Indução e Micro-CT Imaging de malformações cavernosas cerebrais no modelo de Mouse
4 de setembro de 2017
Este protocolo demonstra a indução da doença malformação cavernosa cerebral em um modelo do rato e usa contraste aprimorado micro computadorizada para medir carga de lesão. Esse método aumenta o valor dos modelos de rato estabelecida para estudar a base molecular e terapias potenciais para malformação cavernosa cerebral e outras doenças cerebrovasculares.
O objetivo geral deste procedimento é induzir malformações cavernosas cerebrais em camundongos neonatais e medir a carga da doença usando micro-CT. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo das doenças vasculares cerebrais, como malformações cavernosas cerebrais. A principal vantagem desta técnica é que a carga de doença da malformação cavernosa cerebral em modelos de camundongos neonatais pode ser determinada com precisão e eficiência em comparação com os métodos existentes.
A demonstração visual desse método é fundamental, pois a indução de malformação cavernosa cerebral e as etapas de análise de micro-TC são difíceis de aprender, pois requer experiência e uso de software sofisticado. Comece dissolvendo o 4-HT em 100% de etanol até uma concentração de 10 miligramas por mililitro. Prepare alaquads de 30 microlitros e armazene a 80 graus Celsius negativos.
No dia do uso, dilua o alaquad a 4-HT em óleo de milho a 0,5 miligramas por mililitro. Em seguida, use uma seringa de insulina para injetar introgástricamente 50 microlitros de 4-HT em filhotes neonatais P1 para induzir lesões experimentais de CCM. Comece a preparação da amostra enchendo uma seringa de 10 mililitros equipada com uma agulha de calibre 29 com três mililitros de paraformaldeído a 2% e PBS.
Em seguida, execute a profusão intracardíaca no filhote P8 eutenizado, inserindo a agulha no ventrículo do coração do camundongo e injetando lentamente todo o volume de paraformaldeído. Depois de usar uma tesoura para separar a cabeça, remova a pele da cabeça e retire o crânio usando uma pinça para dissecar todo o cérebro em 4% de paraformaldeído e PBS. Pós-consertar os cérebros durante a noite a 4-HT graus Celsius.
No dia seguinte, descole os cérebros posteriores usando uma pinça e enxágue com solução de PBS. Em seguida, incube os cérebros posteriores na solução de iodo de Lugol, por 48 horas. Após a incubação, seque brevemente os cérebros posteriores para remover o excesso de solução de iodo de Lugol.
Em seguida, embale os cérebros traseiros corados com iodo de Lugol em tubos de microcentrífuga de 0,65 microlitro e sele completamente com filme plástico de parafina para evitar o encolhimento do tecido. Coloque os tubos da microcentrífuga em tubos de plástico de cinco mililitros com esponjas para evitar que se movam durante a varredura. Monte verticalmente o tubo contendo um cérebro posterior em um suporte de alumínio no sistema micro-CT.
Defina os parâmetros de digitalização. Use 540 projeções e um tempo de exposição de dois segundos com condições de fonte de 50 quilovolts e 10 Watts para adquirir os conjuntos de dados tomográficos. Os gráficos de rádio da varredura são reconstruídos automaticamente pelo software de reconstrução de projeção baseado em hardware, fornecido pelo sistema micro-CT, produzindo uma série de imagens de cortes axiais de 16 bits.
A micro-CT contrastada com iodo de Lugol detectou suficientemente lesões de CCM. Imagens de raios-X digitalizadas foram reconstruídas para produzir imagens 3D do cérebro do camundongo, o que permitiu a visualização de lesões inteiras no parênquima cerebral, em diferentes profundidades e orientações, e avaliação da estrutura na localização 3D das lesões no cérebro. Esta tabela mostra um exemplo de produção quantitativa das lesões individuais marcadas.
Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da doença vascular explorarem mecanismos e opções terapêuticas para malformações cavernosas cerebrais em modelos de camundongos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como induzir a lesão de CCM em modelos de camundongos e como adquirir e analisar a carga de lesão de CCM com a técnica de micro-CT.
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Visão Geral
Este protocolo demonstra a indução da doença da malformação cavernosa cerebral em camundongos neonatos e utiliza micro-TC para mensurar a carga de lesões. Este método aprimora a compreensão da base molecular e de terapias potenciais para a malformação cavernosa cerebral e outras doenças cerebrovasculares.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Vascular
- Modelos de Camundongo
Antecedentes
- As malformações cavernosas cerebrais (CCM) são lesões vasculares que podem levar a problemas neurológicos significativos.
- Os métodos existentes para medir a carga da doença em modelos de camundongos são frequentemente ineficientes.
- A micro-TC oferece uma maneira não invasiva de visualizar e quantificar lesões.
- O entendimento das CCMs pode fornecer insights sobre outras doenças cerebrovasculares.
Objetivo do Estudo
- Induzir malformações cavernosas cerebrais em camundongos neonatos.
