Name: Usando o ensaio de ponto para analisar a migração de células de folhas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Aprenda a usar o ensaio de ponto para analisar a migração de folhas celulares coesas em resposta a estímulos do microambiente. Este método reprodutível é valioso para pesquisas em biologia do câncer e reparo tecidual.

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O autor deseja agradecer lucianoteixeira Subramanian, Chang Yi (Jason), Paul Randazzo e Carole Parent para ler e comentar sobre o manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo programa de pesquisa Intramural do Instituto Nacional de câncer, National Institutes of Health.

1. revestimento de pratos (dia 1)
Nota: Certifique-se para não deixar impressões digitais ou sujeira na parte inferior da placa, quando manuseá-lo.
<ol><li>Descongelar o colágeno rato IV no gelo e dilui-lo com 50mm HCl (pH 1,3) para preparar 3 mL de solução 10 µ g/mL colagénio IV. Nota: Colágeno irá precipitar a 37 ° C. Portanto, é importante manter a solução de colágeno em uma baixa temperatura ao descongelamento e trabalhar com ele. Evite ciclos repetidos de congelamento-descongelamento por preparar alíquotas de tamanhos adequado e armazená-los a-80 ° C.</li>
	<li>Adicionar solução de colágeno IV 250 µ l de cada poço de placas de vidro 12-poço fundo e colocá-los em uma caixa plástica de tamanho adequado, apertado-fechamento. Coloque a toalha de papel molhada sobre e ao redor as placas para fabricar uma câmara húmida e fechar a caixa. Incube as placas durante a noite em temperatura ambiente. Nota: Como somente a área de crescimento precisa ser revestida, é suficiente para cobrir apenas o deslizamento da tampa, que é anexado à parte inferior da placa, com solução de colágeno (consulte a Figura 1A, B para um esquema da placa).</li>
	<li>Na manhã seguinte, lave as placas com desionizada H2O duas vezes para remover o tampão e colágeno não-absorvido. Direcionar a água até a borda da placa bem, não à borda formada pela placa inferior e a lamela (se a água é pipetada para esta área que vai espirrar). Secar ao ar livre as placas do capuz de fluxo laminar. Usar placas imediatamente ou armazenar a 4 ° C por até 5 dias. Nota: Linhas celulares diferentes podem exigir diferentes do revestimento, como fibronectina ou colágeno eu.</li>
</ol>2. chapeamento do ponto do ensaio (dia 2)
<ol><li>
Preparar a suspensão de células
	<ol>
<li>Para preparar a suspensão de células, use as células que têm sido cultivadas em um prato de cultura de tecido-60mm em DMEM/F12 suplementado com 5% de soro de cavalo a confluência de 80%</li>
		<li>Enxagúe as células com solução salina tamponada fosfato de cálcio e magnésio livre Dulbecco (DPBS) uma vez, adicionar 500 µ l do trypsin-EDTA (temperatura ambiente) e incube as celulas por 3-5 min em uma incubadora a 37 ° C, 5% de CO2, ambiente umidificado.</li>
		<li>Suspender as células destacadas em 4,5 mL de meio de cultura para parar a atividade de tripsina e contar 20 alíquota µ l de suspensão de células em um hemocytometer.</li>
		<li>As células restantes em um tubo cônico de 15 mL de pelotas por centrifugação a 200 x g, durante 3 min, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em meio de cultura para 3 x 106 células/mL. Nota: Para outros substratos de revestimento e/ou linhas de células, a densidade celular ideal deve ser estabelecida em uma série de diluição. 3 x 106 células/mL recomenda-se como ponto de partida.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Células de chapeamento
	<ol>
<li>Lugar uma gota de 10 µ l de suspensão de células no centro de cada lamela do colagénio IV revestido a placa de vidro 12-poço fundo sem tocar ou coçar o revestimento (Figura 1A, B). Incube a placa por 30 min a 37 ° C, ambiente umidificado, para permitir que as células anexar. Verifique em um microscópio invertido as células estão presas. Nota: Isto pode ser melhor visto na borda da gota, onde a formação de uma monocamada pode ser observada (Figura 1C). Se necessário, incubar a placa até 3 h. Certifique-se de que a umidade na incubadora é alta o suficiente, como as gotas podem secar rapidamente. Se for observada uma redução do volume gota durante esta etapa, adicione PBS para os espaços entre os poços para aumentar a umidade.</li>
		<li>Delicadamente lave os poços com 1 mL de meio de cultura duas vezes para remover as células não-inscritos. Adicione 1 mL de meio de cultura para cada poço. Check-in um microscópio invertido que nenhuma célula flutuante permanecem, caso contrário, lavar os poços novamente. Incube as células durante a noite a 37 ° C, 5% de CO2, ambiente umidificado, para obter folhas de celular bem definida. Nota: Células flutuante são prováveis para re-anexar à placa e formam colônias de células indesejáveis.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. estimular células (dia 3)
