4.9: Corantes FM na Reciclagem de Vesículas

Os corantes FM são corantes de membrana amplamente utilizados para a reciclagem de vesículas. Este é o processo pelo qual uma célula forma vesículas a partir de sua própria membrana para preservar o tamanho da célula, reutilizar proteínas caras e transportar consecutivamente moléculas para o espaço extracelular. Este processo é mais comumente estudado nas sinapses neuronais, onde está envolvido na liberação de neurotransmissores. Além de examinar a reciclagem de vesículas, os corantes FM são usados para estudar vários outros fenômenos, como secreção em células cromafins e reparo da membrana celular após lesão.

Este vídeo se concentrará no uso de corantes FM em um experimento que estuda a reciclagem de vesículas. Examinaremos um protocolo passo a passo que usa corantes FM para quantificar o processo de reciclagem em neurônios estimulados. Por fim, revisaremos alguns exemplos de experimentos, que utilizam essa molécula única de maneiras diferentes.

Antes de entrar no procedimento, vamos primeiro revisar as propriedades bioquímicas dos corantes FM, o que nos ajudará a entender sua função em experimentos de reciclagem de vesículas.

Estruturalmente, os corantes FM são moléculas de estiril que derivam seu nome do cientista que os sintetizou? Fei Mao. Esses corantes têm três características estruturais principais: cabeça, cauda e ponte. A ponte consiste em dois anéis aromáticos com uma região de ligação dupla variável entre eles. Toda esta seção cria o fluoróforo.

É da natureza de qualquer fluoróforo que, quando atingido pela luz recebida em um determinado comprimento de onda de excitação, seus átomos absorvam essa energia e elevem seus elétrons a um estado excitado. Esses elétrons retornam ao estado fundamental emitindo energia vibracionalmente e, finalmente, como luz de comprimento de onda de emissão. A cauda hidrofóbica permite que a molécula de FM se divida nas bicamadas lipídicas da membrana celular, e sua cabeça hidrofílica tem uma carga que restringe sua localização ao folheto externo da membrana.

Portanto, a única maneira de entrar na célula é por endocitose. Os corantes FM são extremamente sensíveis ao ambiente e mostram fluorescência fraca em solventes polares, mas fluorescência forte em ambientes hidrofóbicos como membranas. Isso cria uma marcação de membrana de alto contraste que pode ser visualizada e quantificada usando um microscópio de fluorescência.

Essas propriedades tornam os corantes FM especificamente adequados para avaliar a reciclagem de vesículas nas sinapses. Resumidamente, o processo envolve a incubação das culturas com corante FM. Algumas das moléculas de FM se ligam às membranas, o que aumenta significativamente suas intensidades de fluorescência. Em seguida, um estímulo inicia o processo de internalização da membrana. Portanto, algumas moléculas de FM ficam presas na membrana da vesícula e o restante das moléculas de corante localizadas externas são lavadas.

Na segunda estimulação, as vesículas coradas internalizadas se fundem com a membrana celular para liberar seu conteúdo, e o corante se descompõe rapidamente, resultando em uma rápida diminuição na intensidade da fluorescência. Essa descoloração pode ser quantificada com a ajuda de um microscópio de fluorescência.

Agora que você está familiarizado com os princípios bioquímicos dos corantes FM, vamos revisar um procedimento sobre como realizar um experimento examinando a reciclagem de vesículas sinápticas usando esses corantes.

Amostras limpas e saudáveis de culturas neuronais em lamínulas são preparadas com antecedência. Essas células são movidas para uma solução de corante FM, fazendo com que as membranas sejam marcadas. A lamínula da amostra é então montada na câmara de imagem do microscópio.

Para permitir manipulações de fluidos, como lavagens, as linhas de entrada e saída de fluido são conectadas para formar uma câmara de perfusão selada. Monte a câmara no palco de um microscópio de fluorescência. Conecte os fios à câmara e conecte-os ao estimulador elétrico. Uma vez conectados, os filtros de excitação e emissão são ajustados de acordo com o corante FM usado.

A carga de corante nas vesículas via endocitose é induzida usando uma estimulação elétrica. Após a estimulação, os terminais nervosos podem se recuperar. Em seguida, o corante extracelular é lavado com tampão; Isso também minimiza a fluorescência de fundo. É importante manter a intensidade de excitação mínima porque os corantes FM são propensos ao fotobranqueamento, que é o enfraquecimento da intensidade de fluorescência devido à excitação prolongada. Após a curta incubação, as imagens iniciais são obtidas. Em seguida, a exocitose é induzida com um segundo sinal elétrico.

Depois de medir a fluorescência em diferentes pontos de tempo após a estimulação, no final, os terminais nervosos podem ser exaustivamente estimulados para descarregar todo o corante liberável. A fluorescência remanescente depois disso é considerada como a intensidade de fluorescência de fundo. Em seguida, a fluorescência intrínseca de cada imagem é medida usando o ? Região de interesse? ferramenta em uma área não sináptica da imagem. A fluorescência de fundo e a fluorescência intrínseca são então subtraídas da intensidade de fluorescência de cada ponto de tempo para obter a intensidade de fluorescência normalizada, que é então plotada em relação ao tempo. A diminuição da intensidade ao longo do tempo representa a descoloração, que é uma medida indireta da reciclagem de vesículas.

Agora que revisamos a metodologia, vamos ver como os corantes FM são usados em experimentos específicos.

Discutimos o protocolo usando corantes FM em neurônios estimulados. Aqui, os cientistas estavam interessados em estudar a reciclagem espontânea de vesículas. Eles fizeram isso usando o protocolo estabelecido em combinação com um sistema de imagem sensível o suficiente para detectar pequenas mudanças na intensidade da fluorescência. Os resultados representam uma diminuição na intensidade da fluorescência que se deve diretamente à liberação sináptica espontânea.

Dentro do neurônio pré-sináptico, as vesículas são divididas em dois pools: um pool de reserva ou RP e um pool ou RRP prontamente liberável. Aqui, os cientistas usaram corantes FM para analisar a fração de cada tipo na população de vesículas. Por meio da aplicação sequencial de estímulos elétricos de intensidades crescentes, esses cientistas foram capazes de quantificar as porcentagens relativas de cada tipo de pool de vesículas.

Por fim, o biólogo celular também usa corantes FM para dissecar fatores envolvidos no reparo exocítico de membranas plasmáticas feridas. Neste experimento, os pesquisadores estavam particularmente focados no papel da esfingomielinase, uma enzima modificadora de lipídios, no processo de resselamento da membrana. Primeiro, eles geraram células deficientes na enzima esfingomielinase com a ajuda do tratamento com RNA silenciador. Em seguida, eles trataram essas células e um grupo controle com corante FM exógeno e uma toxina que cria lesões na membrana plasmática. Finalmente, eles visualizaram todas as amostras usando um microscópio confocal. Os resultados mostraram que as células deficientes em esfingomielinase apresentaram acúmulo robusto de moléculas de FM intracelulares. Por outro lado, as células de controle mostraram influxo mínimo de FM, sugerindo um papel da esfingomielinase no reparo da membrana plasmática.

Você acabou de assistir ao vídeo de JoVE sobre corantes FM na reciclagem de vesículas. O vídeo descreveu a bioquímica dos corantes FM, detalhou um protocolo para corar e quantificar a reciclagem de vesículas sinápticas e, finalmente, delineou os experimentos atuais utilizando esses corantes de diferentes maneiras. Como sempre, obrigado por assistir!