Name: O nemátode Caenorhabditis Elegans - um modelo versátil na Vivo para estudar interações do anfitrião-micróbio (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Aprenda a usar Caenorhabditis elegans como modelo in vivo versátil para estudar interações hospedeiro-patógeno, incluindo infecções fúngicas e respostas imunes. Este método rápido e econômico auxilia na descoberta de fármacos.

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Este trabalho foi realizado no e apoiado pelo Instituto Politécnico de Worcester.

1. preparação de nematódeo crescimento médio (NGM) <ol><li>para 1 L de mídia, combinar agar 20g, fonte de nitrogênio orgânico de 2,5 g (por exemplo, bacto peptona) e 3 g de cloreto de sódio em um frasco de 2 L. 975 ml de água estéril.
	<ol><li>Adicionar em uma barra de agitação estéril. Se usando um dosador automático de mídia, tubulação de autoclave e mídia por 15 min; mídia deve ser autoclavada para mais se for feito um maior volume.</li>
	</ol></li> <li>Conjunto de mídia na placa de agitação e deixe arrefecer.
	<ol><li>Uma vez que a mídia está quente ao toque (aproximadamente 60 ° C) em condições de esterilidade, adicione 1 mL de 1m MgSO 4 &#9679; H 2 O, 1 mL de 1 M CaCl 2, 25ml de KPO 4 e 1 mL de colesterol de 0,5% em etanol.</li>
		<li>Despeje mídia (manualmente ou por bomba automática) sob fluxo laminar em 35 x 10 mm pratos de petri estéril. Deixe para secar sob o capô, por 1-2 dias antes do uso. 
		Nota: As placas devem ser armazenadas a 4 ° C para evitar a contaminação.</li>
	</ol></li></ol> 2. Fazendo um Worm Pick <ol><li>corte um pedaço de 1,5 cm de fio de alumínio. Introduza cuidadosamente cerca de 0,5 cm de comprimento na ponta de uma pipeta Pasteur.
	<ol><li>Usando um bico de Bunsen ou lâmpada de álcool, derreter a ponta da pipeta de vidro, lentamente, girando-o na chama até que o fio é firmemente aderido a pipeta, sem comprometer a forma original da ponta da pipeta.</li>
	</ol></li></ol> 3. Preparação da cultura de e. coli <ol><li>utilizando uma ansa estéril, inocular a colônia única da estirpe de Escherichia coli OP50 em 200 mL de caldo de Luria. Incubar durante uma noite com tremor em 37 ° C.</li>
	<li>a cultura do líquido está pronta para o uso no dia seguinte e podem ser armazenada a 4 ° C, quando não estiver em uso. 
	Nota: A cepa de Escherichia coli, OP50, é usada como fonte de alimento para c. elegans. Esta cultura pode ser utilizada para até vários meses, quando armazenado a 4 ° C.</li>
</ol> 4. Essencial manutenção de c. elegans <ol><li>semente preparado placas de ágar NGM com e. coli manchando aproximadamente 50-100 µ l de cultura líquida de OP50 preparada no centro da placa.</li>
	<li>Placas de cobre e deixe-os secar à temperatura ambiente por 24 h. Depois de seco, coloque as placas a 37 ° C durante a noite para crescimento rápido ou manter à temperatura ambiente, se for desejado crescimento mais lento.</li>
	<li>Adicionar minhocas à placa por qualquer &#34; a fragmentação, &#34; (ver protocolo passo 5 &#34; Chunking e pegando vermes &#34;), pegar vermes individualmente ou colocação worm ovos diretamente sobre a placa (ver protocolo passo 6 &#34; ovo preparação &#34;).</li>
</ol> 5. CHUNKING e pegando vermes Nota: &#34; Chunking, &#34; refere-se a uma prática que é comum em manutenção de c. elegans. Isto envolve cortar uma secção da placa de ágar de NGM que contém vermes e transferir esta peça em um prato novo, assim também transferência de grande quantidade de vermes no processo. Contaminação também pode ser cortada da placa dessa maneira. Ao escolher os vermes, é importante manter a integridade do ágar, pois vermes podem ser perdidos em buracos de agar. Além disso, é importante para permitir que o escolhido para esfriar antes de tocar no prato para evitar derretimento o ágar ou queimando os vermes.
<ol><li>Para transferir rapidamente grandes quantidades de vermes nas novas chapas, corte um pedaço de ágar NGM contendo os sem-fins selecionados usando uma espátula. Retire o pedaço e coloque a cara no chão à beira do gramado de OP50 num prato novo.</li>
