Uma técnica de Squash do tubo seminífero para a análise citológica da espermatogênese usando o modelo de Mouse

O objetivo geral desta técnica de abóbora de túbulos seminíferos é visualizar as características citológicas de espermatogônias, espermatócitos e espermátides de camundongos, preservando sua integridade celular. Para esta demonstração, nos concentramos na análise de espermatócitos submetidos à meiose. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia reprodutiva masculina, como diferenciação de células-tronco espermatogônicas, segregação cromossômica meiótica e diferenciação pós-meiótica de espermátides redondas.

A principal vantagem dessa técnica é que a integridade celular das células germinativas masculinas é mantida, o que permite o exame de estruturas celulares não facilmente visualizadas com outras técnicas. Este método pode ser usado para melhorar nossa compreensão das causas paternas de infertilidade em qualquer platy. E pode ser aplicado a sistemas de mamíferos, como testículos derivados de camundongos ou doadores de órgãos.

Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldade em fazer uma boa abóbora. Aplicar força suficiente e organizar adequadamente os túbulos são fatores importantes para produzir uma monocamada uniforme de células. Para cada camundongo a ser dissecado, carregue duas placas de Petri de 35 milímetros, uma com três mililitros de PBS e outra com dois mililitros de solução de lise fixadora recém-feita.

Selecione camundongos submetidos à primeira onda de espermatogênese para observar uma população enriquecida de interesse. Depois de sacrificar o mouse, limpe o abdômen com álcool 70% e prossiga com a cirurgia. Faça uma abertura em forma de V na cavidade pélvica abdominal e remova os testículos puxando a almofada de gordura do epidídimo com uma pinça, mas sem perturbar a túnica albugínea.

Transfira os testículos para o prato contendo PBS. Lá, remova a túnica albugínea testicular puncionando o tecido com uma pinça afiada e colete os túbulos seminíferos soltos. Em seguida, transfira os túbulos para o prato com a solução de lise fixadora e deixe a reação prosseguir por cinco minutos à temperatura ambiente.

Durante a incubação, prepare uma lâmina de vidro revestida com poli-L-lisina delineando as bordas da lâmina com uma caneta bloqueadora de líquido e, em seguida, preenchendo a lâmina com 100 microlitros de solução de lise fixadora dentro das bordas. Após a incubação de cinco minutos, use uma pinça e uma tesoura estéreis para separar suavemente e cortar os túbulos seminíferos de modo que segmentos individuais de 20 milímetros sejam obtidos. Em seguida, transfira cinco segmentos de túbulos de 20 milímetros para a lâmina preparada.

Em seguida, continue a dividir os segmentos em comprimentos de 1,5 a três milímetros usando uma tesoura. Agora, com a pinça, organize os segmentos de forma que não se sobreponham. Distribua-os uniformemente pela lâmina.

Idealmente, 20 a 40 comprimentos curtos ocuparão um slide. Comece removendo o excesso de líquido na preparação da lâmina usando um lenço absorvente. Agora, aplique uma lamínula e esmague os túbulos usando a pressão da palma da mão por 10 a 20 segundos.

O objetivo é aplicar força suficiente para dispersar os espermatócitos dos túbulos seminíferos. Usando um microscópio de dissecação, verifique se os segmentos foram rompidos pela abóbora. Em seguida, despeje um pouco de nitrogênio líquido em um pequeno Dewar e congele rapidamente a lâmina por 15 segundos ou até que o líquido pare de borbulhar.

Para prosseguir com o amino blotting, remova imediatamente a lamínula usando uma ponta ou borda afiada. Embora não seja o ideal, as lâminas congeladas podem ser preservadas imediatamente a 80 graus Celsius negativos e salvas por até duas semanas. Para remover a lamínula mais tarde, mergulhe as lâminas em nitrogênio líquido por 15 segundos e retire a lamínula.

Para prosseguir com a marcação de aminoácidos, lave as lâminas três vezes em PBS por cinco minutos por lavagem usando um frasco de Coplin de 50 mililitros. Após as lavagens, aplique um mililitro de tampão de diluição de anticorpos em cada lâmina para servir como um bloco. Deixe a reação do bloco funcionar por uma a duas horas em uma câmara umidificada.

