O nemátode Caenorhabditis Elegans - um modelo versátil na Vivo para estudar interações do anfitrião-micróbio
18 de outubro de 2017
Aqui, apresentamos o nemátodo Caenorhabditis elegans como modelo de acolhimento versátil para estudar a interação microbiana.
O objetivo geral deste ensaio é observar o efeito da infecção fúngica no organismo modelo C. Elegans. Este método pode ajudar a responder a questões mecanicistas importantes no campo de doenças infecciosas, como fatores de virulência de patógenos, efetores imunológicos do hospedeiro, bem como descoberta de medicamentos. A principal vantagem dessa técnica é que ela é um sistema experimentalmente tratável para estudar as interações patógeno-hospedeiro de ambos os pontos de vista.
É um sistema rápido, fácil e econômico. Embora esse método específico possa fornecer informações sobre patógenos fúngicos, ele também pode ser aplicado a outros agentes infecciosos, como bactérias ou mesmo vários organismos para estudar interações microbianas em um hospedeiro vivo. Para fazer uma picareta de minhoca, corte um pedaço de fio de alumínio de 1,5 centímetro e insira cuidadosamente aproximadamente 0,5 centímetros do fio na ponta de uma pipeta pasteur.
Usando um bico de Bunsen ou álcool lamp, derreta a ponta da pipeta de vidro girando-a lentamente na chama até que o fio esteja firmemente aderido à pipeta sem comprometer a forma original da ponta da pipeta. Finalmente, usando uma pinça, dobre cuidadosamente a extremidade do fio para criar um pequeno laço. Para transferir rapidamente grandes quantidades de minhocas para novas placas, use uma espátula para cortar um pedaço de ágar NGM contendo as minhocas selecionadas.
Em seguida, remova a peça cortada e coloque-a virada para baixo na borda do remendo de OP50 em uma nova placa. Para transferir vermes individualmente, acenda o fio no picareta de minhoca até que fique vermelho, remova-o da chama e deixe esfriar por alguns segundos. Usando o fio no pick, raspe suavemente o patch da cultura OP50 cultivada na nova placa, cobrindo o fio no pick.
A cultura viscosa que cobre a ponta do fio faz com que os vermes grudem na ponta do caroço. Portanto, use um movimento de deslizar para pegar suavemente os vermes selecionados. Depois que as minhocas selecionadas forem coletadas, coloque-as em um novo prato, passando suavemente a cultura pelo ágar.
Em seguida, coloque o fio na chama para remover a cultura restante na palheta. Coloque aproximadamente 20 animais adultos pegando-os ou cortando-os em pedaços em um prato com 50 microlitros de E.coli cepa OP50. Para coletar os ovos após um a dois dias, inunde a placa com 10 mililitros de tampão M9.
Em seguida, usando uma pipeta sorológica de vidro, agite e agite suavemente o conteúdo na placa de ágar para liberar animais adultos ou ovos presos ao OP50. Colete todo o líquido que contém os ovos e adultos. Transferir a solução M9 e OP50 para um tubo cónico de 15 ml.
Centrifugar o tubo a 2,100 x g durante dois minutos. Em seguida, aspirar cerca de nove mililitros de sobrenadante sem perturbar o sedimento. Em seguida, use dois mililitros de água estéril, um mililitro de água sanitária e um mililitro de hidróxido de sódio 0,25 molar para ressuspender o pellet.
Misture suavemente por inversão até que aproximadamente 70% dos animais adultos pareçam lisados. Normalmente, os ovos permanecem intactos durante este curto tratamento de alvejante por causa de sua casca. É fundamental que a quantidade de exposição ao alvejante seja limitada nesta etapa.
A exposição prolongada ao alvejante destruirá os ovos. Se a preparação do ovo falhar, limite a duração da exposição ao alvejante ou dilua a solução. Centrifugar o tubo cónico a 990 x g durante dois minutos.
