Name: Uma técnica de Squash do tubo seminífero para a análise citológica da espermatogênese usando o modelo de Mouse (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Aprenda a técnica de squash de túbulos seminíferos para análise citológica da espermatogênese em camundongos. Este método preserva a integridade celular e permite visualizar espermatócitos em meiose.

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Este trabalho foi apoiado pelo NIGMS (R01GM11755) para P.W.J. e uma bolsa de subsídio de formação do Instituto Nacional de câncer (NIH) (CA009110) para S.R.W. e J.H.

O uso de ratos foi aprovado pelo cuidado institucional do Animal e usar o Comitê da Universidade Johns Hopkins. Experimentos foram realizados no juvenil (20-26 dias pós-parto, dpp) camundongos C57BL/6J, aproveitando-se da primeira onda semisíncrona de espermatogênese. No entanto, esta técnica também pode ser realizada usando ratos adultos.
1. dissecção e o isolamento dos túbulos seminíferos do mouse
<ol><li>Prepare o reparo/solução e anticorpo diluição do lysis (ADB) descrito na tabela 1 e tabela 2.</li>
	<li>Prepare um prato de Petri 35mm com 3 mL de 1x tampão fosfato solução salina (1X PBS, pH 7,4) e um outro prato de 35 mm com 2 mL da solução de correção/lise por rato.</li>
	<li>Sacrificar o mouse através de deslocamento cervical ou CO2 asfixia e pulverizar o abdômen ventral com etanol a 70%. Abra a cavidade abdominopelvic usando uma tesoura esterilizada, fazendo uma abertura em forma de V. Então remova os testículos puxando a epidídimo almofada gorda usando fórceps e evitar perturbar a túnica albugínea. Coloque os testículos em um prato de Petri 35mm contendo 1X PBS. Nota: Utilize a primeira onda de espermatogênese para observar uma população celular enriquecido de interesse14. Estágios específicos da espermatogênese são enriquecidos em idades diferentes do rato (tabela 3).</li>
	<li>Remova o testicular túnica albugínea , perfurando o tecido com pinças com pontas afiadas e coletar túbulos seminíferos soltos. Transferi os túbulos para um novo 35mm placa de Petri contendo 2 mL de solução de Lise/fix.</li>
	<li>Incube os túbulos na solução fix/lise durante 5 min à temperatura ambiente.</li>
</ol>2. preparação dos túbulos seminíferos
<ol><li>Prepare um slide de vidro revestido de poli-L-lisina, delineando as bordas da lâmina com uma caneta de bloqueador de líquido.</li>
	<li>Aplicam-se 100 µ l de solução de Lise/fix para o centro da lâmina de vidro.</li>
	<li>Usando Pinças esterilizadas e tesoura suavemente arreliar distante dos túbulos seminíferos. Corte de tempo individual túbulo segmentos aproximadamente 20 mm de comprimento. Nota: Para visualizar estruturas que são sensíveis à exposição prolongada de fixador, tais como as centrossomas, primeiro, separar os túbulos na PBS 1x e, em seguida, picar diretamente os túbulos na superfície dos slides de poli-lisina revestido em 100 µ l de solução de Lise-fix.</li>
	<li>Transferência de cinco segmentos de tubo seminífero longo de 20mm para o slide de vidro revestido de poli-L-lysine preparados contendo solução fix/Lise.</li>
	<li>Usando a tesoura estéril carne moída tubules seminiferous em segmentos de 1,5 a 3,0 mm.</li>
	<li>Usando Pinças esterilizadas organizar os segmentos do túbulo sobre a lâmina de vidro para que o tecido não se sobrepõe, e os túbulos são distribuídos uniformemente. Nota: O número ideal de segmentos do túbulo sobre uma lâmina de vidro é entre 20 e 40 anos.</li>
</ol>3. esmagamento dos túbulos seminíferos
<ol><li>Transferi a lâmina de vidro que contém segmentos de tubo seminífero dispersos em uma bancada. Remova o excesso de líquido utilizando um laboratório para evitar a perda de tecido durante a etapa de abóbora.</li>
	<li>Uma lamela (22 x 60-1,5 mm) na parte superior da lâmina de vidro e aplicar pressão com o calcanhar da palma por 10 a 20 segundos. É importante aplicar força suficiente para dispersar espermatócitos de túbulos seminíferos. Nota: Observe os túbulos usando um microscópio de dissecação, a fim de otimizar a etapa de caça aos bugs, para que todos os segmentos do túbulo são rompidos.</li>
