JoVE Science Education

Advanced Biology

Uma introdução à morte celular

JoVE Science Education
Cell Biology

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Science Education Cell Biology

An Introduction to Cell Death

4.12: Detecting Reactive Oxygen Species

4.15: Annexin V and Propidium Iodide Labeling

52,621 Views

•

10:06 min

•

April 30, 2023

Overview

Necrose, apoptose e morte celular autofágica são todas as maneiras pelas quais as células podem morrer, e esses mecanismos podem ser induzidos por diferentes estímulos, como lesões celulares, baixos níveis de nutrientes ou proteínas de sinalização. Considerando que a necrose é considerada uma forma “acidental” ou inesperada de morte celular, existem evidências de que a apoptose e a autofagia são programadas e “planejadas” pelas células.

Neste vídeo introdutório, o JoVE destaca as principais descobertas relativas à morte celular, incluindo trabalhos recentes feitos em vermes que ajudaram a identificar genes envolvidos na apoptose. Em seguida, exploramos perguntas feitas por cientistas que estudam a morte celular, algumas das quais olham para diferentes caminhos da morte e suas interações. Finalmente, vários métodos para avaliar a morte celular são discutidos, e notamos como os pesquisadores estão aplicando essas técnicas em seus experimentos hoje.

Procedure

Paradoxalmente, a morte celular ajuda a moldar a vida de um organismo. Assim como qualquer organismo inteiro, as células podem morrer como resultado do envelhecimento, devido a lesões acidentais, ou após uma infiltração patógena uma célula pode se sacrificar para evitar a propagação da infecção. Nestas circunstâncias, as células podem seguir diferentes caminhos da morte, como apoptose, autofagia ou necrose. Todos esses tipos apresentam características morfológicas específicas. Apoptose ou morte celular programada leva à “bransada” da membrana e à fragmentação nuclear. A autofagia, que também é regulamentada, leva à formação de grandes vacuoles que incluem componentes celulares. Por fim, a necrose, que é “não planejada” ou acidental, termina em lise celular.

Este vídeo discutirá importantes descobertas que levaram à identificação desses caminhos, explorará questões que os pesquisadores ainda estão fazendo sobre a morte celular, discutirá ferramentas que usam para respondê-las e, finalmente, revisará alguns experimentos de exemplo.

Primeiro, vamos rever alguns dos principais pesquisadores que ajudaram a decifrar diferentes caminhos de morte celular.

Os termos modernos usados para descrever esses caminhos podem ser rastreados até Hipócrates, um médico na Grécia antiga. Ele usou o termo apoptose, que significa “cair”, para descrever a “trituração” óssea observada após uma fratura. Chegando à era moderna, a primeira menção notável de “necrose” ocorreu em 1859, quando Rudolf Virchow — em sua compilação chamada Patologia Celular— usou este termo para descrever “colapso tecidual avançado”.

Com os avanços da microscopia e histologia ao longo da década seguinte, em 1877 Carl Weigert e Julius Cohnheim foram capazes de estudar necrose no nível celular. Eles forneceram uma visão das características morfológicas associadas a esse tipo de morte, como a perda de núcleos.

Quase 70 anos depois, Christian de Duve descobriu a “autofagia”, um processo no qual componentes celulares são engolidos e quebrados por organelas ligadas à membrana chamadas autofagossos, que se fundem com outro tipo de organela — lisosomos — para destruir ainda mais seu conteúdo. Sabemos agora que a autofagia realmente desempenha um papel duplo na célula, seja facilitando a sobrevivência ou induzindo a morte.

Em 1972, John Kerr, A. R. Currie e Andrew Wyllie observaram outro tipo de morte celular com morfologia peculiar. Uma vez que este processo envolvia peças “caindo” de células mortas, eles deram-lhe o antigo nome grego apoptose. Mais tarde, a apoptose foi reconhecida como uma forma de “morte celular programada” em 1977, quando H. R. Horvitz e John Sulston estavam estudando o desenvolvimento de C. elegans. Eles notaram que células específicas seriam submetidas à apoptose ao mesmo tempo em vermes diferentes.