	<li>Transferência individualmente conforme descrito abaixo, na etapa de protocolo 8.2, vermes &#34; ensaio de sobrevivência, &#34; usando um verme escolher. Chama o fio no worm escolher até o vermelho. Removê-lo da chama e deixe-a esfriar por alguns segundos.</li>
	<li>Usando o fio sobre a palheta, lixe ligeiramente o gramado da cultura OP50 crescido na placa nova, cobrindo o fio sobre o pick.</li>
	<li>a cultura viscosa cobrindo a ponta do fio faz vermes furar a ponta da palheta, assim suavemente pegar vermes selecionados usando um movimento percorrendo.</li>
	<li>Uma vez selecionados vermes reunidos, colocá-los em um prato novo swiping suavemente a cultura através de agar. Coloque o fio na chama para remover o restante cultura sobre o pick.</li>
</ol> 6. Preparação de ovos <ol><li>Coloque aproximadamente 20 animais adultos (aproximadamente 2-3 dias após a eclosão, quando cultivada a 20 ° C) por escolher ou fragmentação conforme descrito na etapa de protocolo 5, &#34; Chunking e escolhendo Worms, &#34; em um prato, inoculado com 50 µ L da estirpe de Escherichia coli, OP50.</li>
	<li>Para recolher os ovos, inundar a placa com 10 mL de tampão de M9 após 1-2 dias. Usando uma pipeta sorológica de vidro, agite e agite suavemente o conteúdo na placa de ágar para liberar ovos presos OP50 ou animais adultos. Recolher todo o líquido contendo os ovos e adultos.</li>
	<li>Transferência M9 e OP50 solução em um 15ml cónico tubo. Centrifugar o tubo cônico de 15 mL a 2.100 x g por 2 min.</li>
	<li>Aspire aproximadamente 9 mL do sobrenadante sem perturbar o sedimento OP50.</li>
	<li>Resuspenda o pellet em 2 mL de água estéril, 1 mL de água sanitária e 1 mL de NaOH 0,25 de M.</li>
	<li>Misture suavemente por inversão, até que a maioria (aproximadamente 70 por cento) dos animais adultos aparece lisada; normalmente, ovos permanecem intactos durante este tratamento de lixívia curto por causa de seu escudo. Centrifugar o tubo cônico a 990 x g por 2 min.</li>
	<li>Aspirado sobrenadante sem perturbar o sedimento. Ressuspender o pellet em 10 mL de tampão de M9.</li>
	<li>Centrifugar o tubo cônico em 990 x g por 2 min. aspirado sobrenadante sem perturbador da pelota. Ressuspender o sedimento com 200 µ l de tampão de M9. 
	Nota: A preparação do ovo pode exigir vários ensaios. Os ovos podem ser destruídos se eles são expostos para branquear por muito tempo. Se os ovos não eclodem, diminuir a concentração de água sanitária em solução ou diminuir a duração da exposição para branquear.</li>
</ol> 7. Configuração de placa de infecção <ol><li>dispensar 3-5 mL de YPD num tubo de ensaio estéril e inoculá-lo com uma única colônia de Candida albicans utilizando uma ansa estéril.
	<ol><li>Colocar o tubo sobre um tambor rotatórios para aproximadamente 16-18 h em 30 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Rótulo um 1,5 mL microcentrífuga tubo para conter a c. albicans e outra para conter OP50. Registrar o peso de cada tubo vazio.
	<ol><li>Lugar 500 µ l de noite cultura de c. albicans em tubo rotulado de c. albicans e 1.500 µ l da cultura OP50 durante a noite (a partir de passo 3.1) no tubo rotulado OP50.</li>
		<li>Centrifugar durante 10 minutos a 16.100 x sobrenadante de g. aspirado sem sedimento perturbador.</li>
		<li>Re-suspender cada pellet com 500 µ l de água estéril. Centrifugar durante 5 min à 16.100 g. x</li>
		<li>Aspirado sobrenadante sem perturbar o sedimento. Gravar o peso final dos tubos de microcentrífuga.</li>
		<li>Determinar o peso de cada pellet subtraindo o peso inicial dos tubos de microcentrífuga do peso final.</li>
	</ol></li> <li>Usando água estéril, Ressuspender o sedimento de c. albicans a 10 mg/mL e a pelota OP50 a 200 mg/mL. Fazer uma infecção mestre mix pela combinação de 7 µ l de água estéril, 2,5 µ l de OP50 cultura, 0,5 µ l de cultura de c. albicans e 10 µ l de uma solução de 50 mg/mL de estreptomicina.
	<ol><li>Para placas de controle, criar uma mistura de mestre, substituindo o volume da cultura de c. albicans com água estéril. Sementes de 20 µ l de mistura de infecção ou solução de controle OP50 nas chapas de centro de NGM usando uma micropipeta. 