	<li>Usando o slide fórceps, imediatamente flash congelar a lâmina de vidro em um pequeno dewar de líquido N2 por 15 segundos, ou até o líquido deixa de bolha. Se immunolabeling imediatamente, remova a lamela com uma lâmina de barbear borda reta, ótimo dica fórceps ou agulha de 21. Nota: Para obter melhores resultados, immunolabel os slides imediatamente (ver passo 4). No entanto, neste ponto slides podem ser preservados a-80 ° C por até duas semanas. Para maximizar a vida útil de proteínas e estruturas celulares, imediatamente armazena os slides em gelo seco ou transferência para um freezer-80 ° C e mantém a lamela no slide. Quando immunolabeling armazenados slides, remova a lamela imergindo os slides no líquido N2 por 15 segundos, conforme descrito na etapa 3.3.</li>
</ol>4. Immunolabeling de túbulos seminíferos montados
<ol><li>Mergulhe o slide em 1X PBS e lavar três vezes por 5 min em uma jarra de Coplin 50 mL contendo 1X PBS. Nota: Nunca permita que os slides completamente seco durante immunolabeling.</li>
	<li>Aplica 1 mL de tampão de diluição de anticorpo a lâmina de vidro para bloquear por 1-2 h em uma câmara umidificada.</li>
	<li>Retire o tampão de diluição de anticorpo e aplicar 100 µ l de anticorpo primário, diluído em tampão de diluição de anticorpo em uma câmara umidificada. Nota: Para melhores resultados, incubar os anticorpos primários durante a noite a 4 ° C. Utilize volumes menores de anticorpo (por exemplo, 50 µ l), cobrindo o slide com uma lamela ou parafilm. Validar e otimizar os anticorpos primários15.</li>
	<li>Enxague slides três vezes por 5 min em uma jarra de Coplin 50 mL contendo 1X PBS. Nota: Para aprimorar a lavagens, agitar frascos de Coplin usando uma barra de agitação magnética pequena e coloque em um prato de agitação magnética em baixa velocidade ou coloque a jarra de Coplin em um misturador de mesa a baixa velocidade.</li>
	<li>Aplicam-se 100 µ l de anticorpo secundário diluído em tampão de diluição de anticorpo para 1 a 1,5 h em uma câmara humidificada à temperatura ambiente. Incube os slides em uma caixa escura para evitar foto branqueamento de anticorpos fluoróforo conjugado. Nota: Utilize volumes menores de anticorpo (por exemplo, 50 µ l), cobrindo o slide com uma lamela ou parafilm.</li>
	<li>Enxague slides duas vezes por 5 min em uma jarra de Coplin 50 mL contendo 1X PBS.</li>
	<li>Montar as lâminas no meio de montagem contendo 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1,5 µ g/mL) e aplique as lamelas (22 x 60-1,5 mm).</li>
	<li>Sele as lamelas para os slides com esmaltes claros para preservar os slides e evitar as lamelas de mover-se.</li>
</ol>5. análise e preparações de abóbora túbulo de imagem
<ol><li>Use um microscópio de epifluorescência com palco automatizado que permite o movimento preciso do eixo z e uma câmera de alta resolução para captura de imagem. Como alternativa, use um microscópio confocal a laser. Nota: Use qualquer software e hardware disponíveis para esta etapa. Por exemplo, imagens exibidas na Figura 1 e Figura 2 foram capturadas usando uma célula de Zeiss observador Z1 ligado a uma câmera CMOS de ORCA-Flash 4.0 e analisados com o software de imagem de edição de Zeiss ZEN 2012 azul.</li>
	<li>Avalie os slides usando um objectivo X 20 para determinar a qualidade da preparação da polpa. Slides de boa qualidade tem uma monocamada de núcleos que são uniformemente distribuídos. Nota: Algumas seções do slide podem ser melhores do que outros, é útil observar as coordenadas de onde as melhores regiões do slide podem ser encontradas para posterior análise utilizando a maior ampliação.</li>
	<li>Usando a maior ampliação objectivo (por exemplo, 63 X ou 100 X), regiões de captura do slide que têm um monolayer consistente dos núcleos. Uma vez que uma região está selecionada, definir a parte superior e menor Z-pilhas para garantir que toda a luz em foco é capturada. Nota: O número ideal de Z-pilhas capturado entre o limite superior e inferior é geralmente designado pelo software de aquisição de imagem e é diferente para cada objetivo.</li>
	<li>Use a software de processamento de imagem para compilar uma imagem de foco estendido de profundidade. O software combina a luz em foco de cada pilha-Z e é essencial para a imagem ideal de preparações de abóbora do túbulo.</li>
</ol>

