Name: Um modelo de trofoblasto humano primário para estudar o efeito da inflamação associada com obesidade materna no Regulamento de autofagia na Placenta (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Aprenda a isolar trofoblastos humanos primários de tecido viloso placentário para estudar os efeitos da inflamação mediada por TNFα na regulação gênica em obesidade materna.

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Os autores agradecer as mulheres que doaram suas placentas para este estudo. Agradecemos também o departamento de entrega na OHSU e materno e Fetal equipe de pesquisa e trabalho para coordenar a coleção de placenta. Nós estamos gratos ao Eric Wang, pH.d. e Kelly Kuo, MD para apoio e ajuda com métodos experimentais e otimização.
Este trabalho foi financiado pelo NIH HD076259A (AM) e AHA GRNT29960007 (AM).

placentas foram coletadas a partir do trabalho e entrega unidade hospital universitário sob um protocolo aprovado pela institucional Review Board da Oregon Health and Science University, em Portland, Oregon, com consentimento informado da pacientes.
 1. coleção de tecido placentário <ol><li>preparação Nota: todos os equipamentos que encontra o tecido devem ser estéril.
	<ol><li>Esterilizar o equipamento dissecação por autoclavagem durante 60 minutos a 121 ° C.</li>
		<li>Use equipamentos de proteção individual (EPI): laboratório casacos/vestidos/avental, luvas e máscara com um protetor facial ou óculos de proteção.</li>
		<li>Vez em banho de água e ajuste a 37 ° C.</li>
		<li>Aquecer dois tubos cónicos 50ml, cada contendo 25 mL de mídia completa (Iscove &#39; s modificado Dulbecco &#39; s suplementado com 10% FBS e 1% penicilina/estreptomicina, tabela 3) em banho maria a 37 ° C.</li>
		<li>Com consentimento paciente informado, obter uma placenta, imediatamente após o parto por cesariana.</li>
		<li>Tornar-se familiarizado com a placenta. O cordão umbilical está inserido no lado fetal (placa coriônica) e os vasos sanguíneos podem ser vistos irradiando para fora do local de inserção do cordão umbilical. Do lado oposto é o lado materno, ou placa basal. Inclui a decidua e estruturas que contêm árvores de navio, chamadas cotilédones.</li>
	</ol></li> <li>Amostragem de tecido das vilosidades Nota: tecido das vilosidades deve ser amostrado da placenta logo que possível após o parto, de preferência em 30 min ou menos.
	<ol><li>Com a placa coriônica virada para cima, impostos especiais de consumo 2-3 seções de espessura total (aproximadamente 2,5 cm x 2,5 cm de tamanho) 2-3 cm da periferia da placenta em aleatórias, usando pinças e tesoura ( figura 1A). 
		Nota: Evite partes da placenta que aparecem anormais (ou seja, brancas calcificações).</li>
		<li>Aparar as placas basais e gonadotrofina e qualquer grandes vasos sanguíneos.</li>
		<li>Coloque o tecido das vilosidades resultante ( figura 1B, cerca de 80-120 g total) em mídia completa quente e começar o isolamento do trofoblasto dentro de 30 min de amostragem. 
		Nota: Alguns ensaios a jusante e aplicativos são afetados pela duração do período de latência entre entrega, amostragem e isolamento de trofoblasto. É melhor manter esses períodos como curto possível e consistente entre isolamentos.</li>
		<li>Usando as técnicas descritas em etapas 1.2.1 - 1.2.2, amostra 5 seções aleatória 1 x 1 cm do tecido das vilosidades do outro lado da placenta (incluindo o centro).</li>
		<li>Corte cada amostra de tecido das vilosidades de 1 x 1 cm em pequenos pedaços de 4-5 (aproximadamente 30 mg cada), coloque em tubos de microcentrifuga de 2 mL e flash congela em líquido N 2. Loja a-80 ° C para uso em análises posteriores.</li>
	</ol></li></ol> 2. Isolamento de Trophoblasts do tecido das vilosidades <ol><li>preparação Nota: usar equipamento estéril e executar procedimentos que envolvam células numa vizinhança de fluxo laminar.
	<ol><li>Thaw quatro gradientes de densidade congelado (tabela 1, veja a tabela dos suprimentos essenciais, reagentes e equipamentos, material suplementar) a 4 ° C a noite antes que chegue a placenta. 
		Nota: Alternativamente, gradientes de densidade podem ser feitas no dia do isolamento.</li>
		<li>Vez na centrífuga e conjunto a 20 ° C. 
		Nota: Todas as etapas de centrifugação estão em máxima aceleração e desaceleração, a menos que especificado em contrário.</li>
		<li>Preparar 1 x tampão HEPES solução salina (HBSS) suplementada com Ca + 2 e Mg + 2 (tabela 3).</li>