		Nota: Aproximadamente 100 minhocas são necessários para determinar a significância estatística durante a análise. Este ensaio é executado normalmente em triplicado. Assim, feita uma 3.2 x mistura de infecção, bem como um 3.2 x solução de controle. Estas misturas são feitas para serem ligeiramente mais de 3 x o original para garantir que um total de 20 µ l é semeada em cada prato, permitindo espaço para erros. Esta mistura de mestre é criada porque a faringe do worm é muito pequena, durante os estágios larvais iniciais (L1-L3) para consumir c. albicans. Para exposição a agentes farmacológicos tais como fluconazol ( Figura 3B), o agente é introduzido à mistura de infecção. A concentração do agente é determinada empiricamente. Por exemplo, na Figura 3B, 50 µM Fluconazole é representada, no entanto 0, 12.5, 25, 50 e 100 µM fluconazol também foram testados usando o mesmo protocolo.</li>
	</ol></li></ol> 8. Análise do fenótipo deformado região Anal (Dar) e sobrevivência do ensaio <ol><li>Visualize o fenótipo de Dar Nota: Dar é melhor visualizado na fase L3 e além. Dar apresenta-se como uma pequena saliência na região anal post do worm ( Figura 2A), que se torna mais proeminente ao longo do tempo.
	<ol><li>Confirmar se um animal tem Dar tocando rapidamente a placa no palco do microscópio dissecação; animais sem Dar vontade de mover para trás imediatamente, enquanto animais com Dar serão necessário repetidas rodadas de escutas para reverter sua direção, ou eles Não vai fazê-lo em tudo.</li>
	</ol></li> <li>Ensaio de sobrevivência <ol><li>preparação de ovo completo conforme descrita anteriormente na etapa de protocolo 6, &#34; ovo preparação &#34;. Conte com o ovo no âmbito de dissecação e diluir a solução de ovo com M9 até que seja alcançada uma concentração de aproximadamente 5-6 ovos saudáveis por µ l. Utilizando uma pipeta, dispensar 20 µ l da amostra contendo aproximadamente 30 ovos na chapa de NGM preparado, na área entre a cultura bacteriana e do lado da placa (ovos e comida de verme, OP50, estão em dois pontos distintos).</li>
		Incubar as placas a 20 ° C, durante 48 h de <li>. Sob um microscópio de dissecação, conte o número de vermes vivos e mortos adultos em cada prato, bem como o número de minhocas com a Dar. Gravar a porcentagem com Dar.</li>
		<li>Considerar um animal morto, se ele não responder a ser batido na cabeça por um fio de alumínio ou toque na placa.</li>
		<li>Todos os dias, transferir germes adultos restantes por colheita conforme descrito na etapa de protocolo 5, &#34; Chunking e escolhendo Worms, &#34; em um prato novo de infecção ou controle. Neste ponto, se necessário, realizar um ensaio de sobrevivência do número de vermes vivos, mortos e desaparecidos de rastreamento de cada dia. 
		Nota: Este ensaio poderá ser executada por duas semanas, começando com a preparação do ovo. Além disso, a solução de ovo não deve ser dispensada para a cultura bacteriana, como a solução pode conter vestígios de água sanitária que pode matar o OP50. A solução também deve ser dispensado de aproximadamente 0,5 cm da borda da placa, como ovos podem ficar preso entre os lados da placa e o ágar-ágar. Além disso, devido à rápida proliferação de vermes, transferência de adultos nas novas chapas é fundamental para separá-los dos seus descendentes.</li>
	</ol></li> <li>Sobrevivência analisar <ol><li>analisar resultados usando software de análise de curva de sobrevivência (consulte a lista de materiais).</li>
		<li>Compare sobrevivência curvas usando o método Grehan-Breslow-Wilcoxon (supondo que os dados dos primeiros tempos de sobrevivência são mais precisos do que tempos mais tarde, peso adequadamente os dados) bem como de ferramentas estatísticas de Logrank 45. 
		Nota: Por exemplo, na Figura 4B -C, a sobrevivência das minhocas tratados com mutante c. albicans é comparada com aqueles tratados com controles de tipo selvagem isogénicas ou complementarystrains.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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Os autores não têm nada para divulgar.