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<li>Henriksén, K., Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+apoptosis+of+male+germ+cells+in+the+rat%3A+Mechanisms+of+cell+death+studied+by+supravital+squash+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">Stage-specific apoptosis of male germ cells in the rat: Mechanisms of cell death studied by supravital squash preparations.</a> Tissue Cell. 30 (6), 692-701 (1998).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Os ratos têm provado para ser um organismo modelo útil para estudar os eventos celulares que regulam a progressão meiótica durante a espermatogénese. Além disso, é necessário desenvolver ferramentas servidas para o estudo da espermatogênese porque muitos eventos, como sair da prófase meiótica, são sexualmente dimórfico. Este protocolo descreve um método de abóbora tubo seminífero para visualização e estudo de diferentes estágios da espermatogênese de rato. Este método preserva a integridade celular e desse modo permite a...

Meiose é um evento complexo celular em que uma única rodada de replicação do DNA é seguida por duas rondas sucessivas de divisão celular. Vários eventos de meiose específicos devem ser coordenados durante os estágios iniciais da meiose para garantir a segregação do cromossomo precisos. Estes eventos incluem a conclusão de recombinação homóloga, co a orientação da irmã cinetócoros durante a primeira divisão meiótica e a perda gradual de cohesin complexos para resolver chiasmata entre homologs. Regulamento preciso destes processos é necessário para manter a fertilidade e evitam que podem levar a disfunções no desenvolvimento genéticas e aborto espontâneo1cromossoma missegregation eventos.
Enquanto os principais eventos da meiose ocorrem em machos e fêmeas, existem diferenças significativas de temporais e mecanicistas entre espermatogênese e a ovogênese2. Por exemplo, durante a meiose feminina, prófase I ocorre durante o desenvolvimento embrionário e prende no estágio de Dictióteno até a puberdade. Em contraste, a espermatogênese começa na puberdade e progride em ondas por toda a vida adulta, sem prisão. As diferenças entre masculino e feminino meiose enfatiza a necessidade de desenvolver métodos que são servidos especificamente para avaliar estes processos em espermatócitos e oócitos. Atualmente, avaliar progressão meiótica em grande parte se baseia na utilização de cromatina se espalha3,4,5. Enquanto cromatina spreads são úteis para o estudo de cromossomos meióticos, eles falham preservar a integridade celular, impedindo a avaliação de estruturas celulares como os microtúbulos do fuso, centrossomas, o envelope nuclear e anexos dos telômeros. Ao vivo de imagens e técnicas de cultivo a longo prazo avançaram muito nossa compreensão da meiose feminina; abordagens semelhantes para visualizar toda a célula intacta, no entanto, são menos frequentemente implementadas para o estudo da espermatogênese6,7. A fim de Visualizar eventos dinâmicos durante a meiose masculina, adaptaram-se técnicas de abóbora túbulo estabelecido para avaliar rapidamente as características citológicas de desenvolver rato espermatócitos8,9. O método descrito aqui mantém a integridade da célula, permitindo o estudo de várias estruturas celulares durante diferentes estágios da espermatogênese.
Esta técnica de abóbora do túbulo é uma abordagem de célula inteira, o que permite a avaliação de estruturas celulares através de microscopia de imunofluorescência. Abordagens histológicas comuns Visualizar meiótica progressão em ratos masculinos como hematoxilina e eosina mancha de parafina incorporado testículos e rotulação de imunofluorescência de cryosections permitem uma visão ampla da progressão meiótica. No entanto, essas técnicas não conseguem resolver células únicas na medida do necessário para uma análise detalhada dos eventos ocorridos durante a meiose10,11. Técnicas alternativas para visualizar processos meióticos dependem quimiosmótica significativa perturbação para a maturação para isolar e corrigir materiais nucleares3,4,5. Estes tratamentos químicos dificultam a observação dos tipos de célula diferentes espermatócitos primários. Um método recentemente descrito por Namekawa permitiu que a comunidade de pesquisa preservar a arquitetura nuclear de espermatócitos isolados, mas requer o uso de um cytospin e acessórios que podem não estar prontamente disponíveis para alguns laboratórios4. Em contraste, a técnica de abóbora túbulo requer apenas o equipamento que é geralmente padrão na maioria dos laboratórios de biologia celular.
O método de abóbora túbulo descrito aqui pode ser usado para visualizar os tipos de célula diversos encontrados dentro do túbulo seminífero, incluindo células de sertoli, espermatogónias, espermatócitos primários e secundários, espermátides e. Por esta técnica de engate com a primeira onda perto-síncrono de espermatogênese em camundongos juvenis, é possível obter populações enriquecidas de células espermatogênico medida que progridem através de de meiose12. Este processo permite a análise detalhada dos processos em toda a espermatogênese, como primeiros eventos da prófase, metáfase, a anáfase transições e acridina e G2/MI. Além disso, preparações de abóbora túbulo podem ser usadas para visualizar características citológicas dos cromossomas (por exemplo, domínios interchromatid (ICDs) e cinetócoros) e centrossomas (centríolos e pericentriolar material/matrizes). O método de abóbora pode ser prontamente executado em paralelo com outras abordagens experimentais, tais como cromatina spreads e extração de proteínas. Além disso, esta técnica foi modificada com sucesso para depositar as células espermatogênico em lâminas para visualização directa13.
O método descrito aqui envolve uma técnica de abóbora de tubo seminífero células inteiras para analisar a transição G2/MI em camundongos C57BL/6J de tipo selvagem. As características citológicas de espermatócitos primários, entrando a primeira divisão meiótica foram visualizadas com microscopia de imunofluorescência para observar o fuso meiótico. Esta técnica versátil pode ser facilmente modificada para visualizar outros estágios meióticos e diferentes tipos de células. A técnica também é passível de estratégias de visualização alternativos, tais como o DNA e RNA peixe abordagens.

