Indução e Micro-CT Imaging de malformações cavernosas cerebrais no modelo de Mouse
September 4th, 2017
Este protocolo demonstra a indução da doença malformação cavernosa cerebral em um modelo do rato e usa contraste aprimorado micro computadorizada para medir carga de lesão. Esse método aumenta o valor dos modelos de rato estabelecida para estudar a base molecular e terapias potenciais para malformação cavernosa cerebral e outras doenças cerebrovasculares.
O objetivo geral deste procedimento é induzir malformações cavernosas cerebrais em camundongos neonatais e medir a carga da doença usando micro-CT. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo das doenças vasculares cerebrais, como malformações cavernosas cerebrais. A principal vantagem desta técnica é que a carga de doença da malformação cavernosa cerebral em modelos de camundongos neonatais pode ser determinada com precisão e eficiência em comparação com os métodos existentes.
A demonstração visual desse método é fundamental, pois a indução de malformação cavernosa cerebral e as etapas de análise de micro-TC são difíceis de aprender, pois requer experiência e uso de software sofisticado. Comece dissolvendo o 4-HT em 100% de etanol até uma concentração de 10 miligramas por mililitro. Prepare alaquads de 30 microlitros e armazene a 80 graus Celsius negativos.
No dia do uso, dilua o alaquad a 4-HT em óleo de milho a 0,5 miligramas por mililitro. Em seguida, use uma seringa de insulina para injetar introgástricamente 50 microlitros de 4-HT em filhotes neonatais P1 para induzir lesões experimentais de CCM. Comece a preparação da amostra enchendo uma seringa de 10 mililitros equipada com uma agulha de calibre 29 com três mililitros de paraformaldeído a 2% e PBS.
Em seguida, execute a profusão intracardíaca no filhote P8 eutenizado, inserindo a agulha no ventrículo do coração do camundongo e injetando lentamente todo o volume de paraformaldeído. Depois de usar uma tesoura para separar a cabeça, remova a pele da cabeça e retire o crânio usando uma pinça para dissecar todo o cérebro em 4% de paraformaldeído e PBS. Pós-consertar os cérebros durante a noite a 4-HT graus Celsius.
No dia seguinte, descole os cérebros posteriores usando uma pinça e enxágue com solução de PBS. Em seguida, incube os cérebros posteriores na solução de iodo de Lugol, por 48 horas. Após a incubação, seque brevemente os cérebros posteriores para remover o excesso de solução de iodo de Lugol.
Em seguida, embale os cérebros traseiros corados com iodo de Lugol em tubos de microcentrífuga de 0,65 microlitro e sele completamente com filme plástico de parafina para evitar o encolhimento do tecido. Coloque os tubos da microcentrífuga em tubos de plástico de cinco mililitros com esponjas para evitar que se movam durante a varredura. Monte verticalmente o tubo contendo um cérebro posterior em um suporte de alumínio no sistema micro-CT.
Defina os parâmetros de digitalização. Use 540 projeções e um tempo de exposição de dois segundos com condições de fonte de 50 quilovolts e 10 Watts para adquirir os conjuntos de dados tomográficos. Os gráficos de rádio da varredura são reconstruídos automaticamente pelo software de reconstrução de projeção baseado em hardware, fornecido pelo sistema micro-CT, produzindo uma série de imagens de cortes axiais de 16 bits.
A micro-CT contrastada com iodo de Lugol detectou suficientemente lesões de CCM. Imagens de raios-X digitalizadas foram reconstruídas para produzir imagens 3D do cérebro do camundongo, o que permitiu a visualização de lesões inteiras no parênquima cerebral, em diferentes profundidades e orientações, e avaliação da estrutura na localização 3D das lesões no cérebro. Esta tabela mostra um exemplo de produção quantitativa das lesões individuais marcadas.
Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da doença vascular explorarem mecanismos e opções terapêuticas para malformações cavernosas cerebrais em modelos de camundongos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como induzir a lesão de CCM em modelos de camundongos e como adquirir e analisar a carga de lesão de CCM com a técnica de micro-CT.
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Visão Geral
Este protocolo demonstra a indução de doença de malformação cavernosa cerebral em camundongos neonatais e utiliza micro-CT para medir a carga da lesão. Este método melhora a compreensão da base molecular e potenciais terapias para a malformação cavernosa cerebral e outras doenças cerebrovasculares.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Vascular
- Modelos de Camundongos
Fundo
- Malformações cavernosas cerebrais (CCMs) são lesões vasculares que podem levar a problemas neurológicos significativos.