Os métodos para análise do c. elegans infecção e sobrevivência sobre exposição de vida a c. albicans que descrevemos podem ser modificados para testar outro patógeno. Culturas líquidas de outra bactéria ou fungo podem ser feitas e alimentadas a c. elegans de forma semelhante. Além disso, infecções seriais podem ser analisadas primeiro, expondo a larva de um patógeno conforme descrito, e depois transferir os animais para uma nova placa contendo um patógeno separado depois de atingir a idade adul...

C. elegans tem sido usado como um organismo modelo poderoso para mais de 50 anos. Na década de 1960, o biólogo Sul-Africano Sydney Brenner foi pioneira no uso de c. elegans , para estudar o desenvolvimento neuronal, pavimentando o caminho para uma longa linhagem de cientistas para estudar os vários aspectos da biologia celular e animal em nematoides. Esta linhagem inclui Prêmio Nobel laureates Craig Mello e Andrew Fire para o seu trabalho de RNAi1, Robert Horvitz e John Sulston por seu trabalho no desenvolvimento de órgãos e apoptose2,3,4e Martin Chalfie por seu trabalho na proteína fluorescente verde5. Embora este organismo modelo tem sido tradicionalmente usado para estudar a biologia molecular e do desenvolvimento, nos últimos 15 anos, os pesquisadores começaram a usar c. elegans para investigar a biologia de vários patógenos humanos incluindo Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Staphylococcus aureuse Salmonella typhi6,7,8,9,10. Estes estudos revelaram que muitos dos mecanismos envolvidos na interação humano-patógeno são conservados em nematódeos, mas também que existem alguns mecanismos de imunidade que são exclusivos para este organismo de modelo11,12. Na natureza, c. elegans encontra uma variedade de ameaças de patógenos ingeridos presentes no solo e isso proporcionou uma forte pressão seletiva para evoluir e manter um sofisticado sistema imune inato no seu lúmen intestinal. Muitos dos genes e mecanismos envolvidos na proteção do lúmen intestinal são orquestrados por elementos altamente conservada que também existem em maior mamíferos11,13. C. elegans , portanto, representa um grande modelo para estudar a patógenos gastrointestinais como a Salmonella typhi14, Shigella boydii15ou Vibrio cholera16.
Aqui destacamos a versatilidade notável de c. elegans como um host de modelo para o estudo de agentes infecciosos, tais como c. albicans. C. elegans como um anfitrião modelo permite o rastreio de alto rendimento de virulência que é menos caro e demorado do que um modelo do rato, que é comumente usado para estudar a candidíase42.
Neste estudo, mostramos que este modelo e o ensaio de sobrevivência de assosiated podem ser confiável usados para estudar inata efetores hospedeiro imune importantes para combater infecções, determinantes do patógeno que impulsionam a virulência, e compostos farmacológicos que podem intervir na patogênese. Diferentes tipos de ensaios descritos anteriormente, este método fornece um meio de exposição a um agente patogénico a estudar sobre a vida do animal, desde a fase larval para a idade adulta, ao invés de apenas idade adulta a morte de43,44. Em resumo, nosso c. elegans - modelo de c. albicans é uma ferramenta versátil e poderosa que pode ser usada não somente para estudar as bases genéticas que levam a infecção e imunidade, mas também para identificar novos compostos para a intervenção terapêutica.