<table><tbody><tr><td>16% Paraformaldeído</td><td>Aquoso Microscopia Eletrônica Sciences (EMS)</td> <td>15710</td><td></td></tr><tr><td>10x</td><td>PBS Qualidade Biológica</td><td>119-069-161</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A1470</td><td></td></tr><tr><td>Soro</td><td>de Cavalo Sigma</td><td>H-1270</td><td></td></tr><tr><td>35mm x 10mm Placa de Petri, Estéril, não tratada</td><td>CellTreat</td><td>P886-229638</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de vidro revestidas com poli-L-lisina</td> Caneta bloqueadora de líquidos <td>Sigma</td><td>P0425-72EA</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Microscopia eletrônica Sciences (EMS)</td><td>71310</td><td></td></tr><tr><td>Caixa úmida</td><td>Evergreen</td><td>240-9020-Z10</td><td></td></tr><tr><td>Wheaton Coplin Prato de coloração de vidro para 5 ou 10 slides</td><td>Fisher</td><td>08-813E</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Montagem antidesbotamento Médio com DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de Cobertura para Microscópio (22mmx60mm)</td><td>Esmalte Transparente Fisher</td><td>12-544-G</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Amazon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Microsopes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo </td><td>Comentários</td></tr><tr><td>SteREO Discovery.V8</td><td>Zeiss</td><td>495015-0001-000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Observador Z1</td><td>Zeiss</td><td>4109431007994000</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss ZEN 2012 edição azul software de imagem</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash 4.0 CMOS câmera</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos primários</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa<</td><td>strong>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Mouse anti-SYCP3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-74569</td><td>1 em 50</td></tr><tr><td>Coelho anti-SYCP3</td><td>Fisher (Novus)</td><td>NB300-231</td><td>1 em 1000</td></tr><tr><td>Cabra anti-SCP3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-20845</td><td>1 em 50</td></tr><tr><td>Anticorpos de proteína anti-centrômero humano</td><td>incorporados</td><td>15-235</td><td>1 em 100</td></tr><tr><td>Camundongo anti-alfa tubulina</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>1 em 1000</td></tr><tr><td>Camundongo anti-AIM1</td><td>BD Biosciences</td><td>611082</td><td>1 em 200</td></tr><tr><td>Camundongo anti-gama; H2AX</td><td>Thermo Fisher</td><td>MA1-2022</td><td>1 em 500</td></tr><tr><td>Mouse anti-CENT3</td><td>Abnova</td><td>H00001070-M01</td><td>1 em 200</td></tr><tr><td>Coelho anti-pericentrino</td><td>Abcam</td><td>ab4448</td><td>1 em 200</td></tr><tr><td>Coelho anti-REC8</td><td>Cortesia de&nbsp; Dra. Karen Schindler</td><td>N/A</td><td>1 em 1000</td></tr></tbody></table>