<ol><li>Verifique se todos os poços, usando um microscópio inverso para garantir essa célula colônias cresceram adequadamente. Se necessário, marque poços inadequados e não usá-los.</li>
	<li>Etiquete cada poço da placa apropriadamente para cada condição de investigado. Execute cada condição em duplicado ou triplicado.</li>
	<li>Mudar o meio para morrer de fome as células em DMEM/F12 contendo 0,1% de soro de cavalo (meio faminto) 3 h antes que as células são estimuladas.</li>
	<li>Estimular as células pela adição de EGF (concentração final de 5 ng/mL) ou outros mediadores desejados e misture suavemente o meio utilizando um micropepitador de 1 mL ou agitando a placa.</li>
	<li>Incubar a placa por 1-4 dias para observar o deslocamento de borda e contorno de borda conforme descrito na seção 4.1 ou executar a imagem latente de lapso de tempo, conforme descrito na seção 4.2.</li>
</ol>4. visualização de colônias de células e migração celular
<ol><li>
Hematoxilina-eosina (HE) coloração para medir o crescimento da colônia (dia 4-7)
	<ol>
<li>Conserte as células em etanol a 70% (1 mL/poço) para ~ 2 min.</li>
		<li>Mancha de núcleos com hematoxilina (1 mL/poço), ~ 2 min.</li>
		<li>Células de lavagem com água da torneira (1 mL/poço) até núcleos são azuis, 5-10 min.</li>
		<li>Mancha de citoplasma com eosina (1 mL/poço), ~ 2 min.</li>
		<li>Enxague com água desionizada (1 mL/poço). Nota: Soluções de hematoxilina e eosina podem ser coletadas e usadas várias vezes até que a mancha se torna fraco.</li>
		<li>Secar a placa.</li>
		<li>Inverter a placa e medir o diâmetro do ponto com uma régua. Alternativamente, tirar fotos da placa com uma câmera e analisar o diâmetro do ponto no ImageJ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Microscopia de lapso de tempo (dia 3)
	<ol>
<li>Ligar o microscópio de incubadora e ajustar a temperatura de 37 ° C. Encha o umidificador com dH2O. ajustar o CO2 a 5%. Certifique-se que a câmara incubadora é úmida e que o palco motorizado pode mover-se livremente. Fechar a câmara incubadora e permitir que o microscópio ajustar a 37 ° C. Nota: O microscópio (consulte a tabela de materiais) usado aqui deve ser aquecido a 37 ° C, durante pelo menos 3 h antes que as células são fotografadas para evitar deriva do foco.</li>
		<li>Colocar a placa no palco do microscópio incubadora e configurar a lista de palco. Duas arestas opostas de imagem e o centro de cada ponto de célula (Figura 1A).</li>
		<li>Com imagens a cada 3 min, de 15-24 h, com o objetivo de X 10. Baixar os dados e prosseguir com a análise de imagem em um programa de escolha, por exemplo, ImageJ ou Matlab.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Liang, C. -C., Park, A. Y., Guan, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+scratch+assay%3A+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).</li>
<li>Peplow, P. V., Chatterjee, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+influence+of+growth+factors+and+cytokines+in+in+vitro+human+keratinocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration.</a> Cytokine. 62 (1), 1-21 (2013).</li>
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<li>Tang, B., Vu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+switches+from+tumor+suppressor+to+prometastatic+factor+in+a+model+of+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">TGF-beta switches from tumor suppressor to prometastatic factor in a model of breast cancer progression.</a> J Clin Invest. 112 (7), 1116-1124 (2003).</li>
<li>Lee, R. M., Stuelten, C. H., Parent, C. A., Losert, W. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/2057-1739/2/2/025001/meta">Collective cell migration over long time scales reveals distinct phenotypes.</a> Convergent science physical oncology. 2 (2), 025001(2016).</li>
<li>Lee, R. M., Kelley, D. H., Nordstrom, K. N., Ouellette, N. T., Losert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+stretching+and+rearrangement+in+epithelial+sheet+migration%5BTitle%5D)+AND+%22New+J+Phys%22%5BJournal%5D)">Quantifying stretching and rearrangement in epithelial sheet migration.</a> New J Phys. 15 (2), (2013).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li>
<li>Grada, A., Otero-Vinas, M., Prieto-Castrillo, F., Obagi, Z., Falanga, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+techniques+made+simple%3A+analysis+of+collective+cell+migration+using+the+wound+healing+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Research techniques made simple: analysis of collective cell migration using the wound healing assay.</a> J Invest Dermatol. 137 (2), 11-16 (2017).</li>
<li>Rosen, P., Misfeldt, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+density+determines+epithelial+migration+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cell density determines epithelial migration in culture.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4760-4763 (1980).</li>
</ol>

