Uma abordagem simples para induzir a neurite auto-imune Experimental em camundongos C57BL/6 para avaliações funcionais e neuropatológicas

Este relatório apresenta uma abordagem simples para induzir com êxito neurite auto-imune experimental (EAN) usando a proteína mielina zero peptídeo de_180-199 (P0) em combinação com adjuvante completo de Freund e coqueluche toxina. Apresentamos um paradigma sofisticado capaz de avaliar com precisão a extensão dos défices funcionais e neuropatologia que ocorrem neste EAN.

O objetivo geral deste procedimento é induzir com sucesso a Neurite Autoimune Experimental ou EAN em um modelo de camundongo para a análise funcional e patológica do processo da doença. O modelo EAN pode ser usado para abordar questões-chave relacionadas à neuropatia periférica. É também um modelo maravilhoso para potencialmente investigar a eficácia de novos agentes terapêuticos.

A principal vantagem dessa abordagem é que ela fornece um paradigma de teste funcional simples e objetivo que pode ser aplicado ao usar o modelo EAN no mouse. Demonstrando o procedimento comigo hoje está Sang Won Yoo, que é um estudante de graduação no laboratório de biologia de neurotrofina e mielina da Universidade de Melbourne. Três dias antes da indução da doença, ligue o aparelho de avaliação da função motora e ligue o botão de luz.

Pegue o mouse e abaixe-o em um recipiente de corante alimentar vermelho. Coloque o mouse no compartimento de caminhada e defina a velocidade da esteira para 15 centímetros por segundo. Ligue a esteira e clique em gravar para usar o sistema de imagem da função de marcha para capturar o movimento de corrida do mouse por 36 segundos.

Após 36 segundos, pare a gravação e a esteira e salve o vídeo da prática na pasta designada. Um dia antes da primeira imunização, use uma seringa de 0,5 mililitro equipada com uma agulha de calibre 30-1/2 para administrar 1,6 microgramas por mililitro de toxina coqueluche em 250 microlitros de PBS IP isotônico de camundongo para camundongos C57BL/6 machos anestesiados de seis a oito semanas de idade. Em seguida, pontue os camundongos quanto aos sinais clínicos de EAN em uma escala de zero a quatro de acordo com a tabela e realize uma avaliação da função motora conforme demonstrado.

No dia seguinte, combine volumes iguais de soluções recém-preparadas de peptídeo em solução salina a 0,9% e 20 miligramas por mililitro de Mycobacterium tuberculosis em adjuvante completo de Freund em um beader de esferas e misture as soluções na velocidade máxima por um minuto em temperatura ambiente. Carregue uma seringa equipada com uma agulha de calibre 23 com o inóculo e inverta e agite a seringa antes de evacuar qualquer ar dentro do eixo da seringa. Antes de administrar o inóculo, remova o cabelo logo lateral à linha média entre as escápulas e desinfete a pele exposta com etanol a 70%.

Em seguida, use uma pinça Adson para agarrar a pele e administrar 50 microlitros da solução ao camundongo injetado com toxina coqueluche por injeção subcutânea. Na manhã seguinte, entregue 1,2 microgramas por mililitro de toxina coqueluche em 250 microlitros de PBS IP, conforme demonstrado, seguido por outra injeção de 1,2 microgramas por mililitro de toxina coqueluche IP 48 horas depois. Três dias depois da terceira injeção de coqueluche, administrar mais 50 microlitros de inóculo recém-preparado no mesmo local de injeção de antes e monitorar o escore clínico e a função motora dos animais duas vezes por semana até o final do experimento.

P0 180-199 EAN induzido por peptídeo em camundongos C57BL/6 leva a uma doença monofásica com início de escore clínico seis dias após a primeira imunização e gravidade de escore máximo em 25 dias após a primeira imunização, seguida por alguma melhora no escore clínico 40 dias após a primeira imunização. Os camundongos começam a falhar em uma tarefa de corrida simples seis dias após a primeira imunização, com pouca capacidade de completar uma tarefa simples de corrida em esteira 35 dias após a imunização, o que não melhora a capacidade de corrida 55 dias após a primeira imunização. O exame de seções semifinas dos nervos ciáticos de camundongos EAN induzidos por peptídeos revela áreas de desmielinização em comparação com os nervos ciáticos de controles saudáveis pareados por idade.

Imagens de microscopia eletrônica de transmissão de alta potência permitem a identificação de características neuropatológicas específicas, como desmielinização, danos à lamela de mielina e sinais de estresse axônico, como inchaço mitocondrial. Esses animais também apresentam dano axonal agudo, como evidenciado pela expressão da proteína precursora beta-amilóide traumática elevada nos nervos ciáticos, que não é observada em tecidos de controle saudáveis pareados por idade. Um alargamento dos nós e uma ruptura nos paranós também são observados.

Uma vez dominadas, as injeções subcutâneas podem ser realizadas em cerca de cinco a 10 minutos por camundongo, com chance mínima de qualquer erro de injeção. Ao tentar este procedimento, é muito importante que você observe o local da injeção para garantir que todo o inóculo permaneça dentro do local da injeção e que nada dele vaze. A captura de vídeo da marcha em esteira é ótima porque permite que outros parâmetros sejam calculados, como a fase do balanço ou o comprimento da passada, e essas medidas podem se tornar importantes ao testar a eficácia de novas terapêuticas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como induzir EAN em camundongos machos C57BL / 6. Além disso, você deve ter uma boa compreensão de como colocar injeções subcutâneas com segurança e precisão, garantindo que não haja erro de injeção. Não se esqueça de que, trabalhando com agulhas e inóculo, existe a chance de ferimentos, especialmente ao usar perfurocortantes.

Portanto, para evitar qualquer chance de lesão, é uma boa ideia sempre usar o fórceps e nunca segurar a pele ou o tecido com a mão e também usar seringas descartáveis, nunca reencapando no processo.