uma técnica de squash do tubo seminífero para a análise citológica da espermatogênese usando o modelo de mouse

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Meiótica progressão nos machos é um processo que exige a acção concertada de uma série de eventos celulares altamente regulamentados. Erros que ocorrem durante a meiose podem levar à infertilidade, perda de gravidez ou defeitos genéticos. Começando no início da puberdade e ao longo da vida adulta, contínuas ondas semisíncronas de espermatócitos submetido a espermatogênese e, finalmente, formam espermatozoides haploides. A primeira onda de espermatócitos de rato em fase meiótica iniciação aparecem no 10º dia pós-parto (dpp 10) e são liberados no lúmen dos túbulos seminíferos como esperma madura no dpp 35. Portanto, é vantajoso utilizar ratos dentro desta janela de tempo do desenvolvimento, a fim de obter populações altamente enriquecidas de interesse. Análise dos estágios de célula rara é mais difícil em ratos mais velhos devido à contribuição das sucessivas ondas espermatogênico, que aumentam a diversidade das populações celulares dentro dos túbulos. O método descrito aqui é uma técnica facilmente implementada para a avaliação citológica das células encontradas nos túbulos seminíferos dos ratos, incluindo espermatogónias espermatócitos e espermátides. A técnica de abóbora túbulo mantém a integridade das células germinativas masculinas isoladas e permite a análise das estruturas celulares que não são facilmente visualizados com outras técnicas. Para demonstrar as possíveis aplicações desta técnica de abóbora do túbulo, montagem do eixo foi monitorada em espermatócitos progredir através da prófase para metáfase que eu transição (transição G2/MI). Além disso, duplicação centrossoma, inativação do cromossomo meiótico de sexo (MSCI) e formação de cromossomo buquê foram avaliados como exemplos das estruturas citológicas que podem ser observadas usando esse método de abóbora do túbulo. Esta técnica pode ser usada para identificar defeitos específicos durante a espermatogênese causadas por mutação ou perturbação exógena, e assim, contribui para a nossa compreensão molecular da espermatogênese.

Aqui, nós usamos o método de abóbora do túbulo para visualizar populações de células transitória em fase da prófase para metáfase eu (G2/MI) transição, que foram enriquecidos por colheita testículos de juvenis selvagem-tipo ratos submetidos à primeira onda de espermatogênese (24 DPP). A Figura 1 retrata imagens representativas das diversas fases de célula que podem ser visualizadas usando o método de abóbora do túbulo. Enriquecido com populações da metafase e...

O objetivo desta técnica de abóbora do túbulo é rapidamente avaliar características citológicas de desenvolver espermatócitos de rato, preservando a integridade celular. Esse método permite o estudo de todas as fases da espermatogênese e pode ser facilmente implementado juntamente com outras abordagens biológicas bioquímicas e moleculares para o estudo da meiose rato.