Nunca deixe as lâminas secarem durante este procedimento. Em seguida, bata as lâminas em uma toalha de papel para remover suavemente o tampão e devolvê-las à câmara umidificada. Em seguida, aplique 100 microlitros de anticorpo primário diluído em cada lâmina e transfira-os para 40 graus Celsius, onde a reação de ligação pode ocorrer durante a noite.

Se a solução de anticorpos for escassa, metade do volume pode ser usado se estiver coberto com uma lamínula ou parafilme. No dia seguinte, use três lavagens em PBS para remover o anticorpo primário. Em seguida, aplique 100 microlitros de anticorpo secundário diluído e deixe essa reação durar de uma a uma hora e meia em temperatura ambiente.

Para evitar o fotobranqueamento, mantenha as lâminas em uma câmara escura umidificada durante esta incubação. Em seguida, lave as lâminas duas vezes com PBS. Agora, pontilhar os slides usando um meio de montagem contendo DAPI.

Em seguida, sele as lamínulas com esmalte e prossiga com a imagem. Para tirar imagens, use um microscópio de epifluorescência com uma platina automatizada que permite o movimento preciso do eixo z. Use também uma câmera de alta resolução para capturar imagens.

Agora, avalie os slides usando uma objetiva de 20x. Determine a qualidade da preparação da abóbora. Uma abóbora de boa qualidade terá uma monocamada de núcleos distribuídos uniformemente.

Algumas regiões da abóbora podem ser melhores do que outras. Observe as coordenadas das melhores regiões para encontrá-las facilmente em maior ampliação. Agora, aumente a ampliação para até 100x.

Em seguida, capture imagens de regiões observadas que possuem uma monocamada consistente de núcleos. Defina as pilhas z superior e inferior para garantir que toda a luz em foco seja capturada. O número ideal de z-stacks é geralmente designado pelo software de aquisição de imagem e é diferente para cada objetivo.

A partir das imagens, compile uma imagem de profundidade estendida usando um software de processamento. O software combinará a luz em foco de cada pilha z, o que é essencial para a imagem ideal das preparações de abóbora em túbulos. Usando o método de abóbora de túbulos descrito, populações de células transitórias submetidas à transição da prófase para a metáfase um foram visualizadas.

Populações enriquecidas de espermatócitos metafásicos um foram visualizadas usando os anticorpos contra a tubulina alfa. Para visualizar as células na prófase um, as preparações de abóbora em túbulos foram imunomarcadas com um anticorpo para a Proteína 3 do Complexo Sinaptonêmico. Foram identificados espermatócitos estadiados com leptoteno, zigoteno e paquiteno diploteno.

Anticorpos contra a quinase do ciclo celular Aurora B foram usados para visualizar eventos posteriores da meiose um. Esta quinase localiza-se no centrômero interno durante a metáfase, depois se relocaliza na zona média do fuso durante a anáfase e, finalmente, no sulco de clivagem durante a citocinese. Ao manter a integridade celular, a técnica de esmagamento de túbulos permite a visualização da organização subcelular em estruturas associadas à prófase um.

A dinâmica do buquê cromossômico pode ser acompanhada através da prófase um. A duplicação do centríolo na disjunção do centrossomo também pode ser visualizada. No estágio inicial do diplóteno, espermatócitos submetidos à disjunção do centrossomo após a duplicação do centríolo foram visualizados com anticorpos contra pericentrina, um componente proteico da matriz pericentriolar e anticorpos contra Centrin-3 para marcar centríolos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como avaliar rapidamente as características citológicas do desenvolvimento de espermatócitos de camundongos, preservando a integridade celular. Uma vez dominada, a dissecação por esmagamento pode ser realizada em menos de uma hora por mouse. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de aplicar força suficiente para dispersar os espermatócitos dos túbulos seminíferos.

Além disso, a concentração do fixador e o tempo de incubação podem ser otimizados dependendo da estrutura celular a ser estudada. Estratégias alternativas de visualização, como abordagens de DNA e RNA de peixes, podem ser facilmente implementadas com esta técnica. Ao complementar as abóboras dos túbulos com ensaios bioquímicos a jusante, é possível avaliar os determinantes mecanicistas da progressão meiótica bem-sucedida.