Aspirar o sobrenadante sem perturbar o sedimento. Em seguida, ressuspenda o pellet em 10 mililitros de tampão M9. Depois de girar novamente e remover o sobrenadante sem perturbar o pellet, use 200 microlitros de tampão M9 para ressuspender o pellet.
Dispense de três a cinco mililitros de YPD em um tubo de ensaio estéril e use uma alça estéril para inoculá-lo com uma única colônia de Candida albicans. Coloque o tubo em um tambor rotativo a 30 graus Celsius por aproximadamente 16 a 18 horas. Rotule um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro para conter C. albicans e outro para conter OP50 e, em seguida, registre o peso de cada tubo vazio.
Transfira 500 microlitros da cultura noturna de C.albicans para o tubo rotulado como C.Albicans. E 1500 microlitros da cultura OP50 durante a noite no tubo rotulado OP50. Centrifugar os tubos durante 10 minutos a 16, 100 x g, aspirar o sobrenadante sem perturbar os grânulos.
Use 500 microlitros de água estéril para ressuspender cada pellet. Em seguida, centrifugue os tubos a 16, 100 x g por cinco minutos. Aspirar o sobrenadante sem perturbar os grânulos.
Em seguida, registre o peso final dos tubos de microcentrífugas. Determine o peso de cada pellet subtraindo o peso inicial dos tubos de microcentrífuga do peso final. Usando água estéril, ressuspenda o pellet de C.albicans a 10 miligramas por mililitro e o pellet OP50 a 20 miligramas por mililitro.
Em seguida, faça uma mistura mestre de infecção combinando 10 microlitros de uma solução de 50 miligramas por mililitro de estreptomicina. 2,5 microlitros de cultura OP50. 0,5 microlitros de cultura C.Albicans e 7 microlitros de água estéril.
Para placas de controle, crie uma mistura principal substituindo o volume da cultura de C.albicans por água estéril. Em seguida, use uma micropipeta para semear 20 microlitros de mistura de infecção ou solução de controle OP50 no centro das placas NGM. Depois de preparar os ovos, conforme demonstrado anteriormente neste vídeo, conte os ovos no escopo de dissecação.
E use M9 para diluir a solução de ovo até que uma concentração de aproximadamente cinco a seis ovos saudáveis por microlitro seja alcançada. Usando uma pipeta, dispense uma amostra de 20 microlitros contendo aproximadamente 30 ovos em uma placa NGM preparada na área entre a cultura bacteriana e a lateral da placa. Incube as placas a 20 graus Celsius por 48 horas.
Em seguida, sob um microscópio de dissecação, conte o número de vermes adultos vivos e mortos em cada placa. Considerando o animal morto se ele não responder ao ser batido na cabeça por um fio de alumínio ou bater na placa. Conte também o número de vermes com Dar e confirme se um animal tem Dar batendo rapidamente na placa no estágio do microscópio de dissecação.
Animais sem Dar se moverão para trás imediatamente, enquanto animais com Dar precisarão de repetidas rodadas de batidas para inverter sua direção ou não o farão de forma alguma. A cada dois dias, transfira quaisquer vermes adultos restantes, colhendo vermes em uma nova placa de infecção ou controle. Neste ponto, se necessário, realize um ensaio de sobrevivência rastreando o número de vermes vivos, mortos e desaparecidos a cada dia.
É importante transferir os vermes em dias alternados, no mínimo. Isso garante que os vermes adultos que estão sendo pontuados neste ensaio não sejam confundidos com sua progênie. C. elegans foram expostos a C. albicans durante um período de seis dias e observados quanto a sinais de infecção, progressão da doença e morte.
O fenótipo Dar é mais visível no quarto dia do ensaio de sobrevivência, conforme observado por uma região anal saliente que não é visível no animal não infectado. Vermes infectados por C. albicans também são conhecidos por exibir inchaço na região da vulva. Em ambos os casos, o worm é incapaz de eliminar a infecção após atingir esse estágio.