Uma técnica de Squash do tubo seminífero para a análise citológica da espermatogênese usando o modelo de Mouse

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

O objetivo geral desta técnica de abóbora de túbulos seminíferos é visualizar as características citológicas de espermatogônias, espermatócitos e espermátides de camundongos, preservando sua integridade celular. Para esta demonstração, nos concentramos na análise de espermatócitos submetidos à meiose. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia reprodutiva masculina, como diferenciação de células-tronco espermatogônicas, segregação cromossômica meiótica e diferenciação pós-meiótica de espermátides redondas.A principal vantagem dessa técnica é que a integridade celular das células germinativas masculinas é mantida, o que permite o exame de estruturas celulares não facilmente visualizadas com outras técnicas. Este método pode ser usado para melhorar nossa compreensão das causas paternas de infertilidade em qualquer platy. E pode ser aplicado a sistemas de mamíferos, como testículos derivados de camundongos ou doadores de órgãos.Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldade em fazer uma boa abóbora. Aplicar força suficiente e organizar adequadamente os túbulos são fatores importantes para produzir uma monocamada uniforme de células. Para cada camundongo a ser dissecado, carregue duas placas de Petri de 35 milímetros, uma com três mililitros de PBS e outra com dois mililitros de solução de lise fixadora recém-feita.Selecione camundongos submetidos à primeira onda de espermatogênese para observar uma população enriquecida de interesse. Depois de sacrificar o mouse, limpe o abdômen com álcool 70% e prossiga com a cirurgia. Faça uma abertura em forma de V na cavidade pélvica abdominal e remova os testículos puxando a almofada de gordura do epidídimo com uma pinça, mas sem perturbar a túnica albugínea.Transfira os testículos para o prato contendo PBS. Lá, remova a túnica albugínea testicular puncionando o tecido com uma pinça afiada e colete os túbulos seminíferos soltos. Em seguida, transfira os túbulos para o prato com a solução de lise fixadora e deixe a reação prosseguir por cinco minutos à temperatura ambiente.Durante a incubação, prepare uma lâmina de vidro revestida com poli-L-lisina delineando as bordas da lâmina com uma caneta bloqueadora de líquido e, em seguida, preenchendo a lâmina com 100 microlitros de solução de lise fixadora dentro das bordas. Após a incubação de cinco minutos, use uma pinça e uma tesoura estéreis para separar suavemente e cortar os túbulos seminíferos de modo que segmentos individuais de 20 milímetros sejam obtidos. Em seguida, transfira cinco segmentos de túbulos de 20 milímetros para a lâmina preparada.Em seguida, continue a dividir os segmentos em comprimentos de 1,5 a três milímetros usando uma tesoura. Agora, com a pinça, organize os segmentos de forma que não se sobreponham. Distribua-os uniformemente pela lâmina.Idealmente, 20 a 40 comprimentos curtos ocuparão um slide. Comece removendo o excesso de líquido na preparação da lâmina usando um lenço absorvente. Agora, aplique uma lamínula e esmague os túbulos usando a pressão da palma da mão por 10 a 20 segundos.O objetivo é aplicar força suficiente para dispersar os espermatócitos dos túbulos seminíferos. Usando um microscópio de dissecação, verifique se os segmentos foram rompidos pela abóbora. Em seguida, despeje um pouco de nitrogênio líquido em um pequeno Dewar e congele rapidamente a lâmina por 15 segundos ou até que o líquido pare de borbulhar.Para prosseguir com o amino blotting, remova imediatamente a lamínula usando uma ponta ou borda afiada. Embora não seja o ideal, as lâminas congeladas podem ser preservadas imediatamente a 80 graus Celsius negativos e salvas por até duas semanas. Para remover a lamínula mais tarde, mergulhe as lâminas em nitrogênio líquido por 15 segundos e retire a lamínula.Para prosseguir com a marcação de aminoácidos, lave as lâminas três vezes em PBS por cinco minutos por lavagem usando um frasco de Coplin de 50 mililitros. Após as lavagens, aplique um mililitro de tampão de diluição de anticorpos em cada lâmina para servir como um bloco. Deixe a reação do bloco funcionar por uma a duas horas em uma câmara umidificada.Nunca deixe as lâminas secarem durante este