<table><tbody><tr><td>Ágar (granulado, grau bacterilógico)</td> <td>Produtos Apex BioResearch</td><td>20-248</td><td></td></tr><tr><td>Fio de Alumínio (95% Pt, 32 Gauge)</td> <td>Genesee Scientific</td><td>59-1M32P</td><td></td></tr><tr><td>Axiovision Zeiss Microscópio Invertido</td><td>Axiovision Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Peptona</td><td>Fisher BioReagants</td><td>BP1420-500</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans cepa Bli-3</td><td>Caenorhabditis Centro de Genética</td><td>Bli-3 (e767) CB767</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Cálcio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP51-250</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol, Grau Sigma, mínimo 99%</td> Tubos de Cultura Descartáveis <td>Sigma</td><td>C8667-25G</td><td></td></tr><tr><td>(20 x 150 mm)</td> Microscópio de Dissecção <td>FIsherBrand</td><td>14-961-33</td><td></td></tr><tr><td>(Iluminador de Alta Intensidade NI-150)</td> <td>Nikon Instrument Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism (Software de Análise de Curva de Sobrevivência)</td><td>Software</td><td></td><td></td>GraphPad</tr><tr><td>LB Broth (Miller's)</td><td>Produtos Apex BioResearch</td><td>11-120</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de Magnésio</td><td>Fisher Scientific</td><td>10034-99-8</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri Médias (35 X 10 mm)</td><td>Falcon</td><td></td><td></td>353001</tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico</td><td>Sigma</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Wildtype C. albicans SC5314</td><td>ATCC</td><td>SC5314</td><td></td></tr><tr><td>Wildtype C. elegans</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>N2</td><td></td></tr></tbody></table>

o nemátode caenorhabditis elegans - um modelo versátil na vivo para estudar interações do anfitrião-micróbio

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Vamos demonstrar um método usando Caenorhabditis elegans como um anfitrião modelo para estudar a interação microbiana. Micróbios são introduzidos através da dieta, tornando o intestino o local principal para a doença. O nematoide intestino estrutural e funcionalmente imita os intestinos de mamíferos e é transparente, tornando-se passível de estudo microscópico da colonização. Aqui nós mostramos que patógenos podem causar doenças e morte. Somos capazes de identificar microbianos mutantes que mostram a virulência alterada. Sua resposta inata conservada a estresses bióticos faz c. elegans , um excelente sistema para sondar as facetas de interações imune inata do hospedeiro. Mostramos que hosts com mutações no gene oxidase dual não podem produzir espécies reactivas de oxigénio e são incapazes de resistir insulto microbiano. Vamos demonstrar ainda mais a versatilidade do ensaio apresentado sobrevivência, mostrando que ele pode ser usado para estudar os efeitos de inibidores do crescimento microbiano. Este ensaio também pode ser usado para descobrir os fatores de virulência de fungos como alvos para o desenvolvimento de novos agentes antifúngicos, bem como fornecer uma oportunidade para descobrir novas interações do anfitrião-micróbio. O design deste teste se presta bem para alta taxa de transferência do inteiro-genoma telas, enquanto a capacidade de vermes de crio-preservação para uso futuro torna um modelo todo animal rentável e atraente para estudar.

Um ensaio de patogênese (Figura 1) usando a c. albicans e c. elegans tem sido descrito anteriormente por nosso laboratório17,18 e outros laboratórios19,20. Demonstramos a acessibilidade de usando o c. elegans para estudar a virulência de c. albicans , mostrando que as células de c. albicans são inge...

Aqui, apresentamos o nemátodo Caenorhabditis elegans como modelo de acolhimento versátil para estudar a interação microbiana.

O nemátode Caenorhabditis Elegans - um modelo versátil na Vivo para estudar interações do anfitrião-micróbio