		<li>Tripsina aquecida a 37 ° C.</li>
		<li>DNase diluir aproximadamente 2720 kilounits/ml em estéril suplementado HBSS.</li>
		<li>Quente 50 mL de soro de bezerro recém-nascido (NCS) a 37 ° C.</li>
		<li>Quente de mídia completa a 37 ° C.</li>
		<li>Quente mídia congela (90% FBS, 10% de DMSO, tabela 3) a 37 ° C. 
		Atenção: DMSO é tóxico e deve ser manuseado com luvas.</li>
		Buffer de <li>preparar digestão (tabela 2 e 3), misturando 308 mL de completadas HBSS, 50 mL de tripsina (3751.7 BAEE unidades/mL) e 0,5 mL de DNase (379.4 kilounits/mL) em um frasco estéril. 
		Nota: O tempo aproximado necessário para isolar as células do tecido das vilosidades é 7 h.</li>
	</ol></li> <li>Processamento do tecido das vilosidades <ol><li>enxaguar cada pedaço de tecido das vilosidades em um tubo cônico de 50ml repleto de temperatura fosfato tampão salino (PBS). Repetir e substituir a PBS conforme necessário até que o sangue em excesso é removido (lavagem PBS será luz vermelha ou cor de rosa quando o tecido é completamente enxaguado).</li>
		<li>Coloque o tecido das vilosidades em uma placa de Petri estéril e remover a partir de muitos vasos sanguíneos possível raspando suavemente o tecido mole das vilosidades dos vasos usando uma lâmina de microscópio.</li>
		<li>Picar finamente o tecido das vilosidades resultante usando tesouras.</li>
	</ol></li> <li>Digestão de tecido das vilosidades e isolamento bruto de Trophoblasts <ol><li>transferir o tecido das vilosidades picado para um frasco estéril com solução de digestão de acordo com os volumes calculados com base na atividade específica de tripsina e DNase (165 mL, tabela 2).</li>
		<li>Após 35 min de incubação em um banho de água de 37 ° C com agitação de 70 rotações por minuto (rpm), incline a garrafa de digestão de lado e permitir que os pedaços não digeridos de tecido repousar no fundo da garrafa. Cuidadosamente, elaborar o sobrenadante com uma pipeta sorológica, evitando o tecido combinado.</li>
		<li>Dispensar o sobrenadante através de um filtro de célula de 100 µm igualmente entre tubos de Erlenmeyer de 50 mL. 
		Nota: Para poupar tempo, é aconselhável começar a segunda digestão adicionando solução de digestão (110 mL, tabela 2) para os restantes estabeleceram-se tecido e retomando a incubação, conforme descrito na etapa 2.3.2.</li>
		<li>Suavemente camada 3-5 mL de NCS debaixo do sobrenadante tenso por dispensar lentamente com uma pipeta sorológica na parte inferior do tubo. Um menisco entre o NCS e tensa sobrenadante (contendo trophoblasts) deve ser visível ( Figura 2A).</li>
		<li>Centrifugar os sobrenadantes sobre NCS a 1.250 x g, durante 15 min a 20 ° C. O sedimento resultante incluirá glóbulos vermelhos na camada mais inferior, seguida por uma camada branca que contém as células do trofoblasto ( Figura 2B).</li>
		<li>Repita etapas 2.3.2 - 2.3.5 para cada um dos segundo e terceiros digestões (adição de 110 mL e 83,5 m, respectivamente, da solução de digestão para a garrafa de tecido, tabela 2).</li>
		<li>Uma vez que todos os sobrenadantes tem sido centrifugadas, cada Ressuspender em 5 mL de mídia completa quente e então juntar as suspensões.</li>
		<li>Dividir a suspensão de eritrócitos igualmente entre dois tubos de Erlenmeyer de 50 mL e centrifugar 1.250 x g por 15 min a 20 ° C.</li>
		<li>, Suavemente, remover o sobrenadante e ressuspender cada uma as pelotas de célula em 6 mL de quente complETE mídia.</li>
	</ol></li> <li>Centrifugação densidade <ol><li>dividir a suspensão de eritrócitos igualmente entre quatro gradientes de densidade (3 mL cada) por camadas de lentamente e com cuidado a suspensão de células na parte superior os gradientes de densidade, com uma pipeta de transferência.</li>
		<li>Centrifugar os gradientes de densidade a 1.250 x g por 20 min a 20 ° C, com mínima aceleração e desaceleração. Isto deve produzir bandas distinguíveis das células sedimentadas (tabela 4).</li>
		<li>Lentamente e cuidadosamente remover as camadas superiores da mídia de gradiente de densidade (DGM) até atingir a opaca faixas contendo células do trofoblasto (entre 35-50% DGM) (tabela 4).</li>
		<li>Transferir as bandas do trofoblasto em dois tubos de 50ml cónico e encha com mídia completa quente.</li>
		<li>Inverter suavemente os tubos 3 - 6 vezes para misturar e centrifugar a 1.250 x g, durante 15 min a 20 ° C.</li>
