAT1, conforme detalhado no protocolo de texto.No primeiro dia, descongele um frasco de vírus em temperatura ambiente e coloque imediatamente o vírus no gelo. Para testar o vírus em duas diluições iniciais diferentes, primeiro adicione 100 microlitros de vírus a 99 mililitros de diluente de vírus para a pré-diluição de 10:2. Em seguida, adicione 1 mi

measuring-influenza-neutralizing-antibody-responses-to-h3n2-viruses

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Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra ensaios de microneutralização para medir anticorpos neutralizantes usando células renais caninas Madin-Darby que superexpressam ácido siálico ligado a α2,6 em soros humanos. Este ensaio é frequentemente usado para sorologia humana para...

Um ensaio de microneutralização para medir títulos de anticorpos neutralizantes em soro humano

Este vídeo demonstra o ensaio de microneutralização baseado em imagem para analisar as relações antigênicas entre os vírus influenza A e B. Ele fornece uma maneira quantitativa e visual de avaliar a eficácia de anticorpos ou outros tratamentos na prevenção da infecção viral.

Analisando a relação antigênica entre vírus usando um ensaio de microneutralização baseado em imagem

Este vídeo demonstra uma técnica para gerar variantes de escape de anticorpos monoclonais neutralizantes do vírus influenza. A suspensão do vírus neutralizado por anticorpos é injetada em ovos de galinha embrionados para propagar variantes de escape seletivamente. Isso resulta em uma população de vírus predominantemente de variantes de escape, confirmada por meio de um ensaio de hemaglutinação.

Geração de variantes de escape do vírus influenza contra anticorpos neutralizantes

Este vídeo demonstra um ensaio que mede os títulos de anticorpos inibidores da neuraminidase (NA) da influenza em uma amostra de soro. Uma amostra de soro contendo anticorpos contra NA é adicionada a uma placa de micropoços revestida com fetuína. Ao adicionar o vírus, os anticorpos impedem que o NA viral clive a fetuína e exponha sua porção galactose. Uma lectina conjugada com peroxidase é então adicionada, que se liga à galactose exposta. O título de anticorpos inibidores de NA é determinado...

Um ensaio para medir os títulos de anticorpos de inibição da neuraminidase da influenza

Este vídeo demonstra um ensaio de imunofluorescência projetado para medir a neutralização do citomegalovírus humano (HCMV). Anticorpos específicos do vírus são misturados com o vírus e incubados com células de fibroblastos humanos. Os anticorpos neutralizam o vírus, tornando-o incapaz de infectar as células hospedeiras, enquanto os vírus não neutralizados infectam as células. Após a incubação, a extensão da neutralização é determinada quantificando as células infectadas pelo vírus usando...

Um método de imunofluorescência para medir a neutralização do citomegalovírus humano

Descrevemos o ensaio de lectina enzimática (ELLA) para medir os títulos de anticorpos de inibição da neuraminidase (NA) da influenza em soros. O ensaio usa aglutinina de amendoim para quantificar os resíduos de galactose que se tornam acessíveis quando a NA remove o ácido siálico de placas de 96 poços revestidas com fetuína.

Medição de Inibição da Neuraminidase Influenza títulos de anticorpos por Enzyme-linked Lectina Ensaio

Este estudo descreve uma   -Imagem baseada ensaio de micro-neutralização para analisar as relações antigênicas entre vírus. O protocolo emprega um digitalizador de mesa e tem quatro passos, incluindo titulação, a quantificação de titulação, neutralização, e quantificação de neutralização. O ensaio funciona bem com pdm09 corrente circulante vírus influenza A (H1N1), A (H3N2), e B vírus.

Optimização de um Micro-quantitativa Ensaio de neutralização

Os protocolos apresentados descrevem como realizar um ensaio de inibição de hemaglutinação para quantificar os anticorpos específicos de gripe de amostras de soro de destinatários de vacina contra gripe. O primeiro ensaio determina as concentrações de antígeno viral ideal por hemaglutinação. O segundo ensaio quantifica anticorpos específicos da gripe através da inibição da hemaglutinação.

Um ensaio de inibição (HI) de hemaglutinação otimizado para quantificar os anticorpos específicos de gripe

Vírus da influenza A (IAVs) são importantes patógenos respiratórios humanos. Para entender a patogenicidade de IAVs e realizar testes pré-clínicos de vacina romance abordagens, modelos animais, imitando a fisiologia humana são necessários. Aqui, descrevemos técnicas para avaliar a patogênese do IAV, respostas humorais e eficácia de vacina usando um modelo do rato da infecção.

Estudos de vírus da influenza A em um modelo do rato da infecção

Nós descrevemos um método pelo qual podemos identificar resíduos críticos necessários para a ligação de anticorpos monoclonais humanos ou murino que se destinam a hemaglutinina viral do vírus da influenza A. O protocolo pode ser adaptado para outras glicoproteínas de superfície do vírus e suas correspondentes anticorpos neutralizantes.

Geração de variantes de fuga de neutralizar os anticorpos monoclonais de vírus da gripe

Aqui descrevemos um protocolo para empacotamento de pseudovírus e a medição da atividade neutralizante de anticorpos.

Preparação de Vírus da Influenza Aviária H5 Pseudotipados com Método de Transfecção de Fosfato de Cálcio e Mensuração da Atividade Neutralizante de Anticorpos

Aprenda a medir respostas de anticorpos neutralizantes contra vírus H3N2 em soros humanos usando células MDCK-SIAT1. Este ensaio de microneutralização avalia a imunidade à influenza após vacinação.

Medição da gripe neutralizando Antibody Responses to A(H3N2) vírus em soros humanos por Microneutralization ensaios usando as células MDCK-SIAT1 (Vídeo) | JoVE Journal

Medição da gripe neutralizando Antibody Responses to A(H3N2) vírus em soros humanos por Microneutralization ensaios usando as células MDCK-SIAT1

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