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

O objetivo geral deste ensaio é observar o efeito da infecção fúngica no organismo modelo C. Elegans. Este método pode ajudar a responder a questões mecanicistas importantes no campo de doenças infecciosas, como fatores de virulência de patógenos, efetores imunológicos do hospedeiro, bem como descoberta de medicamentos. A principal vantagem dessa técnica é que ela é um sistema experimentalmente tratável para estudar as interações patógeno-hospedeiro de ambos os pontos de vista.É um sistema rápido, fácil e econômico. Embora esse método específico possa fornecer informações sobre patógenos fúngicos, ele também pode ser aplicado a outros agentes infecciosos, como bactérias ou mesmo vários organismos para estudar interações microbianas em um hospedeiro vivo. Para fazer uma picareta de minhoca, corte um pedaço de fio de alumínio de 1,5 centímetro e insira cuidadosamente aproximadamente 0,5 centímetros do fio na ponta de uma pipeta pasteur.Usando um bico de Bunsen ou álcool lamp, derreta a ponta da pipeta de vidro girando-a lentamente na chama até que o fio esteja firmemente aderido à pipeta sem comprometer a forma original da ponta da pipeta. Finalmente, usando uma pinça, dobre cuidadosamente a extremidade do fio para criar um pequeno laço. Para transferir rapidamente grandes quantidades de minhocas para novas placas, use uma espátula para cortar um pedaço de ágar NGM contendo as minhocas selecionadas.Em seguida, remova a peça cortada e coloque-a virada para baixo na borda do remendo de OP50 em uma nova placa. Para transferir vermes individualmente, acenda o fio no picareta de minhoca até que fique vermelho, remova-o da chama e deixe esfriar por alguns segundos. Usando o fio no pick, raspe suavemente o patch da cultura OP50 cultivada na nova placa, cobrindo o fio no pick.A cultura viscosa que cobre a ponta do fio faz com que os vermes grudem na ponta do caroço. Portanto, use um movimento de deslizar para pegar suavemente os vermes selecionados. Depois que as minhocas selecionadas forem coletadas, coloque-as em um novo prato, passando suavemente a cultura pelo ágar.Em seguida, coloque o fio na chama para remover a cultura restante na palheta. Coloque aproximadamente 20 animais adultos pegando-os ou cortando-os em pedaços em um prato com 50 microlitros de E.coli cepa OP50. Para coletar os ovos após um a dois dias, inunde a placa com 10 mililitros de tampão M9.Em seguida, usando uma pipeta sorológica de vidro, agite e agite suavemente o conteúdo na placa de ágar para liberar animais adultos ou ovos presos ao OP50. Colete todo o líquido que contém os ovos e adultos. Transferir a solução M9 e OP50 para um tubo cónico de 15 ml.Centrifugar o tubo a 2,100 x g durante dois minutos. Em seguida, aspirar cerca de nove mililitros de sobrenadante sem perturbar o sedimento. Em seguida, use dois mililitros de água estéril, um mililitro de água sanitária e um mililitro de hidróxido de sódio 0,25 molar para ressuspender o pellet.Misture suavemente por inversão até que aproximadamente 70% dos animais adultos pareçam lisados. Normalmente, os ovos permanecem intactos durante este curto tratamento de alvejante por causa de sua casca. É fundamental que a quantidade de exposição ao alvejante seja limitada nesta etapa.A exposição prolongada ao alvejante destruirá os ovos. Se a preparação do ovo falhar, limite a duração da exposição ao alvejante ou dilua a solução. Centrifugar o tubo cónico a 990 x g durante dois minutos.Aspirar o sobrenadante sem perturbar o sedimento. Em seguida, ressuspenda o pellet em 10 mililitros de tampão M9. Depois de girar novamente e remover o sobrenadante sem perturbar o pellet, use 200 microlitros de tampão M9 para ressuspender o pellet.Dispense de três a cinco mililitros de YPD em um tubo de ensaio estéril e use uma alça estéril para inoculá-lo com uma única colônia de Candida albicans. Coloque o tubo em um tambor rotativo a 30 graus Celsius por aproximadamente 16 a 18 horas. Rotule um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro para conter C. albicans e outro para conter OP50 e, em seguida, registre o peso de cada tubo vazio.Transfira 500 microlitros da cultura noturna de C.albicans para o tubo rotulado como C.Albicans. E 1500 microlitros da cultura OP50 durante a noite no tubo rotulado OP50. Centrifugar os tubos durante 10 minutos a 16, 100 x g, aspirar o sobrenadante sem perturbar os grânulos.Use 500 microlitros de água estéril para ressuspender cada pellet. Em seguida, centrifugue os tubos a 16, 100 x g por cinco minutos. Aspirar o sobrenadante sem perturbar os grânulos.Em seguida, registre o peso final dos tubos de microcentrífugas. Determine o peso de cada pellet subtraindo o peso inicial dos tubos de microcentrífuga do peso final. Usando água estéril, ressuspenda o pellet de C.albicans a 10 miligramas por mililitro e o pellet OP50 a 20 miligramas por mililitro.Em seguida, faça uma mistura mestre de infecção combinando 10 microlitros de uma solução de 50 miligramas por mililitro de estreptomicina. 