		<li>Remover o sobrenadante e ressuspender cada célula em 5 mL de mídia completa quente. Combinar as suspensões celulares e contagem de células viáveis usando um hemocytometer e azul de Trypan (ou método de contagem de células preferencial).</li>
	</ol></li> <li>Contagem de células com um Hemocytometer <ol><li>misturar a suspensão de células pipetando para cima e para baixo com uma pipeta sorológica ou suavemente o tubo várias vezes por inversão.</li>
		<li>Combine partes iguais de suspensão de células e Trypan azul (ou seja, 20 µ l cada) em um tubo separado e misture suavemente.</li>
		<li>Incubar durante 1-2 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Suavemente dispensar 15-20 µ l da célula-Trypan azul mistura entre a lamínula e o hemocytometer e permitir que as células difundir em toda a rede por acção capilar.</li>
		<li>Contagem de células viáveis (células mortas vão ser manchadas azul profundo) em cada um dos quadrantes quatro 4 x 4 com um contador de contagem. Empregar um sistema de contagem garantir que as células não são contadas mais de uma vez (ou seja, não contam as células que tocam o fundo ou limites à esquerda). 
		Nota: Cada 4x4 quadrante deve conter entre 50-150 células. Muito poucas ou muitas células podem levar a um over ou subestimação do número de celular.</li>
		<li>Média a célula total conta de cada um dos 4x4 quadrantes, multiplique por 10-4 e em seguida multiplicar pelo fator de diluição (suspensão de células para Trypan azul) para calcular o número de células por mL.</li>
		<li>Multiplicar o número de células por mL pelo volume total da suspensão de células para calcular o rendimento total celular. 
		Nota: Espera-se cerca de 100 milhões de células de isolamentos começando com 80-120 g de tecido das vilosidades.</li>
	</ol></li> <li>Células chapeamento <ol><li>3 milhões de células/poço (3,3 x 10 5 células por cm 2) da placa em uma placa de 6 (2 mL de suspensão por alvéolo) e gentilmente balançar para frente e para trás e lado a lado para distribuir uniformemente as células. 
		Nota: Trophoblasts exigem placas de cultura de tecidos tratada a aderir corretamente. Uma monocamada de células é necessário para promover a syncytialization.</li>
		<li>Deixar as células chapeadas do capuz de fluxo laminar para cerca de 30 min permitir que as células distribuir uniformemente, resolver e começam a aderir ao fundo dos poços, antes de colocar na incubadora.</li>
		<li>Células de cultura por até 72 h (com alterações diárias de mídia) em uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO 2 e 95% humidade. 
		Nota: Examine os trophoblasts sob um microscópio em 10 / 20 x cada 24h de cultura. Trophoblasts não proliferam e não podem ser passadas. Ao longo de 72 h da cultura, os redondos trophoblasts individuais fundem-se para formar um sincício ( Figura 3A e B).</li>
	</ol></li> <li>Congelando células <ol><li>Pellet de células não utilizadas por centrifugação a 1.250 x g durante 10 minutos a 20 ° C.</li>
		<li>Aspire tanta mídia quanto possível da pelota.</li>
		<li>Resuspenda o pellet em congelamento mídia (tabela 3).</li>
		<li>Congelar as alíquotas a-80 ° C em um recipiente de congelação com 100% de isopropanol. Transferir as alíquotas congeladas para líquido N 2 o dia seguinte para armazenamento a longo prazo. 
		Nota: As células podem ser cultivadas após congelamento.</li>
	</ol></li> <li>Células thawing <ol><li>remover uma alíquota de células congeladas e descongelar em banho maria a 37 ° C durante a agitação. Remover a alíquota do banho antes de ele tem totalmente descongelados para líquido.</li>
		<li>Transferir imediatamente as células descongeladas para um tubo cônico de 15 ml. Começando a abrandar em primeiro lugar, adicionar 10 mL de mídia completa com mistura intermitente.</li>
		<li>Inverter o tubo várias vezes para misturar.</li>
		<li>Centrifugar a 200 x g durante 10 minutos a 20 ° C.</li>
		<li>Aspire o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 2-5 mL de mídia completa quente.</li>
		<li>Contar as células e placa conforme descrito anteriormente.</li>
	</ol></li></ol> 3. Tratamento de Trophoblasts primária com TNFa, coleção de lisados celulares e mancha ocidental <ol><li>preparação <ol><li>aquecer mídia completa a 37 ° C.</li>
		<li>Fazer um estoque de 10 µ g/mL de TNFa em mídia completa e loja a-20 ° C até que esteja pronto para uso.</li>
		<li>Fazer um 1 µ g/mL estoque de trabalho de TNFa em mídia completa quando estiver pronto para tratar as células. Série diluir o estoque de trabalho TNFa 10 4 pg/mL, 10 3 pg/mL, 500 pg/mL, pg/mL 250 e 125 pg/mL em mídia completa. 