O autor não tem nada para divulgar.

Durante as células de progressão do tumor migre longe do tecido de origem para invadir o tecido circundante e metástase para locais distantes15. Migração de células de uma colônia de células pode ser observada no ensaio de ponto. Aqui, o ensaio de ponto é ilustrado por analisar o fenótipo migratório de células de câncer de mama humano em resposta a EGF.
Para obter resultados precisos e replicáveis várias etapas na configuração do ponto os ensaios são críticos. Primeiro,...

Ensaios de migração são amplamente utilizados para avaliar o potencial invasivo e metastático do tumor células em vitro. Mais comumente, a ferida ou ensaio zero é usado para avaliar a migração de folhas epiteliais em uma célula desmarcada área1,2,3. Para realizar o ensaio de zero, as células são banhadas em um monolayer e uma área livre de célula ou "zero" é criada com uma ponta da pipeta. O ensaio de zero é fácil de configurar com suprimentos de cultura de tecidos comumente disponíveis e pode ser executado em placas multi bem, permitindo processamento de amostras múltiplas. No entanto, como é feito o zero, células são fisicamente removidas a monocamada e muitas vezes passam por morte celular. Além disso, ligada à placa de matriz extracelular é muitas vezes danificada durante o processo de coçar. Da mesma forma, o uso de silício insere (tais como câmaras de Ibidi4) ou de estênceis5,6,7 pode levar a ruptura mecânica das células e a remoção parcial de proteínas da matriz usada para revestimento a placas. Outra desvantagem dos ensaios de acompanhamento de fechamento de ferimentos ou arranhões é seu curso de tempo limitado, como migração celular só pode ser analisada até que o zero é fechado.
Realizar o ensaio de ponto, as células são banhadas como uma colônia circular sobre uma placa revestidos ou não revestidos de8. A justificativa para esta estratégia de chapeamento é obter lençóis de células com bordas definidas, que podem migrar ou invadir em áreas circundantes sem célula sem perturbar a cultura pela remoção de células ou inserções. O objetivo geral do ensaio ponto é observar a migração das folhas de célula medida pelo deslocamento de borda ou diâmetro colônia, bem como para realizar a imagem de lapso de tempo para analisar o fenótipo migratório das células em maior resolução espaço-temporal.
Migração celular pode ser afetada por uma variedade de sugestões microenvironmental como fatores de crescimento como EGF, citocinas e quimiocinas. EGF é um fator de crescimento que exerce seus efeitos biológicos através da ligação ao seu receptor, o receptor de EGF9e aumenta o comportamento invasivo e metastático de células de tumor a4,9,10. Aqui, o ensaio de ponto é usado para estudar EGF estimulou a migração de células em uma colônia de pulmão humano invasoras, formando mama câncer célula linha (MCF10CA1a)8,11,12.