2,5 microlitros de cultura OP50. 0,5 microlitros de cultura C.Albicans e 7 microlitros de água estéril.Para placas de controle, crie uma mistura principal substituindo o volume da cultura de C.albicans por água estéril. Em seguida, use uma micropipeta para semear 20 microlitros de mistura de infecção ou solução de controle OP50 no centro das placas NGM. Depois de preparar os ovos, conforme demonstrado anteriormente neste vídeo, conte os ovos no escopo de dissecação.E use M9 para diluir a solução de ovo até que uma concentração de aproximadamente cinco a seis ovos saudáveis por microlitro seja alcançada. Usando uma pipeta, dispense uma amostra de 20 microlitros contendo aproximadamente 30 ovos em uma placa NGM preparada na área entre a cultura bacteriana e a lateral da placa. Incube as placas a 20 graus Celsius por 48 horas.Em seguida, sob um microscópio de dissecação, conte o número de vermes adultos vivos e mortos em cada placa. Considerando o animal morto se ele não responder ao ser batido na cabeça por um fio de alumínio ou bater na placa. Conte também o número de vermes com Dar e confirme se um animal tem Dar batendo rapidamente na placa no estágio do microscópio de dissecação.Animais sem Dar se moverão para trás imediatamente, enquanto animais com Dar precisarão de repetidas rodadas de batidas para inverter sua direção ou não o farão de forma alguma. A cada dois dias, transfira quaisquer vermes adultos restantes, colhendo vermes em uma nova placa de infecção ou controle. Neste ponto, se necessário, realize um ensaio de sobrevivência rastreando o número de vermes vivos, mortos e desaparecidos a cada dia.É importante transferir os vermes em dias alternados, no mínimo. Isso garante que os vermes adultos que estão sendo pontuados neste ensaio não sejam confundidos com sua progênie. C. elegans foram expostos a C. albicans durante um período de seis dias e observados quanto a sinais de infecção, progressão da doença e morte.O fenótipo Dar é mais visível no quarto dia do ensaio de sobrevivência, conforme observado por uma região anal saliente que não é visível no animal não infectado. Vermes infectados por C. albicans também são conhecidos por exibir inchaço na região da vulva. Em ambos os casos, o worm é incapaz de eliminar a infecção após atingir esse estágio.A fim de visualizar a colonização de C.Albicans no lúmen intestinal, vermes foram alimentados com C.albicans selvagens marcados com RFP que causam áreas de colonização fluorescentes em vermelho. C.albicans colonizam o lúmen intestinal no terceiro dia do ensaio. Como mostrado aqui, os vermes infectados apresentaram distensão intestinal mais grave do que a observada no controle não infectado.Neste experimento, foi testada a capacidade dos vermes de sobreviver à infecção causada pelo duplo mutante virulento C.Albicans efg1/efg1 cph1/cph1. Os vermes infectados com o mutante duplo vivem estatisticamente significativamente mais do que os controles. Sugerindo que esses dois genes são necessários para a virulência de C. albicans contra C. Elegans.Uma vez dominada, cada parte dessa técnica pode ser feita em uma a duas horas por dia durante a vida útil do verme. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que se pode estar usando agentes infecciosos. Portanto, precauções de biossegurança apropriadas devem ser praticadas.Pequenas modificações podem ser feitas neste procedimento básico, como a introdução de agentes microbianos adicionais para estudar as interações microbianas no contexto de um hospedeiro vivo. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo de doenças infecciosas explorarem a virulência microbiana, os mecanismos das respostas imunes inatas do hospedeiro, bem como a descoberta de novos agentes antimicrobianos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como manter e manipular C.Elegans e usar o organismo para estudar as interações entre micróbios hospedeiros em nível molecular.Não se esqueça de que trabalhar com patógenos microbianos e reagentes químicos, como azida de sódio, pode ser perigoso e precauções de segurança apropriadas, como EPI e métodos de descarte de resíduos, devem ser empregadas.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