		Nota: A concentração de TNFa de 10 4 pg/mL é moderadamente citotóxica. Ajuste das concentrações TNFa testado vai depender as especificidades das aplicações a jusante desejadas.</li>
	</ol></li> <li>Tratar pilhas com TNFa <ol><li>após 24h de cultura, Aspire o meio de cultura de células e substituir com 2 mL de TNFa suplementado mídias por alvéolo em placas 6-bem (pelo menos dois poços por tratamento e veículo controle).</li>
		<li>Após 24 h de exposição TNFa (48 h de cultura), substituir as mídias de TNFa suplementada com mídia completa.</li>
	</ol></li> <li>Colheita de células e proteínas totais <ol><li>após 72 h de cultura (24 h após a remoção do TNFa), mídia, Aspire, lave suavemente células com temperatura PBS e adicione 80 µ l de frio gelo Radioimmunoprecipitation ensaio Reserva (RIPA) contendo recentemente adicionados inibidores de protease e fosfatase (tabela 3) diretamente a cada poço.</li>
		<li>Remover as células da placa com um raspador de célula. Transferir as células para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL, pool de poços nos grupos de tratamento.</li>
		<li>Lisar as células vortexing os tubos em alta pelo menos três intervalos de 15 s.</li>
		<li>Incube as celulas a 4 ° C, com balanço de 15 min. 
		Observação: como alternativa, depois passo 3.3.3., as células podem ser incubadas em gelo por 15 min com agitação intermitente por agredir o tubo, num Vortex, ou pipetagem acima eWN.</li>
		<li>Repita o passo 3.3.3.</li>
		<li>Centrifugar os tubos a 10.000 x g por 5 min a 4 ° C, a pelota restos celulares.</li>
		<li>Transferência do sobrenadante (contendo proteína celular) para um novo tubo de 1,5 mL microcentrifuga e conservar a -80 ° C. 
		Nota: O protocolo pode ser parado aqui e retomado em um momento posterior. É aconselhável fazer várias alíquotas de amostras de proteína celular para evitar vários ciclos de congelamento e descongelamento.</li>
		<li>Determinar a concentração de proteínas totais por um método preferencial, como um ensaio de ácido bicinchoninic (BCA, veja a tabela dos suprimentos essenciais, reagentes e equipamentos, material suplementar).</li>
	</ol></li> <li>SDS-PAGE e Western Bloting para Rubicon ou proteína de interesse Nota: siga a mancha protocolos de acordo com o fabricante do ocidental &#39; instruções s usando um sistema de laboratório preferido.
	Gel de <ol><li>carga entre 20-40 µ g da proteína total em tampão de amostra (tabela 3) por bem em um 12% do acrilamido. Separar proteínas por SDS-PAGE em marcha tampão (tabela 3).</li>
		<li>Wet-transferência as proteínas do gel para uma membrana de polivinilideno difluoreto (PVDF) de acordo com o fabricante &#39; instruções de s no buffer de transferência (tabela 3).</li>
		<li>Incubar a membrana 5% leite em pó em carbono salina com 0.1% Tween 20 (TBST, tabela 3) pelo menos 1 h à temperatura ambiente com balanço.</li>
		<li>Incubar a membrana em um anticorpo primário Rubicon (veja a tabela dos suprimentos essenciais, reagentes e equipamentos, material suplementar) a 1: 500 1% leite em pó em TBST durante a noite a 4 ° C, com balanço.</li>
		<li>Delicadamente, lave a membrana 3 x 5 min em TBST e 1 x 5 min na TBS em temperatura ambiente com balanço.</li>
		<li>Incubar a membrana em 1: 2000 - 1:5000 anticorpo secundário (HRP-lig ou preferencial conjugado visível, consulte a tabela dos suprimentos essenciais, reagentes e equipamentos, material suplementar) 5% leite em pó em TBST pelo menos 1 h à temperatura ambiente com balançando.</li>
		<li>Repetir o procedimento de lavagem descrito no passo 3.4.5 e visualizar o blot com um substrato de visualização adequada (ou seja, quimioluminescente) em um sistema de imagem.</li>
		<li>Repetir o procedimento de lavagem descrito no passo 3.4.5 e sonda a membrana para β-actina ou um controle de carregamento preferencial de acordo com o fabricante &#39; instruções de s.</li>
		<li>Em software de análise de imagem preferida, analisar a expressão do Rubicão por quantificação manual de absorvância (intensidades de banda), subtração de absorvância do fundo e a normalização à carga correspondente controlar intensidades de banda. Realizar análises estatísticas, conforme apropriado para testar alterações estatisticamente significativas nos níveis de proteína.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