<table><tbody><tr><td>Células MCF10CA1a</td> Células <td>N/A</td> do <td>Instituto de Pesquisa Karmanos</td><td>usadas para ensaio</td></tr><tr><td>de colágeno de camundongo IV</td><td>BD Biosciences</td><td>354233</td><td>usadas para revestir placas</td></tr><tr><td>tripsina / EDTA</td><td>Thermo Fisher</td><td>25300054</td><td>usado para remover células de placas de cultura de tecidos</td></tr><tr><td>DPBS&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>21-031-CV</td><td>usado para lavar células</td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>Thermo Fisher</td><td>11320082</td><td>usado como meio de cultura</td></tr><tr><td>de soro de cavalo</td><td>Thermo Fisher</td><td>26050088</td><td>usado para complementar o meio de cultura</td></tr><tr><td>12 bem placa de fundo de vidro</td><td>MatTek</td><td>P12G-1.5-14-F</td><td>usado para cultivar células para geração de imagens</td></tr><tr><td>EGF (fator de crescimento epidérmico, humano recombinante)</td> <td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>usado para estimular células</td></tr><tr><td>livres de ácidos graxos BSA</td><td>Sigma</td><td>A8806-1G</td><td>usado para fazer tampão para hematoxilina EGF</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>HHS32</td><td>usado para corar colônias</td></tr><tr><td>eosina</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>26051-10</td><td>usado para corar colônias</td></tr><tr><td>37 &#176; C, 5% CO2 incubadora</td><td>Sanyo</td><td>modelo MCO-18AIC (UV)</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss AxioObserver com câmara de incubadora e platina motorizada</td><td>Zeiss</td><td>modelo Axio Observer.Z1</td><td>usado para imagens de lapso de tempo</td></tr><tr><td>ORCA Flash LT câmera sCMOS</td><td>BioVision</td><td>C11440-42U-KIT</td><td>usado para imagens de lapso de tempo em combinação com Zeiss AxioObserver</td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>BioVision</td><td>MMACQMIC</td><td>software usado para imagem de lapso de tempo</td></tr> microscópio <tr><td>invertido</td><td>Olympus</td><td>modelo IX70</td><td>usado para contar células e verificar colônias em caixa</td></tr><tr><td>plástica</td> de cultura de tecidos <td>Lock& Fechadura</td><td>N/A</td><td>usada como câmara úmida (qualquer caixa plástica de fechamento hermético que se encaixe nas placas pode ser usada)</td></tr></tbody></table>

usando o ensaio de ponto para analisar a migração de células de folhas

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Apesar de organismos complexos aparecem estáticos, seus tecidos estão sob contínua um volume de negócios. Como células de idade morrem e são substituídas por novas células, as células mover dentro de tecidos de forma bem orquestrada. Durante o desenvolvimento do tumor, este equilíbrio é perturbado, e células tumorais deixar o epitélio de origem para invadir o local microambiente, para viajar para locais distantes e, finalmente, formar tumores metastáticos em locais distantes. O ensaio de ponto é um ensaio de migração irrestrita simples, bidimensional, para avaliar o movimento líquido de folhas de célula em uma área livre de célula e analisar parâmetros de migração celular utilizando imagens de lapso de tempo. Aqui, o ensaio de ponto é demonstrado usando um humano invasivo, formadoras de pulmão em linhagem de células de câncer de mama, MCF10CA1a, para analisar a resposta de migratória das células para fator de crescimento epidérmico (EGF), que é conhecida por aumentar o potencial maligno das células de câncer de mama e para alterar o fenótipo migratório das células.

O ensaio de ponto aqui apresentado (Figura 1) foi realizado utilizando invasiva, colônia de pulmão formando células de câncer de mama (MCF10CA1a) como um sistema modelo. O ensaio de ponto rende pontos de célula altamente reprodutível nem na mão de iniciantes, tornando-se um conveniente e fácil de executar o ensaio (Figura 1D). O ensaio de ponto combinado com ele mancha, ou lapso de tempo de imagem e subsequente V...

Migração celular é essencial para o desenvolvimento, manutenção de tecidos e reparação e tumorigênese e é regulada por citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento. Este protocolo descreve o ensaio de ponto, um ensaio de migração bidimensional, irrestrita para avaliar o fenótipo migratório de folhas de célula unida, coesa, em resposta a sinais microenvironmental.

Usando o ensaio de ponto para analisar a migração de células de folhas

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

O objetivo geral do ensaio de pontos é avaliar o fenótipo migratório de folhas de células coesas anexadas em resposta a pistas microambientais. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do câncer, como como as citocinas ou fatores de crescimento alteram a motilidade das células tumorais. A principal vantagem do ensaio de pontos é que ele é facilmente realizado e usado para resultados reprodutíveis.Embora esse método possa fornecer informações sobre a motilidade celular, ele também se presta a uma série de ensaios subsequentes, como coloração de células para avaliar a morfologia da colônia de crescimento e dispersão celular, imunocoloração, análise de proteínas e DNA ou RNA ou injeção de células em animais. Para começar, descongele o colágeno de camundongo quatro no gelo e dilua-o com 50 micromolares HCL para preparar três mililitros de uma solução de colágeno quatro de 10 microgramas por mililitro. Adicione 250 microlitros de solução de colágeno quatro aos poços de placas de fundo de vidro de 12 poços e coloque-os em uma caixa plástica de tamanho apropriado e fechamento hermético.Coloque uma toalha de papel molhada sobre e ao redor das placas para fabricar uma c