A fim de visualizar a colonização de C.Albicans no lúmen intestinal, vermes foram alimentados com C.albicans selvagens marcados com RFP que causam áreas de colonização fluorescentes em vermelho. C.albicans colonizam o lúmen intestinal no terceiro dia do ensaio. Como mostrado aqui, os vermes infectados apresentaram distensão intestinal mais grave do que a observada no controle não infectado.
Neste experimento, foi testada a capacidade dos vermes de sobreviver à infecção causada pelo duplo mutante virulento C.Albicans efg1/efg1 cph1/cph1. Os vermes infectados com o mutante duplo vivem estatisticamente significativamente mais do que os controles. Sugerindo que esses dois genes são necessários para a virulência de C. albicans contra C. Elegans.
Uma vez dominada, cada parte dessa técnica pode ser feita em uma a duas horas por dia durante a vida útil do verme. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que se pode estar usando agentes infecciosos. Portanto, precauções de biossegurança apropriadas devem ser praticadas.
Pequenas modificações podem ser feitas neste procedimento básico, como a introdução de agentes microbianos adicionais para estudar as interações microbianas no contexto de um hospedeiro vivo. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo de doenças infecciosas explorarem a virulência microbiana, os mecanismos das respostas imunes inatas do hospedeiro, bem como a descoberta de novos agentes antimicrobianos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como manter e manipular C.Elegans e usar o organismo para estudar as interações entre micróbios hospedeiros em nível molecular.
Não se esqueça de que trabalhar com patógenos microbianos e reagentes químicos, como azida de sódio, pode ser perigoso e precauções de segurança apropriadas, como EPI e métodos de descarte de resíduos, devem ser empregadas.
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Visão Geral
Este estudo apresenta o nematódeo Caenorhabditis elegans como um modelo de hospedeiro versátil para investigar interações microbianas, com foco particular em infecções fúngicas. O método permite aos pesquisadores explorar questões mecanicistas fundamentais em doenças infecciosas, incluindo a virulência do patógeno e as respostas imunológicas do hospedeiro.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Interações microbianas
- Pesquisa em doenças infecciosas
- Dinâmica hospedeiro-patógeno
Contexto
- Caenorhabditis elegans atua como um organismo modelo eficaz.
- O estudo tem como objetivo compreender os efeitos de infecções fúngicas.
- Esse modelo também pode ser adaptado para outros agentes infecciosos.
- Ele fornece um sistema economicamente viável e de fácil manipulação para experimentação.
Objetivo do Estudo
- Observar os efeitos da infecção fúngica em C. elegans.
- Investigar fatores de virulência do patógeno.
- Explorar efetores imunes do hospedeiro e a descoberta de fármacos.
Métodos Utilizados
- Ensaio para observar os efeitos da infecção fúngica.
- Utilização de C. elegans como modelo de hospedeiro.
- Configuração experimental para estudar interações entre hospedeiro e patógeno.
- Técnica de seleção de vermes utilizando fio de alumínio e pipeta.
Resultados Principais
- Conhecimentos sobre patógenos fúngicos e suas interações com hospedeiros.
- Compreensão das respostas imunológicas do hospedeiro a infecções.
- Aplicações potenciais na descoberta de fármacos.
- Estrutura para o estudo de diversos agentes infecciosos.
Conclusões
- C. elegans é um modelo valioso para a pesquisa de doenças infecciosas.
- O método é adaptável para o estudo de múltiplos patógenos.
- Essa abordagem aprimora a compreensão da dinâmica entre hospedeiro e patógeno.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Caenorhabditis elegans fornece um modelo in vivo escalável e de baixo custo para reduzir riscos em estudos de interações hospedeiro-microbio no estágio inicial de descoberta. Sua anatomia transparente e imunidade inata conservada permitem a investigação mecanicista de fatores de virulência e vias de defesa do hospedeiro, reforçando a confiabilidade preditiva na validação de alvos. Este sistema conecta a triagem fenotípica à descoberta de biomarcadores translacionais para a identificação de compostos ativos antifúngicos e antibacterianos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de genes de virulência microbiana, como EFG1 e CPH1 em Candida albicans, por meio de ensaios de sobrevivência.