A placenta, responsável pela regulação do crescimento do feto, exibe a função comprometida no ambiente obesos6. Apesar da alta demanda metabólica de trophoblasts, placenta com obesidade materna apresentam respiração mitocondrial disfuncional6,19. Alterações no metabolismo da placenta podem contribuir para o aumento da incidência de complicações e resultados de fetais adversos observados em gravidezes obesos3,</...

A obesidade é um estado inflamatório, caracterizado por inflamação crônica de baixo grau, decorrentes de excesso de tecido adiposo e disponibilidade de nutrientes. Na obesidade, cytokines proinflammatory são elevados em tecidos metabólicos, bem como sistemicamente em circulação. Um conjunto robusto de provas demonstrou que TNFa é significativamente elevada no cenário da obesidade com implicações na resistência à insulina e disfunção metabólica1. Ativação de TNFa também contribui para a patogênese da doença em condições tais como câncer e auto-imunidade, tornando-se uma atraente alvo terapêutico2.
Inflamação na obesidade é agravada pela gravidez, também, um estado proinflammatory3,4. Anteriormente mostrou que aumenta o conteúdo de TNFa placentário com adiposidade materna em gestações com fetos do sexo femininos. Além disso, tratamento de TNFa inibe a respiração mitocondrial nas células do trofoblasto feminino mas não masculino, sugerindo que o TNFa está envolvida na regulação do metabolismo da placenta em uma maneira sexualmente dimórficos5. Obesidade materna está associada com o aumento da incidência de uma variedade de complicações durante a gravidez, incluindo natimorto, com fetos masculinos, sendo a mais suscetível de3,6,7,8 . Devido ao seu papel chave na interface materno-fetal, alterações na capacidade funcional da placenta no ambiente intra-uterino obeso em resposta a sinalização inflamatória podem desempenhar um papel importante na mediação os resultados das gestações obesos.
Cytotrophoblasts e syncytiotrophoblasts no tecido das vilosidades da placenta são críticos para a troca de nutrientes e oxigênio entre a mãe e o desenvolvimento do feto9e sinalização do sistema endócrino. Interrupções na capacidade funcional de cytotrophoblasts das vilosidades (doravante referida como trophoblasts) podem colocar em risco a saúde fetal e desenvolvimento. Este protocolo descreve um método para amostragem de tecido das vilosidades da placenta humana termo embora dissecando as placas coriônica e basais, juntamente com um processo otimizado para o isolamento de trophoblasts para cultura de células primárias. Este protocolo é derivado de metodologias estabelecidas envolvendo digestão enzimática do tecido das vilosidades para liberar as células da matriz extracelular, seguido por centrifugação diferencial de densidade para isolar trophoblasts10, 11,12. Este detalhes de protocolo uma abordagem em que trophoblasts primários de placentas de gestações magras são tratados com meio de cultura suplementado com TNFa para simular um componente do meio de inflamatória associada com obesidade materna. Finalmente, um procedimento simples para a colheita do lisado celular total de TNFa-tratados trophoblasts, seguidos por Western borram para detectar alterações na expressão gênica é descrito.
Enquanto esse modelo não recapitular o obesogénico no utero ambiente em sua totalidade, ele fornece um sistema controlado que permite analisar a contribuição individual de inflamação mediada por TNFa em resposta a trophoblasts a obesidade materna. Este modelo proporciona a ambos a oportunidade de descobrir ou confirmar alvos moleculares diretamente regulamentados pela sinalização de TNFa em trophoblasts, bem como permite testar se observadas alterações em padrões de expressão de gene na vivo na placenta com maternal a obesidade pode ser resultado de inflamação mediada por TNFa.
A abordagem descrita aqui foi implementada para testar o efeito da inflamação mediada por TNFa sobre o Regulamento de autofagia em trophoblasts humanas. Trophoblasts de obesos gravidezes com fetos do sexo masculino apresentam interrompido autophagic volume de negócios, ou de maturação autophagosome13. Uma proteína chamada Rubicon (RUN domínio da proteína Beclin1-interagindo e rica em cisteína contendo), que está localizada a lisossomos e tarde endossomos, tem sido recentemente descrito como um "freio" no processo de autophagic de volume de negócios porque funciona como um negativo regulador de maturação de autophagosome14,15. Na verdade, Rubicon é um raro exemplo de uma proteína que impede a autofagia, o que o torna um alvo terapêutico valioso. Muito pouca informação está disponível sobre o significado fisiopatológico de Rubicon, exceto por seus papéis na resposta imune inata para microbials16,17 e casos proteção18. Usando o protocolo descrito aqui, se verificar que o Rubicon é upregulated em femininos trophoblasts primárias em resposta ao tratamento com concentrações crescentes de TNFa até 250 pg/mL. O Regulamento de Rubicon pode desempenhar um papel na tarifa de fetos como feminino melhor do que os machos em gestações com obesidade materna. Recapitulando a inflamação associada com obesidade materna ex vivo expondo trophoblasts humanos para TNFa exógena fornece uma plataforma para estudar o impacto do ambiente intra-uterino obeso na regulamentação dos caminhos críticos no Trophoblasts e, por extensão, a função placentária.