Uma vez que isso estava acontecendo no início durante o desenvolvimento, ele insinuou que os genes podem guiar apoptose. Esta hipótese foi confirmada pelo grupo de Horvitz na década de 1980, quando observaram que células com mutações em certos genes de ced ou “C. elegans morte” não morreram durante o desenvolvimento desses vermes. Mais tarde, Horvitz mostrou que o gene ced-3 codifica uma enzima degradante de proteínas chamada caspase. Agora, sabemos que existem várias caspases, e elas desempenham papéis importantes na morte celular.

Esses avanços no campo da morte celular abriram novos caminhos para os pesquisadores explorarem. Vamos olhar para alguns deles.

Sempre houve interesse em descobrir quais fatores desencadeiam a morte celular. Para identificá-las, os pesquisadores estão atualmente expondo células a radiação, produtos químicos e moléculas de sinalização e, em seguida, procurando mudanças no grau ou tipo de morte.

Outros cientistas estão interessados em elucidar as vias bioquímicas envolvidas em cada mecanismo de morte celular. Atualmente, sabemos que a apoptose segue um caminho onde as caspases são as enzimas-chave, enquanto a autofagia envolve proteínas necessárias para a formação autofagossa. No entanto, existem componentes nessas vias que são desconhecidos, e os pesquisadores estão tentando descobrir maneiras de explicá-los. Além disso, os pesquisadores também estão estudando se algum “crosstalk” ocorre entre as vias de morte celular. Se o crosstalk estiver presente, então o mesmo sinal pode fatorar na apoptose, bem como na autofagia.

Por fim, uma área popular de pesquisa lida com a compreensão de por que certas células — como células cancerosas — se tornam imortais. Os cientistas estão constantemente procurando mutações em células cancerosas, e avaliando se alguma delas afeta os fatores de codificação de genes envolvidos nas vias da morte.

São perguntas complicadas, mas felizmente os pesquisadores têm uma variedade de ferramentas à sua disposição para respondê-las.

O ensaio azul trypan é uma ferramenta de triagem comumente usada para avaliar o efeito de um composto na morte celular. O ensaio baseia-se em uma mancha que não pode entrar em células vivas, pois possui “membranas seletivas”, mas podem facilmente entrar em células mortas à medida que suas membranas são “rompidas”. Este ensaio identifica a morte celular, mas não identifica a via específica da morte celular.

Portanto, os cientistas projetaram técnicas como ensaios de atividade caspase. Uma vez que as caspases são ativadas durante a apoptose, os cientistas podem adicionar substratos para essas enzimas que fluorescem quando são ativadas por caspases. Isso ajuda na identificação de células apoptóticas.

Da mesma forma, a fragmentação de DNA que acontece durante a apoptose pode ser facilmente identificada usando o ensaio TUNEL, que se baseia em reagentes que marcam as extremidades “cortadas” do DNA danificado. Como este método é relativamente fácil de executar, é um ensaio comumente empregado no campo.

Quando os cientistas querem determinar o mecanismo de morte celular que ocorre em sua população, eles podem emparelhar manchas de iodeto de anexo v e propidium (PI) com análise de citometria de fluxo. O anexo V liga-se aos resíduos de fosfatidilaserina na membrana, enquanto pi entra através das membranas danificadas para se associar ao DNA. Ao estudar os dados resultantes, os cientistas podem separar células submetidas a diferentes caminhos de morte.

Por fim, os cientistas podem usar imagens de células vivas para ver o processo de morte celular em tempo real. Esta é uma técnica abrangente que pode ser usada para identificar células autofágicas, necróticas ou apoptóticas baseadas em características morfológicas únicas.

Como você viu, existem vários métodos para detectar a morte celular, alguns dos quais não são específicos, outros que podem ajudar a identificar células apoptóticas, e alguns que distinguem entre diferentes caminhos.

Agora, vamos ver como os cientistas estão usando essas técnicas para estudar mais sobre a morte celular.