A facilidade de manutenção e propagação do...

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos: Sincronização e observação

Os nematoides de Caenorhabditis selvagens estão associados a muitos micróbios, muitas vezes no lúmen intestinal ou infectando o intestino. Este protocolo detalha um método para enriquecer micróbios não culturais colonizando o intestino, aproveitando a resistência da cutícula dauer.

Limpeza Seletiva de Nematodes de Caenorhabdite Selvagem para Enriquecer para Bactérias do Microbioma Intestinal

A infecção da Caenorhabditis elegans pelo parasita microsporidiano Nematocida parisii permite que os vermes produzam descendentes altamente resistentes ao mesmo patógeno. Este é um exemplo de imunidade herdada, um fenômeno epigenético mal compreendido. O presente protocolo descreve o estudo da imunidade herdada em um modelo de verme geneticamente tratável.

Estudando imunidade herdada em um modelo de infecção por microsporidia

Micróbios intestinais, incluindo bactérias extracelulares e patógenos intracelulares como o vírus Orsay e microsporídios (fungos), são frequentemente associados a nematoides selvagens de Caenorhabditis . Este artigo apresenta um protocolo para detecção e quantificação de micróbios que colonizam e/ou infectam nematoides de C. elegans e para medir a carga de patógenos após infecções controladas em laboratório.

Hibridização in situ por fluorescência de RNA (FISH) para visualizar colonização microbiana e infecção em intestinos de Caenorhabditis elegans

Este protocolo descreve uma interrupção de 96 poços de caenorhabditis colonizada individualmente elegans após paralisia fria e branqueamento superficial para remover bactérias externas. A suspensão resultante é emplacada em placas de ágar para permitir quantificação precisa e média de carga bacteriana em um grande número de vermes individuais.

Usando dados de verme único para quantificar a heterogeneidade em Interações elegans-bacterianas de Caenorhabditis

Caenorhabditis elegans é uma das principais espécies modelo em biologia, mas quase todas as pesquisas são realizadas na ausência de seus micróbios naturalmente associados. Os métodos descritos aqui ajudarão a melhorar nossa compreensão da diversidade de micróbios associados como base para futuras pesquisas funcionais de C. elegans.

Isolamento e Caracterização da Microbiota Natural do Nematoide Modelo Caenorhabditis elegans

Os microcosmos de composto trazem a diversidade microbiana encontrada na natureza para o laboratório para facilitar a pesquisa do microbioma em Caenorhabditis elegans. Aqui são fornecidos protocolos para a criação de experimentos de microcosmos, com os experimentos demonstrando a capacidade de modular a diversidade microbiana ambiental para explorar as relações entre a diversidade microbiana ambiental e a composição do microbioma intestinal do verme.

Microcosmos de composto como ambientes microbianamente diversos e naturais para pesquisa de microbioma em Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans é um modelo poderoso para examinar os determinantes moleculares que conduzem as interações hospedeiro-microbioma. Apresentamos um pipeline de alto rendimento traçando o perfil dos níveis de colonização do microbioma intestinal em um único animal, juntamente com os principais aspectos da fisiologia de C. elegans.

Aplicação da Vermimetria de Fluxo na Quantificação e Análise do Microbioma Intestinal de Caenorhabditis elegans

Aqui, fornecemos instruções sobre como utilizar efetivamente o SegElegans, um sistema de aprendizado profundo que desenvolvemos para a segmentação automatizada de worms individuais em imagens de microscopia de campo amplo, para uso subsequente em software de análise de imagens, como o ImageJ. Fornecemos maneiras de usar o sistema online e offline.

Análise automatizada de imagens de fluorescência de C. elegans usando SegElegans

Descrevemos uma estratégia de substituição de genes robusta para manipular geneticamente o fungo Ustilago maydis smut. Este protocolo explica como gerar mutantes de deleção para investigar fenótipos de infecção. Ele pode ser estendido para modificar os genes de qualquer forma desejada, por exemplo, através da adição de uma sequência que codifica uma etiqueta de proteína fluorescente.

Manipulação genética do patógeno de planta<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Estudar Biologia fúngicos e vegetais Microbe Interactions

Aprenda a usar Caenorhabditis elegans como modelo in vivo versátil para estudar interações hospedeiro-patógeno, incluindo infecções fúngicas e respostas imunes. Este método rápido e econômico auxilia na descoberta de fármacos.

O nemátode Caenorhabditis Elegans - um modelo versátil na Vivo para estudar interações do anfitrião-micróbio

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