<table><tbody><tr><td>10X HBSS</td><td>Gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 (anhyd.)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016-100G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 (anhyd.)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506-500G</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td></td><td></td>LS002139</tr><tr><td>Inibidores de protease / fosfatase</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>88668</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Invitrogen</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15576-028</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-600</td><td></td></tr><tr><td>Desoxicolato de sódio.</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ6228822</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Iscove' s Dulbecco modificado ' s Médio (IMDM)</td><td>Gibco</td><td>12440-046</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Soro Neonatal de Bezerro (NCS)</td><td>Gibco</td><td>26010-074</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina (Pen/Strep)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>10% Formalina</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-427-098</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>TNF&alpha;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SRP3177-50UG</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td> <td>Gibco</td><td>70013-032</td><td></td></tr><tr><td>K2EDTA tubos de coleta de sangue vacutainer</td><td>BD</td><td>366450</td><td></td></tr><tr><td>Percoll (Mídia de gradiente de densidade, DGM)</td> <td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 6 poços</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainers</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mL, natural</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363352</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Corning</td><td>25-900-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra System</td><td>Bio-Rad</td><td>1658001FC</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad Mini Trans-Blot Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1658033</td><td></td></tr><tr><td>TGX FastCast Kit de Acrilamida, 12% </td><td>Bio-Rad</td><td>1610175</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean 3 Câmara Multi-Fundição</td><td>Bio-Rad</td><td>1654112</td><td></td></tr><tr><td>4X Laemmli Tampão de Amostra</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Bio-Rad</td><td>1610718</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Leite em pó desnatado instantâneo</td><td>cravo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rubicon (D9F7) Tecnologia</td><td>de sinalização celular</td> mAb de coelho <td>8465S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-beta; - Anticorpo monoclonal de actina produzido em camundongo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2228-100UL</td><td></td></tr><tr><td>Anti-coelho IgG, HRP-ligado Anticorpo</td><td>Celular Tecnologia de sinalização</td><td>7074S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG, anticorpo</td> <td>ligado a HRPTecnologia de Sinalização Celular</td><td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico PLUS Substrato Quimioluminescente</td><td>Thermo Scientific</td><td>34578</td><td></td></tr></tbody></table>

