Um modelo de trofoblasto humano primário para estudar o efeito da inflamação associada com obesidade materna no Regulamento de autofagia na Placenta

O objetivo geral deste modelo de cultura de células trofoblásticas é medir o efeito da inflamação relacionada à obesidade na regulação de vias críticas em trofoblastos. A principal vantagem deste sistema de controle é que ele estabelece uma relação entre a inflamação mediada por TNF alfa e a regulação gênica na placenta no contexto da obesidade materna. A principal vantagem deste sistema experimental é que ele estabelece relações entre a inflamação mediada por TNF-alfa e a regulação gênica na placenta no contexto da obesidade materna.

Demonstrando o procedimento estarão Bailey Simon e Matt Bucher, técnicos do meu laboratório. O tecido viloso deve ser coletado da placenta o mais rápido possível após o parto, de preferência em 30 minutos ou menos. Com a placa coriônica voltada para cima, use uma pinça e uma tesoura para extirpar, aleatoriamente, dois a três cortes de espessura total, dois a três centímetros da periferia da placenta.

Evite partes da placenta que pareçam anormais. Apare as placas coriônicas e basais e quaisquer vasos sanguíneos grandes. Coloque o tecido viloso resultante em meio quente e completo.

Dentro de 30 minutos após a amostragem do tecido viloso, inicie o isolamento do trofoblasto. Coloque cada pedaço de tecido viloso em um tubo cônico de 50 mililitros cheio de PBS em temperatura ambiente e agite suavemente para liberar o excesso de sangue no tecido. Transvase o PBS e substitua-o por PBS novo.

Repita o enxágue com PBS até que a maior parte do excesso de sangue seja removida. O enxágue PBS será vermelho claro ou rosa quando o lenço estiver bem enxaguado. Coloque o tecido viloso em uma placa de Petri estéril e remova o maior número possível de vasos sanguíneos usando uma lâmina de microscópio para raspar suavemente o tecido viloso mole dos vasos.

Usando uma tesoura, pique finamente o tecido viloso resultante. Transferir o tecido viloso picado para um frasco estéril com solução de digestão de acordo com os volumes calculados com base na actividade específica da tripsina e da DNase. Incube a garrafa de digestão em banho-maria a 37 graus Celsius com agitação a 70 rpm por 35 minutos.

Após 35 minutos, incline o frasco de digestão de lado e deixe que os pedaços de tecido não digeridos se depositem no fundo do frasco. Retirar cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta serológica, evitando o tecido sedimentado. Dispense o sobrenadante através de um filtro de células de 100 mícrons igualmente entre tubos cônicos de 50 mililitros.

Comece a segunda digestão adicionando solução de digestão ao tecido sedimentado restante e incubando a garrafa no banho-maria a 37 graus Celsius. Coloque suavemente de três a cinco mililitros de soro de bezerro recém-nascido, ou NCS, sob o sobrenadante coado da primeira digestão, dispensando lentamente de uma pipeta sorológica no fundo do tubo. Um menisco entre o sobrenadante tenso contendo trofoblastos e NCS deve ser visível.

Centrifugar os sobrenadantes sobre NCS a 1.250 vezes g a 20 graus Celsius durante 15 minutos. O pellet resultante incluirá glóbulos vermelhos na camada inferior, seguidos por uma camada branca contendo células trofoblásticas. Da mesma forma, coe o sobrenadante da segunda e terceira digestão.

Coloque NCS sob o sobrenadante coado e centrifugue a 1.250 vezes g a 20 graus Celsius por 15 minutos. Depois de centrifugados todos os sobrenadantes e removidas as camadas de NCS e sobrenadante, ressuspender cada pellet em cinco mililitros de meio quente e completo e, em seguida, agrupar as suspensões. Divida a suspensão celular igualmente entre dois tubos cônicos de 50 mililitros e centrifugue a 1.250 vezes g a 20 graus Celsius por 15 minutos.

Remova suavemente o sobrenadante e ressuspenda cada um dos grânulos celulares em seis mililitros de meio quente e completo. Para iniciar este procedimento, divida a suspensão celular igualmente entre quatro gradientes de densidade usando uma pipeta de transferência para colocar lenta e cuidadosamente a suspensão celular em cima dos gradientes de densidade. Centrifugue os gradientes de densidade a 1.250 vezes g a 20 graus Celsius por 20 minutos com aceleração e desaceleração mínimas.