procedimento. Em seguida, bata as lâminas em uma toalha de papel para remover suavemente o tampão e devolvê-las à câmara umidificada. Em seguida, aplique 100 microlitros de anticorpo primário diluído em cada lâmina e transfira-os para 40 graus Celsius, onde a reação de ligação pode ocorrer durante a noite.Se a solução de anticorpos for escassa, metade do volume pode ser usado se estiver coberto com uma lamínula ou parafilme. No dia seguinte, use três lavagens em PBS para remover o anticorpo primário. Em seguida, aplique 100 microlitros de anticorpo secundário diluído e deixe essa reação durar de uma a uma hora e meia em temperatura ambiente.Para evitar o fotobranqueamento, mantenha as lâminas em uma câmara escura umidificada durante esta incubação. Em seguida, lave as lâminas duas vezes com PBS. Agora, pontilhar os slides usando um meio de montagem contendo DAPI.Em seguida, sele as lamínulas com esmalte e prossiga com a imagem. Para tirar imagens, use um microscópio de epifluorescência com uma platina automatizada que permite o movimento preciso do eixo z. Use também uma câmera de alta resolução para capturar imagens.Agora, avalie os slides usando uma objetiva de 20x. Determine a qualidade da preparação da abóbora. Uma abóbora de boa qualidade terá uma monocamada de núcleos distribuídos uniformemente.Algumas regiões da abóbora podem ser melhores do que outras. Observe as coordenadas das melhores regiões para encontrá-las facilmente em maior ampliação. Agora, aumente a ampliação para até 100x.Em seguida, capture imagens de regiões observadas que possuem uma monocamada consistente de núcleos. Defina as pilhas z superior e inferior para garantir que toda a luz em foco seja capturada. O número ideal de z-stacks é geralmente designado pelo software de aquisição de imagem e é diferente para cada objetivo.A partir das imagens, compile uma imagem de profundidade estendida usando um software de processamento. O software combinará a luz em foco de cada pilha z, o que é essencial para a imagem ideal das preparações de abóbora em túbulos. Usando o método de abóbora de túbulos descrito, populações de células transitórias submetidas à transição da prófase para a metáfase um foram visualizadas.Populações enriquecidas de espermatócitos metafásicos um foram visualizadas usando os anticorpos contra a tubulina alfa. Para visualizar as células na prófase um, as preparações de abóbora em túbulos foram imunomarcadas com um anticorpo para a Proteína 3 do Complexo Sinaptonêmico. Foram identificados espermatócitos estadiados com leptoteno, zigoteno e paquiteno diploteno.Anticorpos contra a quinase do ciclo celular Aurora B foram usados para visualizar eventos posteriores da meiose um. Esta quinase localiza-se no centrômero interno durante a metáfase, depois se relocaliza na zona média do fuso durante a anáfase e, finalmente, no sulco de clivagem durante a citocinese. Ao manter a integridade celular, a técnica de esmagamento de túbulos permite a visualização da organização subcelular em estruturas associadas à prófase um.A dinâmica do buquê cromossômico pode ser acompanhada através da prófase um. A duplicação do centríolo na disjunção do centrossomo também pode ser visualizada. No estágio inicial do diplóteno, espermatócitos submetidos à disjunção do centrossomo após a duplicação do centríolo foram visualizados com anticorpos contra pericentrina, um componente proteico da matriz pericentriolar e anticorpos contra Centrin-3 para marcar centríolos.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como avaliar rapidamente as características citológicas do desenvolvimento de espermatócitos de camundongos, preservando a integridade celular. Uma vez dominada, a dissecação por esmagamento pode ser realizada em menos de uma hora por mouse. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de aplicar força suficiente para dispersar os espermatócitos dos túbulos seminíferos.Além disso, a concentração do fixador e o tempo de incubação podem ser otimizados dependendo da estrutura celular a ser estudada. Estratégias alternativas de visualização, como abordagens de DNA e RNA de peixes, podem ser facilmente implementadas com esta técnica. Ao complementar as abóboras dos túbulos com ensaios bioquímicos a jusante, é possível avaliar os determinantes mecanicistas da progressão meiótica bem-sucedida.