- Os métodos existentes para medir a carga da doença em modelos de camundongos são frequentemente ineficientes.
- Micro-CT oferece uma forma não invasiva de visualizar e quantificar lesões.
- Compreender CCMs pode fornecer insights sobre outras doenças cerebrovasculares.
Propósito do Estudo
- Induzir malformações cavernosas cerebrais em camundongos neonatais.
- Medir com precisão a carga da doença usando micro-CT.
- Melhorar metodologias para estudar doenças cerebrovasculares.
Métodos Utilizados
- Dissolver 4-HT em etanol para criar uma solução para induzir CCMs.
- Preparação de alíquotas para armazenamento a -80 graus Celsius.
- Utilização de micro-CT com contraste para imagens.
- Demonstração visual do processo de indução e análise.
Principais Resultados
- O método permite uma determinação precisa e eficiente da carga da doença CCM.
- Micro-CT fornece visualização clara das lesões nos modelos de camundongos.
- A indução de CCMs foi alcançada com sucesso em camundongos neonatais.
- Esta abordagem pode facilitar mais pesquisas sobre potenciais terapias.
Conclusões
- Este protocolo aumenta o valor dos modelos de camundongos para estudar CCMs.
- Micro-CT é uma ferramenta poderosa para avaliar a carga de doenças cerebrovasculares.
- Estudos futuros podem se basear nesta metodologia para explorar opções terapêuticas.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Quantitative micro-CT imaging of cerebral cavernous malformations (CCMs) in genetically engineered mouse models enables precise assessment of lesion burden, supporting mechanistic de-risking and target validation in cerebrovascular disease research. This approach enhances predictive confidence for early-stage therapeutic hypothesis testing and informs portfolio triage by providing robust, reproducible lesion quantification. Integration of high-resolution imaging with genetic disease models positions this workflow as a critical inflection point for translational continuity in vascular biology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rigorous interrogation of CCM gene function and pathway involvement in disease models.
- Supports biological de-risking by quantifying lesion formation following targeted gene deletion.
- Provides functional target validation through direct measurement of disease-relevant phenotypes.
- Facilitates predictive confidence in selecting or deprioritizing molecular targets for further study.
Screening & Assay Development
- Establishes validated mouse models and imaging protocols for downstream compound screening.
- Delivers standardized, quantitative lesion metrics suitable for assay development and reproducibility assessment.
- Enables scalable, high-throughput evaluation of therapeutic interventions in preclinical settings.
- Supports reliable comparison of experimental conditions through consistent imaging outputs.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with human disease genetics for translational biomarker development.
- Ensures continuity from genetic discovery to preclinical validation of therapeutic hypotheses.
- Reduces translational risk by providing quantitative endpoints for disease progression and intervention efficacy.
- Strengthens mechanistic understanding of cerebrovascular pathology relevant to clinical translation.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical research by enabling hypothesis-driven genetic manipulation and quantitative phenotyping in mouse models, supporting lead identification and translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Facilitates null hypothesis testing and pathway clarification through genetic lesion induction and quantification.
- Screening: Provides reproducible, quantitative imaging outputs for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Delivers volumetric and numerical lesion data to support statistical comparison across experimental groups.
- Translational Research: Connects genetic models to disease-relevant endpoints for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis platform for diverse cerebrovascular research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes lesion quantification and imaging workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by providing robust preclinical data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of vascular disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in genetic mouse model handling and micro-CT imaging protocols.
- Demands access to high-resolution micro-CT instrumentation and specialized analysis software.
- Necessitates cross-team standardization of imaging parameters and data interpretation.
- May require adaptation of protocols for different genetic backgrounds or lesion types.
- Dependent on precise sample preparation and imaging conditions to ensure data quality.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:57
Induction of Cerebral Cavernous Malformations in Mouse Models
1:38
Sample Preparation for Micro-CT Scans
3:15
Micro-CT Scan of CCM in the Neonatal Mouse Brain
3:57
Results: Rendered 3-D Images Showing CCM Lesions in the Neonatal Mouse
4:34
Conclusion