Isso deve produzir faixas distinguíveis de células sedimentadas. Remova lenta e cuidadosamente a camada superior do meio de gradiente de densidade até atingir a banda opaca contendo células trofoblásticas. Transferir as bandas do trofoblasto para dois tubos cónicos de 50 mililitros e encher com meio quente e completo.

Inverta suavemente os tubos de três a seis vezes para misturar e centrifugue a 1.250 vezes g a 20 graus Celsius por 15 minutos. Remova o sobrenadante e ressuspenda cada pellet celular em cinco mililitros de meio quente e completo. Combine as suspensões celulares e conte as células viáveis usando um hemocitômetro e azul de tripano.

O próximo passo após a contagem de células é colocar as células em placas. Placa de três milhões de células por poço em cada placa de seis poços. Balance suavemente a placa para frente e para trás e de um lado para o outro para distribuir uniformemente as células.

Deixe as células revestidas na ventilação de fluxo laminar por aproximadamente 30 minutos para permitir que as células se distribuam uniformemente, se assentem e comecem a aderir ao fundo dos poços. Após 30 minutos, coloque as placas em uma incubadora de 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e 95% de umidade. Examine os trofoblastos ao microscópio após 24 horas de cultura para confirmar a fixação e a morfologia adequada do trofoblasto.

As células podem ser tratadas após 24 horas de cultura. Aspire o meio de cultura das células e substitua por dois mililitros de meio suplementado com TNF alfa por poço. Retorne as placas para a incubadora de 37 graus Celsius.

Após 24 horas de exposição ao TNF alfa, substitua o meio suplementado com TNF alfa por meio completo. Incubar por mais 24 horas. 24 horas após a remoção do TNF alfa, aspire o meio e enxágue suavemente as células com PBS em temperatura ambiente.

Adicione diretamente a cada poço 80 microlitros de tampão de ensaio de radioimunoprecipitação gelada contendo inibidores de protease e fosfatase recém-adicionados. Remova as células da placa com um raspador de células. Transfira as células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro, agrupando os poços dentro dos grupos de tratamento.

Congele as células por vórtice dos tubos em alta por pelo menos três intervalos de 15 segundos. Incube as células a quatro graus Celsius com balanço por 15 minutos. Vortex os tubos novamente no alto.

Centrifugue a 10.000 vezes g por cinco minutos a quatro graus Celsius para granular detritos celulares. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Armazene as amostras de proteína celular a 80 graus Celsius até a análise por Western blotting para a proteína de interesse.

Após 72 horas de cultivo, a análise imunocitoquímica da citoqueratina 7, mostrada em vermelho, em trofoblastos primários confirma que as células sofreram sincicialização evidenciada pela presença de massas celulares multinucleadas. Além disso, a análise imunocitoquímica da vimentina, também em vermelho, revelou muito poucos fibroblastos contaminantes. A contra-coloração nuclear é mostrada em azul em ambas as imagens.

O tratamento com TNF alfa até 250 picogramas por mililitro regula positivamente a expressão do rubicão. Em concentrações de TNF alfa superiores a 250 picogramas por mililitro, os níveis de expressão de rubicon diminuíram de volta à linha de base e até abaixo. Da mesma forma, o rubicão é significativamente regulado positivamente em biópsias de tecido viloso congelado de placentas de gestações obesas com fetos femininos em comparação com controles magros.

Uma vez dominado, o isolamento de trofoblastos do tecido viloso pode ser feito em seis a sete horas, se for realizado corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante preparar materiais e reagentes com antecedência para que você possa trabalhar de forma deliberada e eficiente. Após esse procedimento, outros ensaios, como os que medem a bioenergética celular, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a inflamação no ambiente intrauterino obeso afeta a capacidade metabólica dos trofoblastos?

Após esse método, o método de desenvolvimento abriu caminho para o pesquisador placentário estabelecer o efeito do ambiente materno na função do trofoblasto. Depois de assistir a este vídeo, você terá uma boa compreensão de como isolar trofoblastos de tecido viloso para seu experimento de cultura de células e como determinar o efeito da inflamação mediada por TNF alfa na regulação de vias críticas nos trofoblastos. Não se esqueça de que trabalhar com tecido humano, células cultivadas, DMSO, acrilamida e reagentes redutores pode ser extremamente perigoso e precauções, como usar EPI adequado e usar técnica asséptica, devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.