um modelo de trofoblasto humano primário para estudar o efeito da inflamação associada com obesidade materna no regulamento de autofagia na placenta

A Primary Human Trophoblast Model to Study the Effect of Inflammation Associated with Maternal Obesity on Regulation of Autophagy in the Placenta

Obesidade materna está associada com um risco aumentado de resultados perinatais adversos que são provavelmente mediadas por comprometido função placentária que pode ser atribuída, em parte, a desregulação de autofagia. Aberrantes alterações na expressão dos reguladores de autofagia nas placentas de gestações obesas podem ser regulamentadas por processos inflamatórios associados com obesidade e gravidez. Descrito aqui é um protocolo para a recolha de amostras de tecido das vilosidades e isolamento de cytotrophoblasts das vilosidades da placenta humana termo para cultura de células primárias. Isto é seguido por um método para simular o milieu inflamatório no ambiente intra-uterino obeso, tratando trophoblasts primários de gravidezes magras com fator de necrose tumoral alfa (TNFa), uma citocina proinflammatory que é elevada na obesidade e no gravidez. Através da implementação do protocolo descrito aqui, encontra-se que a exposição a exógena TNFa regula a expressão do Rubicão, um regulador negativo de autofagia, em trophoblasts de magras gravidezes com fetos do sexo femininos. Embora uma variedade de fatores biológicos no ambiente intra-uterino obeso manter o potencial de modular caminhos críticos no trophoblasts, este sistema ex vivo é especialmente útil para determinar se os padrões de expressão observada na vivo na placenta humana com obesidade materna são um resultado direto de TNFa sinalização. Em última análise, essa abordagem oferece a oportunidade de analisar as implicações regulamentares e moleculares da inflamação associada com obesidade materna na autofagia e outras vias celulares críticas no trophoblasts que têm o potencial de impacto função da placenta.

Prazo placenta humana de magra (índice de massa corporal de pré-gravidez (IMC) &lt; 25) mães com gestações sem complicações carregando prole feminina foram coletadas e amostradas dentro de 15 minutos da entrega por cesariana (sem trabalho). As placentas foram examinadas para a ausência de calcificações e desenvolvimento típico: pesando entre 300-600 g com o cordão umbilical e membranas removidas, rodada em forma, entre 15-25 cm de diâmetro e o cordão umbilical inserido no meio da placenta...

Apresentado aqui é um protocolo para amostragem de tecido placentário humano das vilosidades seguido pelo isolamento de cytotrophoblasts para cultura de células primárias. Tratamento de trophoblasts com TNFa recapitula a inflamação no ambiente intra-uterino obeso e facilita a descoberta de alvos moleculares regulada pela inflamação na placenta com obesidade materna.

Um modelo de trofoblasto humano primário para estudar o efeito da inflamação associada com obesidade materna no Regulamento de autofagia na Placenta

Maternal obesity is associated with an increased risk of adverse perinatal outcomes that are likely mediated by compromised placental function that can be ...

O objetivo geral deste modelo de cultura de células trofoblásticas é medir o efeito da inflamação relacionada à obesidade na regulação de vias críticas em trofoblastos. A principal vantagem deste sistema de controle é que ele estabelece uma relação entre a inflamação mediada por TNF alfa e a regulação gênica na placenta no contexto da obesidade materna. A principal vantagem deste sistema experimental é que ele estabelece relações entre a inflamação mediada por TNF-alfa e a regulação gênica na placenta no contexto da obesidade materna.Demonstrando o procedimento estarão Bailey Simon e Matt Bucher, técnicos do meu laboratório. O tecido viloso deve ser coletado da placenta o mais rápido possível após o parto, de preferência em 30 minutos ou menos. Com a placa coriônica voltada para cima, use uma pinça e uma tesoura para extirpar, aleatoriamente, dois a três cortes de espessura total, dois a três centímetros da periferia da placenta.Evite partes da placenta que pareçam anormais. Apare as placas coriônicas e basais e quaisquer vasos sanguíneos grandes. Coloque o tecido viloso resultante em meio quente e completo.Dentro de 30 minutos após a amostragem do tecido viloso, inicie o isolament

a-primary-human-trophoblast-model-to-study-effect-inflammation

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Neste protocolo, descreve-se a dissecção de placenta de rato sobre a gravidez d10.5, seguido de isolamento das células trofoblásticas, utilizando um gradiente de Percoll. Em seguida, demonstrar o uso de células isoladas, num ensaio de invasão de Matrigel.