a-seminiferous-tubule-squash-technique-for-cytological-analysis

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Protocolos para transplante de células germinativas e xeno tecidos testiculares são descritos. Germinativas resultados de células de transplante em doador-derivado espermatogênese em testículos beneficiárias, bem como representa um ensaio de reconstituição funcional para identificação de células-tronco espermatogónias (SSCS). Testículo tecido xeno reproduz o desenvolvimento dos testículos e espermatogênese de espécies doadoras diferentes em camundongos receptores.

Transplante de células germinativas e Tecidos Testículo xeno em Ratos

Este vídeo demonstra o procedimento de isolamento das células de Sertoli dos túbulos seminíferos de camundongos, um componente dos testículos. A digestão enzimática e as lavagens repetidas promovem a liberação de células de Sertoli na solução, que podem ser cultivadas posteriormente para proliferação e crescimento.

Isolamento de células de Sertoli imunorreguladoras de túbulos seminíferos de camundongos

Os métodos para isolar e preparar amostras de testículos de Drosophila (ao vivo e fixo) para geração de imagens por contraste de fase e microscopia de fluorescência são descritos aqui.

Citológica Análise da espermatogênese: Preparados ao vivo e fixo<em&gt; Drosophila</em&gt; Testes

Descrevemos uma estratégia de classificação para espermátides de camundongos usando citometria de fluxo. As espermátides são classificadas em quatro populações altamente puras, incluindo espermogênese redonda (etapas 1-9 da espermiogênese), alongamento precoce (etapas 10-12 da espermiogênese), alongamento tardio (etapas 13-14 da espermiogênese) e espermátides alongadas (etapas 15-16 da espermiogênese). A coloração, o tamanho e a granulosidade do DNA são usados como parâmetros de seleção.

Passo-específico Seleção de mouse Espermátides por citometria de fluxo

Meiose é o processo de desenvolvimento pelo qual gâmetas são formadas através de uma única rodada de replicação de DNA e duas rodadas sucessivas de segregação do cromossomo. Mamíferos meiose pode ser examinado, utilizando uma técnica para preparar os cromossomas se espalha. Aqui, vamos demonstrar um método de preparação de superfície-propagação núcleos de espermatócitos de rato.

Preparação de cromossomas se espalha a partir do Mouse espermatócitos

Liquefação do sêmen é necessária para que o esperma ser libertado do gel seminal. Este estudo fornece os procedimentos para a recolha de sémen de coito de pós o trato reprodutivo feminino e medir o tempo de liquefação do sêmen.

Coleção de pós acasalamento sêmen do trato reprodutivo feminino e medição de liquefação do sêmen em ratos

É apresentado aqui um protocolo para enriquecer spermatocytes do paquíteno, espermátides redondos, e espermátides alongando dos testículos adultos do rato usando um inclinação bovino descontínuo da densidade da albumina do soro com equipamento de laboratório padrão.

Enriquecimento de espermatócitos de Pachytene e Spermatids de testes de camundongo usando equipamento de laboratório padrão

Aqui apresentamos um método simples e eficiente para isolar células germinativas vivas e pós-meiotic de testículos de camundongos adultos. Usando uma baixa citotoxicidade, corante de DNA com proteção violeta e classificação celular ativada por fluorescência, pode-se isolar populações de células espermatogênicas altamente enriquecidas para muitas aplicações a jusante.

Isolamento de células spermatogênicas murinas usando um corante de ligação de DNA permeável celular-permeável violeta

Este protocolo descreve a microdisseção assistida pela transilação de segmentos de túbulos seminiferos adultos representando estágios específicos do ciclo epitelial seminiferante, e tipos de células, e posterior imunossuagem de preparações de abóbora e segmentos de tubulações intactas.

Dissecção assistida por transilluminação de etapas específicas do ciclo epitelial seminifero do rato para análises de imunostaining a jusante

Este artigo relata uma inibição in vivo do CENP-E através de cirurgia abdominal e injeção testicular de GSK923295, um modelo valioso para a divisão meiótica masculina. Usando os ensaios de imunofluorescência, citometria de fluxo e microscopia eletrônica de transmissão, mostramos que a inibição do CENP-E resulta em desalinhamento cromossômico e instabilidade do genoma em espermatócitos de camundongos.

Avaliação funcional da cinesina-7 CENP-E em espermatócitos utilizando inibição in vivo , imunofluorescência e citometria de fluxo

Aqui, apresentamos um método para realizar a injeção redonda de espermátides (ROSI) em camundongos, uma técnica com aplicações clínicas promissoras e utilidade para investigar os mecanismos subjacentes ao desenvolvimento embrionário.

Injeção de espermátide redonda em camundongo

Aprenda a técnica de squash de túbulos seminíferos para análise citológica da espermatogênese em camundongos. Este método preserva a integridade celular e permite visualizar espermatócitos em meiose.

Uma técnica de Squash do tubo seminífero para a análise citológica da espermatogênese usando o modelo de Mouse

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