using-the-dot-assay-to-analyze-migration-of-cell-sheets

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Comumente usado, são descritos métodos altamente acessíveis para analisar a migração celular e invasão in vitro. O primeiro método é o ensaio de encerramento de feridas de células que mede a mobilidade celular. O segundo método é o ensaio de migração e invasão transwell que avalia o quimiotáctica e capacidade invasiva de células.

Na migração celular in vitro e invasão Ensaios

Um método quantitativo para estudar a migração espontânea de células em um microambiente confinado unidimensional é descrito. Este método tira vantagem de canais microfabricados e pode ser utilizado para estudar a migração de grande número de células em condições diferentes nas experiências individuais.

Estudo da migração celular em Canais microfabricados

Aqui nós descrevemos um protocolo que os casais duas técnicas proteômicas, ou seja, 2-dimensional Eletroforese (2DE) e Espectrometria de Massa (MS), para identificar diferencialmente expressos / proteínas pós-traducionais modificados entre dois ou mais grupos de amostras primárias. Esta abordagem, em conjunto com ensaios funcionais, permite a identificação e caracterização de marcadores / alvos terapêuticos prognósticos.

A partir de um ponto 2DE-Gel para a função da proteína: lição aprendida com HS1 em leucemia linfocítica crônica

As propriedades mecânicas e a micro estrutura da matriz extracelular afectar fortemente a migração de células 3D. Um método in vitro para estudar o comportamento de migração celular no espaço-temporal ambientes biofísico variáveis, tanto na população e os níveis de células individuais, é descrito.

Sistema de Gel Concentric para estudar o papel Biofísica da Matrix Microenvironment sobre a migração celular 3D

A investigação da migração precoce de células endoteliais (EEC) é importante para entender a fisiopatologia de certas doenças e potencialmente identificar novas estratégias para intervenção terapêutica. O protocolo a seguir descreve técnicas para avaliar a migração celular que foram adaptadas para a investigação da EEC.

Avaliação da migração de células endoteliais após a exposição a produtos químicos tóxicos

Este protocolo detalha um método personalizada para medir a migração celular em resposta a quimioatractores, que também podem ser utilizados para determinar a taxa de difusão de um fármaco a partir de uma matriz de polímero.

A Câmara customizáveis ​​para a migração celular de medição

Este estudo relata dois métodos diferentes para a análise de migração e invasão celular: o ensaio de câmara Boyden e em vitro vídeo baseado em microscópio cicatrização ensaio. São descritos os protocolos para estes dois experimentos, e suas vantagens e desvantagens são comparadas.

Avaliação do processo de migração e invasão celular: uma comparação da risque baseado no microscópio a ferida do ensaio e o ensaio de câmara Boyden

O atual protocolo descreve um método integrado, investigando a migração de células de câncer e invasão em uma única plataforma em tempo real, fornecendo uma opção facilmente reproduzível e tempo-eficiente para estudar a morfologia e mobilidade celular.

Um fluxo de trabalho simples migração/invasão usando um automatizado Imager viver-pilha

As forças mecânicas são importantes para controlar a migração celular. Este protocolo demonstra o uso de hidrogéis elásticos que podem ser deformados usando uma micropipeta de vidro e um micromanipulador para estimular as células com um gradiente de rigidez local para provocar mudanças na estrutura celular e migração.

Ensaio de Durotaxis de célula única para avaliar o controle mecânico do movimento celular e eventos de sinalização relacionados

Um protocolo para a avaliação quantitativa da migração de células 3D dentro e para a interface de hidrogéis granulares é apresentado aqui.

Quantificando a migração celular tridimensional dentro e dentro de biomateriais de hidrogel granular

Aprenda a usar o ensaio de ponto para analisar a migração de folhas celulares coesas em resposta a estímulos do microambiente. Este método reprodutível é valioso para pesquisas em biologia do câncer e reparo tecidual.

Usando o ensaio de ponto para analisar a migração de células de folhas

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