Isolamento de células primário do mouse trofoblasto e Ensaio invasão do trofoblasto

Este manuscrito apresenta um modelo in vitro único de células citotrofoblásticas vilosas humanas imunopurificadas cultivadas sob hipóxia/reoxigenação. Este modelo é adequado para estudar os efeitos protetores de tratamentos promissores, como a melatonina, nas complicações da gravidez associadas ao aumento do estresse oxidativo e à alteração da função placentária.

Trophoblast primário humano Cultura celular modelo para estudar os efeitos protetores da melatonina contra a hipóxia / Disruption induzida pela reoxigenação

Este protocolo permite que um pesquisador isolar e caracterizar residente em tecido marca de macrófagos em vários tecidos inflamados, extraídos de modelos induzida por dieta de distúrbios metabólicos.

Isolamento, caracterização e purificação dos macrófagos dos tecidos afetados pela inflamação obesidade

Aqui, apresentamos um protocolo altamente acessível para avaliar o movimento de célula em células do trofoblasto humana usando três ensaios in vitro: ensaio de zero, o ensaio de invasão transwell e o ensaio de proliferação celular.

Em Vitro ensaios para avaliar a migração, invasão e proliferação de linhas de células humanas imortalizado primeiro trimestre trofoblasto

Desenvolvemos um modelo de coioamnionite para simular a exposição fetal à inflamação materna (FEMI) sem complicações de organismos vivos para examinar os efeitos do FEMI no desenvolvimento do trato intestinal da prole. Isso permite o estudo de causas mecanicistas para o desenvolvimento de lesões intestinais após a coioamnionite.

Um modelo murino de exposição fetal à inflamação materna para estudar os efeitos da coioamnionite aguda no desenvolvimento intestinal recém-nascido

Apresentado aqui é um protocolo para fornecer oligonucleotídeos como RNA de pequena interferência (siRNA), imitações de micro-RNA (miRs) ou anti-micro-RNA (anti-miR) em adipócitos maduros para modular proteína e expressão micro-RNA.

Um modelo de cultura celular adipócito para estudar o impacto da modulação de proteína e micro-RNA na função adipócito

Aqui está um protocolo para cultivo de explantes placentários em condições de fluxo constante. Essa abordagem aprimora os sistemas tradicionais de cultura de vilosidades estáticas, permitindo a replicação de ambientes fisiológicos dinâmicos.

Ex Vivo Cultura do Fluxo de Explantes Placentários - Mimetizando as Condições Dinâmicas no Útero

Esse protocolo permite a purificação, caracterização e cultivo de trofoblastos extravilosos primários HLA-G+ (EVT) a partir da decídua basal e da membrana coriônica das placentas humanas a termo. Culturas primárias de EVT mantêm a viabilidade por 96 horas, permitindo co-cultura com células imunes maternas comparadas por amostra e subsequente análise citométrica e molecular de fluxo de suas interações.

Purificação de Trofoblastos Extravillosos HLA-G+ de Tecidos Placentários Humanos para Fenotipagem e Análise Funcional

Usando um modelo explantado ex vivo , pequenos pedaços da porção rostral do tecido adiposo branco visceral de camundongos magros são cultivados por 7 a 10 dias, permitindo a indução e o estudo da inflamação do tecido adiposo conforme ocorre durante a alimentação rica em gordura.

Um modelo de camundongo ex vivo para inflamação do tecido adiposo com dieta rica em gordura

Nós descrevemos um modelo de rato do transtorno de estresse pós-traumático (TEPT), que revela as alterações persistentes na função neuroendócrina eo atraso de longo prazo, resposta de medo exagerado, característico de pacientes com TEPT. O modelo animal e os métodos descritos aqui são úteis para correlacionar biomarcadores em núcleos do cérebro, que são mecanicista, mas não pode ser medido em pacientes com biomarcadores em células brancas do sangue periférico, os quais podem.

Biomarcadores em um modelo animal para Revelando correlatos neurais, hematológica e Comportamental do TEPT

Aprenda a isolar trofoblastos humanos primários de tecido viloso placentário para estudar os efeitos da inflamação mediada por TNFα na regulação gênica em obesidade materna.

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Um modelo de trofoblasto humano primário para estudar o efeito da inflamação associada com obesidade materna no Regulamento de autofagia na Placenta

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