Aplicação da microscopia de velocidade de alta velocidade super-resolução no cílio primário ao vivo

O objetivo geral deste experimento é identificar rotas de transporte de proteínas em cílios primários. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo dos cílios, como diferenças na rota de transporte de proteínas em cílios normais e disfuncionais. A principal vantagem dessa técnica é que ela tem resolução alta o suficiente para ver as rotas de transporte de proteínas de subdifração em células vivas.

Para começar, descongele o estoque congelado de células NIH-3T3 especialmente projetadas a 37 graus Celsius, uma semana e meia antes do experimento. Transfira as células descongeladas para um frasco de cultura de células quadradas de 25 centímetros contendo três mililitros de meio pré-aquecido. Mantenha as células a 37 graus Celsius em uma incubadora de 5% de dióxido de carbono.

Cultive as células até atingirem 80% de confluência e, em seguida, divida as células. Para dividir as células, tripsinize-as com 0,25% de tripsina por dois minutos a 37 graus Celsius. Após a breve incubação, aspirar a tripsina e substituí-la por dois mililitros de meios de cultura pré-aquecidos.

Pipete o meio para quebrar quaisquer aglomerados de células, remova 75% das células do frasco e traga o volume total do meio de volta para três mililitros. Divida as células pelo menos três vezes antes do experimento para garantir a homogeneidade de seu ciclo celular. Dois dias antes do experimento, dividir as células e colocá-las em placas de 60-70% de confluência em uma placa de fundo de vidro de 35 milímetros com 1,5 mililitros do mesmo meio de cultura.

Então, um dia antes do experimento, transfecte quimicamente as células com o plasmídeo desejado. Misture 500-1000 nanogramas do plasmídeo em uma proporção de um para 2,5 com reagente de transfecção e 0,25 mililitros de meio de soro reduzido sem antibióticos por 30 minutos. Uma vez formado o complexo de transfecção, aspire o meio da placa de fundo de vidro de 35 milímetros e substitua-o pela mistura de transfecção de 0,25 milímetros e 1,25 milímetros extras de meio de soro reduzido sem antibióticos e retorne a placa à incubadora.

Para células com construção SSTR3 marcada externamente, remova a mídia do prato de fundo de vidro uma hora antes do experimento. Lave as células cinco vezes com um mililitro de PBS e adicione um mililitro de meio sérico reduzido suplementado com um micromolar de estreptavidina conjugada Alexa 647. No máximo 15 minutos antes do experimento, remova o meio do prato com fundo de vidro e lave as células cinco vezes com um mililitro de PBS.

Em seguida, adicione um mililitro do tampão de imagem no prato de fundo de vidro. Fixe a placa inferior de vidro na platina do microscópio. Encontre uma célula expressa GFP usando o conjunto de filtros GFP e localize uma célula que esteja expressando adequadamente SSTR3-GFP em um cílio primário.

Uma vez encontrada uma célula adequada, alinhe o ponto NPHP4-mCherry na base dos cílios primários com a localização no plano de imagem que corresponde à iluminação de ponto único do laser. Usando a função de encaixe, na guia da câmera da janela de controles de foco, capture uma imagem de epifluorescência das proteínas NPHP4-mCherry e SSTR3 marcadas com proteína de fluorescência verde. Uma vez obtidas as imagens de referência, reduza localmente a concentração de moléculas individuais marcadas por fotobranqueamento da zona de transição com uma iluminação laser de um miliwatt por 20 segundos.

Para se preparar para o rastreamento de uma única molécula, reduza a potência de iluminação do laser para 0,5 miliwatts para moléculas marcadas com Alexa 647. Defina o ganho e a intensificação para o máximo e a taxa de quadros para dois milissegundos. Em seguida, clique no botão de fluxo na guia da câmera da janela de controles de foco e ative o laser de iluminação apropriado.

Registre as moléculas individuais marcadas não fotobranqueadas à medida que são transportadas pela região fotobranqueada da zona de transição. E lembre-se de gravar no máximo dois minutos de vídeo para evitar os efeitos da deriva ciliar. Depois de capturar as moléculas individuais, processe os vídeos usando um algoritmo de ajuste gaussiano 2D, como o Glimpse do laboratório Gelles, que localiza com precisão o centróide do ponto de excitação de cada molécula, função de propagação e uma área abrangente de interesse.

Finalmente, selecione todos os locais de molécula única com uma precisão melhor que 10 nanômetros e corrija o centro dos cílios com base na distribuição de locais de molécula única equipados com uma função gaussiana 2D. Conforme descrito neste vídeo, a iluminação de ponto único pode ser usada para rastrear uma molécula SSTR3 marcada com AF647 através da zona de transição marcada por NPHP4-mCherry. Antes da análise dos dados, sobrepor o vídeo de molécula única à iluminação de campo amplo é uma etapa de validação útil para garantir que o laser esteja alinhado corretamente e que haja uma relação sinal-ruído adequada.

A imagem aqui é uma célula com um cílio primário identificado pela coloração. O IFT20 é um componente do complexo de transporte intraflagelar que transporta carga ao longo dos microtúbulos dentro dos cílios primários, marcados por Arl13b-mCherry. Uma vez identificada, a microscopia de velocidade é usada para rastrear proteínas IFT20-GFP individuais.

Em seguida, um algoritmo de transformação 2D para 3D é usado para produzir a distribuição de densidade de probabilidade espacial da proteína dentro dos cílios primários ao longo de uma única dimensão. Essa região de alta densidade provavelmente colocaliza com os microtúbulos axonemais, de acordo com a localização conhecida da rota de transporte intraflagelar. Ao tentar este procedimento, é importante alinhar com precisão a amostra com o laser para minimizar o erro sistemático.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fazer o rastreamento de molécula única com microscopia de velocidade e saberá como obter a rota de transporte de molécula única nos cílios primários.