Usando o ensaio de ponto para analisar a migração de células de folhas

O objetivo geral do ensaio de pontos é avaliar o fenótipo migratório de folhas de células coesas anexadas em resposta a pistas microambientais. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do câncer, como como as citocinas ou fatores de crescimento alteram a motilidade das células tumorais. A principal vantagem do ensaio de pontos é que ele é facilmente realizado e usado para resultados reprodutíveis.

Embora esse método possa fornecer informações sobre a motilidade celular, ele também se presta a uma série de ensaios subsequentes, como coloração de células para avaliar a morfologia da colônia de crescimento e dispersão celular, imunocoloração, análise de proteínas e DNA ou RNA ou injeção de células em animais. Para começar, descongele o colágeno de camundongo quatro no gelo e dilua-o com 50 micromolares HCL para preparar três mililitros de uma solução de colágeno quatro de 10 microgramas por mililitro. Adicione 250 microlitros de solução de colágeno quatro aos poços de placas de fundo de vidro de 12 poços e coloque-os em uma caixa plástica de tamanho apropriado e fechamento hermético.

Coloque uma toalha de papel molhada sobre e ao redor das placas para fabricar uma câmara úmida e feche a caixa. Em seguida, incube as placas durante a noite em temperatura ambiente. Na manhã seguinte, para mover o colágeno não absorvido e o tampão, use água deionizada para enxaguar as placas duas vezes, direcionando a água para a borda do poço da placa, em vez da borda formada pelo fundo da borda e a lamínula.

Seque as placas ao ar em uma capela de fluxo laminar e use-as imediatamente ou armazene-as a quatro graus Celsius por até cinco dias. Para preparar a suspensão celular, use células que foram cultivadas em uma placa de cultura de tecidos de 60 milímetros em DMEMF12 meio, suplementada com 5% de soro de cavalo a 80% de confluência. Use DPBS sem cálcio e magnésio para enxaguar as células uma vez, depois adicione 500 microlitros de tripsina EDTA em temperatura ambiente e incube as células a 37 graus Celsius em 5% de CO2 em uma atmosfera umidificada por três a cinco minutos.

Suspenda as células destacadas em 4,5 mililitros de meio de cultura para interromper a atividade da tripsina e use um hemocitômetro para contar uma alíquota de 20 microlitros da suspensão celular. Retire as células restantes em um tubo cônico de 50 mililitros por centrifugação a 200 vezes a gravidade por três minutos. Em seguida, aspire o sobrenadante e ressuspenda as células em meio de cultura para três vezes 10 elevado a seis células por mililitro.

Para colocar as células no centro de cada lamínula da placa de fundo de vidro de 12 poços revestida com colágeno, coloque uma gota de 10 microlitros de suspensão celular, tomando cuidado para não tocar ou arranhar o revestimento. O revestimento de uma gota não circular não produzirá uma folha de célula circular e, se o revestimento for tocado ou arranhado, impedirá que as células adiram bem. Incube a placa a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada por 30 minutos, para permitir que as células se fixem.

Em seguida, verifique se há fixação sob um microscópio invertido. Com um mililitro de meio de cultura, lave suavemente os poços duas vezes, para remover as células não aderidas e, em seguida, adicione um mililitro de meio de cultura a cada poço. Verifique sob um microscópio invertido se não restam células flutuantes, caso contrário, lave os poços novamente.

Incube as células durante a noite a 37 graus Celsius em 5% de CO2 em uma atmosfera umidificada para obter folhas de células bem definidas. Usando um microscópio invertido, verifique todos os poços para garantir que as colônias de células tenham crescido adequadamente. Se necessário, marque os poços inadequados e não os use.

Rotule cada alvéolo da placa adequadamente para cada condição investigada. Execute cada condição em duplicata ou triplicada. Troque o meio para matar de fome as células em DMEMF12 contendo 0,1% de soro de cavalo, três horas antes de as células serem estimuladas.

Em seguida, estimule as células adicionando EGF ou outros mediadores desejados. Use uma pipetadora de um microlitro ou gire a placa suavemente para misturar o meio. Incube a placa por um a quatro dias para observar o deslocamento e o contorno da borda.

Para realizar a coloração H e E, lave as células com PBS duas vezes e fixe-as por aproximadamente dois minutos. Adicione hematoxilina por aproximadamente dois minutos para corar os núcleos. Lave as células com água da torneira por cinco a 10 minutos, até que os núcleos fiquem azuis.

Em seguida, core o citoplasma com eosina por dois minutos antes de enxaguar as células com água deionizada. Seque a placa ao ar, vire-a e use uma régua para medir o diâmetro do ponto. Como alternativa, tire fotos da placa com uma câmera e use o ImageJ para analisar o diâmetro do ponto.

Para realizar a microscopia de lapso de tempo, ligue o microscópio da incubadora e ajuste a temperatura para 37 graus Celsius. Encha o umidificador com DH2O e, em seguida, ajuste o CO2 para 5%Certifique-se de que a câmara da incubadora esteja umidificada e que o motorizado stage possa se mover livremente. Em seguida, feche a câmara da incubadora e deixe o microscópio se ajustar a 37 graus Celsius.

Coloque a placa no palco do microscópio da incubadora e configure a lista de estágios, depois crie imagens de duas bordas opostas e o centro de cada ponto de célula. Usando uma objetiva de 10X, tire fotos a cada três minutos por 15 a 24 horas. Baixe os dados e prossiga com a análise de imagens em um programa de sua escolha, como o Matlab.

Inicialmente, a imagem de contraste de fase de pontos celulares revelou que as células invasivas de câncer de mama formadoras de colônias pulmonares mantêm um fenótipo mesenquimal após estimulação com EGF. No entanto, células únicas que saem da folha são observadas com mais frequência em pontos celulares estimulados por EGF. A resposta das células de câncer de mama formadoras de colônias pulmonares ao EGF foi avaliada pela coloração H e E de culturas que foram estimuladas com EGF por quatro dias.

De fato, a estimulação com EGF resultou em um aumento do diâmetro da colônia, indicando que a migração de células estimuladas por EGF pode ser alterada. Neste ensaio de pontos, as células nas bordas da folha foram fotografadas por nove horas após a estimulação de células de câncer de mama formadoras de colônias com EGF. O PIV revelou que o EGF aumentou a velocidade da célula para 0,63 micrômetros por minuto, de 0,45 micrômetros por minuto nas células de controle.

Além disso, o EGF reduziu a variabilidade da direcionalidade celular, ou disseminação angular, de 0,95 em culturas de controle para 0,79 em culturas estimuladas por EGF. Além disso, como foi observado pela coloração H e E após quatro dias, o EGF aumentou o deslocamento radial da borda epitelial ao longo de nove horas, de 257 micrômetros para 356 micrômetros. Uma vez dominado, o tempo prático para esta técnica é de algumas horas.

Após este procedimento, outros métodos, como imagem de lapso de tempo, imunocoloração e análise de DNA e RNA, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais. Por exemplo, pode ser usado para analisar se as proteínas são expressas diferencialmente em células de migração rápida ou lenta, ou quando as células migram para o ambiente circundante. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como configurar o ensaio de pontos e usá-lo para avaliar o fenótipo migratório de folhas de células coesas anexadas em resposta a pistas microambientais.