A dieta desempenha um papel importante na saúde, podendo afetar a morte celular em diferentes tecidos. Neste ensaio in vitro, os pesquisadores expuseram neurônios de camundongos ao ácido palmítico, um ácido graxo saturado presente em produtos lácteos e carne, e depois usaram um ensaio de caspase para avaliar apoptose. Eles descobriram que as células tratadas com ácido palmítico demonstravam aumento da atividade caspase e morte celular.

Outros pesquisadores estão usando esses ensaios para determinar como as drogas induzem diferentes mecanismos de morte. Aqui, camundongos transgênicos com células cancerígenas fluorescentes foram injetados com doxorubicina, uma droga anticâncgena. Os cientistas então imaginaram células em animais vivos, e ao procurar mudanças na morfologia celular do câncer, determinaram que o tratamento medicamentoso desencadeou tanto apoptose quanto necrose.

Finalmente, alguns cientistas estão investigando se a morte celular pode ser revertida. Neste experimento, pesquisadores expuseram células cancerígenas humanas ao etanol, e confirmaram através de uma variedade de ensaios que esse tratamento as fez embarcar no caminho da apoptose. Ao lavar o etanol, as células afetadas foram capazes de se recuperar da apoptose através de um processo chamado “anastase”. Isso forneceu uma visão de como os cânceres podem retornar após o tratamento medicamentoso.

Você acabou de assistir a introdução de JoVE às vias de morte celular. Este vídeo revisou a rica história da pesquisa sobre morte celular — dos tempos antigos ao século XX — e depois discutiu algumas questões atuais. Também explicamos métodos populares para avaliar a morte celular, e demonstramos como essas técnicas estão sendo usadas para entender melhor a conexão entre ambiente, doença e morte celular. Como sempre, obrigado por assistir!

Transcript

Paradoxically, cell death helps shape an organism’s life. Just like any whole organism, cells can die as a result of aging, due to accidental injury, or following a pathogen infiltration a cell can sacrifice itself to prevent the spread of infection. Under these circumstances, cells can follow different death pathways like apoptosis, autophagy, or necrosis. All these types display specific morphological characteristics. Apoptosis or programmed cell death leads to membrane “blebbing” and nuclear fragmentation. Autophagy, which is also regulated, leads to formation of large vacuoles enclosing cellular components. Lastly, necrosis, which is “unplanned” or accidental, ends in cell lysis.

This video will discuss important discoveries that led to the identification of these pathways, explore questions that researchers are still asking about cell death, discuss tools they use to answer them, and finally review a few example experiments.

First, let’s review some key researchers who helped to decipher different cell death pathways.

Modern terms used to describe these paths can be traced back to Hippocrates, a physician in ancient Greece. He used the term apoptosis, meaning “falling off,” to describe bone “shredding” observed following a fracture. Coming to the modern era, the first noticeable mention of “necrosis” occurred in 1859, when Rudolf Virchow—in his compilation called Cell Pathology—used this term to describe “advanced tissue breakdown.”

With advances in microscopy and histology over the next decade, in 1877 Carl Weigert and Julius Cohnheim were able to study necrosis at the cellular level. They provided insight into the morphological features associated with this type of death, like the loss of nuclei.

Almost 70 years later, Christian de Duve discovered “autophagy,” a process in which cellular components are engulfed and broken down by membrane-bound organelles called autophagosomes, which fuse with another type of organelle—lysosomes—to further destroy their contents. We now know that autophagy actually plays a dual role in the cell, either facilitating survival or inducing death.

In 1972, John Kerr, A. R. Currie, and Andrew Wyllie observed another type of cell death with peculiar morphology. Since this process involved pieces “falling off” of dead cells, they gave it the ancient Greek name apoptosis. Later, apoptosis was recognized as a form of “programmed cell death” in 1977, when H. R. Horvitz and John Sulston were studying C. elegans development. They noticed that specific cells would undergo apoptosis at the same time in different worms.