- Medir com precisão a carga da doença utilizando micro-TC.
- Aprimorar metodologias para o estudo de doenças cerebrovasculares.
Métodos Utilizados
- Dissolver 4-HT em etanol para criar uma solução para induzir CCMs.
- Preparação de alíquotas para armazenamento a -80 graus Celsius.
- Utilização de micro-CT com contraste para imageamento.
- Demonstração visual do processo de indução e análise.
Resultados Principais
- O método permite a determinação precisa e eficiente da carga da doença CCM.
- A micro-TC fornece visualização clara das lesões nos modelos de camundongos.
- A indução de CCMs foi realizada com sucesso em camundongos neonatos.
- Essa abordagem pode facilitar pesquisas adicionais sobre terapias potenciais.
Conclusões
- Este protocolo aumenta o valor dos modelos murinos para o estudo de CCMs.
- A micro-TC é uma ferramenta poderosa para avaliar a carga de doenças cerebrovasculares.
- Estudos futuros podem se basear nesta metodologia para explorar opções terapêuticas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A imagem micro-TC quantitativa de malformações cavernosas cerebrais (CCMs) em modelos de camundongos geneticamente modificados permite a avaliação precisa da carga de lesões, apoiando a desmistificação mecanicista e a validação de alvos na pesquisa de doenças cerebrovasculares. Essa abordagem aumenta a confiança preditiva para testes iniciais de hipóteses terapêuticas e orienta a triagem de portfólios ao fornecer quantificação robusta e reprodutível de lesões. A integração de imagens de alta resolução com modelos genéticos de doenças posiciona esse fluxo de trabalho como um ponto crítico de inflexão para a continuidade translacional nos pipelines de biologia vascular.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação rigorosa da função de genes CCM e do envolvimento de vias em modelos de doenças.
- Auxilia na desmistificação biológica ao quantificar a formação de lesões após deleção direcionada de genes.
- Oferece validação funcional de alvos por meio da medição direta de fenótipos relevantes para a doença.
- Facilita a confiança preditiva na seleção ou despriorização de alvos moleculares para estudos posteriores.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Estabelece modelos de camundongos validados e protocolos de imagem para triagem de compostos em etapas subsequentes.
- Fornece métricas quantitativas padronizadas de lesões, adequadas para o desenvolvimento de ensaios e avaliação de reprodutibilidade.
- Permite avaliação escalável e de alto rendimento de intervenções terapêuticas em ambientes pré-clínicos.
- Permite comparação confiável de condições experimentais por meio de saídas de imagem consistentes.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Alinha modelos pré-clínicos à genética da doença humana para o desenvolvimento translacional de biomarcadores.
- Garante a continuidade da descoberta genética até a validação pré-clínica de hipóteses terapêuticas.
- Reduz o risco translacional ao fornecer desfechos quantitativos para a progressão da doença e eficácia da intervenção.
- Fortalece a compreensão mecanicista da patologia cerebrovascular relevante para a translação clínica.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método conecta a fase inicial de descoberta e a pesquisa pré-clínica ao permitir manipulação genética orientada por hipóteses e fenotipagem quantitativa em modelos de camundongos, apoiando a identificação de compostos líderes e o alinhamento de biomarcadores translacionais.
- Biologia da Descoberta: Facilita a verificação da hipótese nula e a clarificação de vias por meio da indução e quantificação de lesões genéticas.
- Triagem: Fornece saídas de imagem reproduzíveis e quantitativas para prontidão de ensaios e avaliação de compostos.
- Análises: Fornece dados volumétricos e numéricos sobre lesões para apoiar comparações estatísticas entre grupos experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta modelos genéticos a desfechos relevantes para doenças, garantindo continuidade pré-clínica.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma de imagem e análise reutilizável para diversos programas de pesquisa em cerebrovasculatura.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos.
- Valor Operacional: Padroniza a quantificação de lesões e fluxos de trabalho de imagem para reprodutibilidade e escalabilidade.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguir/não prosseguir e melhora a eficiência do capital ao fornecer dados pré-clínicos robustos.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de programas para doenças vasculares.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência no manejo de modelos genéticos em camundongos e em protocolos de imagem por micro-TC.
- Requer acesso a instrumentação de micro-TC de alta resolução e a software especializado de análise.
- Necessita padronização entre equipes quanto aos parâmetros de imagem e interpretação dos dados.
- Pode exigir adaptação dos protocolos para diferentes origens genéticas ou tipos de lesão.
- Depende de preparo preciso das amostras e condições de imagem para garantir a qualidade dos dados.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:05
Title
0:57
Induction of Cerebral Cavernous Malformations in Mouse Models
1:38
Sample Preparation for Micro-CT Scans
3:15
Micro-CT Scan of CCM in the Neonatal Mouse Brain
3:57
Results: Rendered 3-D Images Showing CCM Lesions in the Neonatal Mouse
4:34
Conclusion