- Valor Operacional: Apoia triagens de genoma inteiro em alto rendimento para identificar mutantes de hospedeiro ou patógeno com virulência alterada.
- Valor Estratégico: Facilita a redução de riscos em alvos ao associar perturbações genéticas a fenótipos de sobrevivência mensuráveis em um contexto de organismo inteiro.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Permite a quantificação da colonização por patógenos por meio de marcação fluorescente (por exemplo, C. albicans marcado com RFP) na luz intestinal.
- Valor Operacional: Utiliza leituras padronizadas de sobrevivência (pontuação de vivo/morto, fenótipo Dar) para execução reprodutível do ensaio em intervalos de 48 horas.
- Valor Estratégico: Permite a triagem de inibidores químicos ou bibliotecas genéticas para descoberta de compostos antifúngicos ou fatores de virulência.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Modela respostas conservadas da imunidade inata do hospedeiro, incluindo a produção de espécies reativas de oxigênio dependente de dupla oxidade, relevantes para a defesa mucosal em mamíferos.
- Valor Operacional: A capacidade de criopreservação garante a disponibilidade prolongada da linhagem, reduzindo a variabilidade e permitindo delineamentos de estudos longitudinais.
- Valor Estratégico: Apoia decisões de avanço com ajuste de risco ao validar a essencialidade de alvos na virulência do patógeno antes do investimento em modelos mamíferos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio integra-se aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao permitir a validação fenotípica de alvos identificados por meio de triagem genômica ou química, com aplicabilidade direta às campanhas de identificação de compostos líderes.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre interações hospedeiro-patógeno por meio de resultados mensuráveis, como cinética de sobrevivência e imagens de colonização.
- Triagem: Fornece saídas quantitativas e reprodutíveis, incluindo curvas de sobrevivência e intensidade de fluorescência, para comparação de compostos ou genótipos.
- Análises: Gera pontos finais estatísticos (por exemplo, sobrevivência mediana, % de vermes Dar-positivos) para permitir a priorização de alvos e a modelagem de relações estrutura-atividade.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se ao trabalho pré-clínico por meio de vias imunológicas conservadas (por exemplo, geração de ESP) que imitam mecanismos de defesa epiteliais em mamíferos.
- Reutilização Empresarial: A adaptabilidade da plataforma em infecções bacterianas, fúngicas e polimicrobianas favorece a reutilização em diversos programas de doenças infecciosas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista em estudos de virulência e imunidade por meio da visualização direta da colonização intestinal e do rastreamento em tempo real da sobrevivência.
- Valor Operacional: Baixo custo, tempo de geração curto e adequação à automação aumentam a produtividade e reduzem o consumo de recursos por ensaio.
- Valor Estratégico: Melhora a confiança nas decisões de prosseguimento ou interrupção ao fornecer validação ortogonal de alvos em um contexto de hospedeiro fisiologicamente relevante.
- Impacto no Portfólio: Permite a triagem precoce de candidatos a antimicrobianos ao filtrar compostos que não apresentam eficácia em um modelo de infecção em hospedeiro inteiro.
Considerações de Implementação
- É necessária experiência no manejo de C. elegans, cultura microbiana e microscopia de fluorescência para a montagem e análise do ensaio.
- A preparação padronizada de placas de NGM, o plantio da leiva bacteriana e a sincronização dos vermes garantem a reprodutibilidade entre os experimentos.
- É necessária contenção de biossegurança (Nível 2 de Biossegurança) ao trabalhar com microrganismos patogênicos, como C. albicans.
- A sensibilidade do ensaio pode ser limitada pela fase de desenvolvimento dos vermes e pela variabilidade da fonte alimentar bacteriana, exigindo protocolos rigorosos de sincronização.
- Embora aplicável a múltiplos patógenos, é necessário otimizar as condições de infecção (por exemplo, inóculo, temperatura) para agentes não fúngicos.