Since this was happening early on during development, it hinted that genes may guide apoptosis. This hypothesis was confirmed by Horvitz’s group in the 1980’s, when they observed that cells with mutations in certain ced or “C. elegans death” genes didn’t die during the development of these worms. Later, Horvitz showed that the ced-3 gene encodes a protein-degrading enzyme called a caspase. Now, we know that there are several caspases, and they play major roles in cell death.

These advances in the cell death field opened new roads for researchers to explore. Let’s look at some of them.

There has always been interest in finding out what factors trigger cell death. To identify them, researchers are currently exposing cells to radiation, chemicals, and signaling molecules, and then searching for changes in the degree or type of death.

Other scientists are interested in elucidating the biochemical pathways involved in each cell death mechanism. Currently, we know that apoptosis follows a pathway where caspases are the key enzymes, whereas autophagy involves proteins that are necessary for autophagosome formation. However, there are components in these pathways that are unknown, and researchers are trying to figure out ways to explain them. In addition, researchers are also studying whether any “crosstalk” occurs between cell death pathways. If crosstalk is present, then the same signal can factor in apoptosis, as well as autophagy.

Lastly, a popular area of research deals with understanding why certain cells—like cancer cells—become immortal. Scientists are constantly looking for mutations in cancer cells, and assessing whether any of them affect genes encoding factors involved in death pathways.

These are all complicated questions, but luckily researchers have a variety of tools at their disposal to answer them.

The trypan blue assay is a commonly used screening tool to assess the effect of a compound on cell death. The assay relies on a stain that cannot enter live cells, as they posses “selective membranes,” but can easily enter dead cells as their membranes are “ruptured.” This assay identifies cell death, but fails to pinpoint the specific cell death pathway.

Therefore, scientists have designed techniques like caspase activity assays. Since caspases are activated during apoptosis, scientists can add substrates for these enzymes that fluoresce when they’re activated by caspases. This helps in the identification of apoptotic cells.

Similarly, DNA fragmentation that happens during apoptosis can be easily identified using the TUNEL assay, which relies on reagents that tag the “nicked” ends of damaged DNA. As this method is relatively easy to perform, it is a commonly employed assay in the field.

When scientists want to determine the cell death mechanism occurring in their population, they can pair annexin V and propidium iodide (PI) stains with flow cytometry analysis. Annexin V binds to phosphatidylserine residues in the membrane, whereas PI enters through the damaged membranes to associate with DNA. By studying the resulting data, scientists can separate cells undergoing different death pathways.

Lastly, scientists can use live cell imaging to view the cell death process in real time. This is an all-encompassing technique that can be used to identify autophagic, necrotic, or apoptotic cells based on unique morphological features.

As you’ve seen, there are several methods to detect cell death, some of which are not specific, others that can help identify apoptotic cells, and some that distinguish between different pathways.

Now, let’s see how scientists are using these techniques to study more about cell death.

Diet plays an important role in health, and may affect cell death in different tissues. In this in vitro assay, researchers exposed mouse neurons to palmitic acid, a saturated fatty acid present in both dairy products and meat, and then used a caspase assay to evaluate apoptosis. They discovered that palmitic acid-treated cells demonstrated increased caspase activity and cell death.

Other researchers are using these assays to determine how drugs induce different death mechanisms. Here, transgenic mice with fluorescently labeled cancer cells were injected with doxorubicin, an anti-cancer drug. Scientists then imaged cells in live animals, and by looking for changes in cancer cell morphology, determined that drug treatment triggered both apoptosis and necrosis.

Finally, some scientists are investigating whether cell death can be reversed. In this experiment, researchers exposed human cancer cells to ethanol, and confirmed through a variety of assays that this treatment caused them to embark on the apoptosis pathway. Upon washing off the ethanol, affected cells were able to recover from apoptosis through a process called “anastasis.” This provided insight into how cancers can return following drug treatment.

You’ve just watched JoVE’s introduction to cell death pathways. This video reviewed the rich history of cell death research—from ancient times to the 20th century—and then discussed a few current questions. We also explained popular methods to assay cell death, and demonstrated how these techniques are being used to better understand the connection between environment, disease, and cell death. As always, thanks for watching!

Tags

Valor vazio emissão