Uma introdução à morte celular

Paradoxalmente, a morte celular ajuda a moldar a vida de um organismo. Assim como qualquer organismo inteiro, as células podem morrer como resultado do envelhecimento, devido a lesões acidentais, ou após uma infiltração patógena uma célula pode se sacrificar para evitar a propagação da infecção. Nestas circunstâncias, as células podem seguir diferentes caminhos da morte, como apoptose, autofagia ou necrose. Todos esses tipos apresentam características morfológicas específicas. Apoptose ou morte celular programada leva à "bransada" da membrana e à fragmentação nuclear. A autofagia, que também é regulamentada, leva à formação de grandes vacuoles que incluem componentes celulares. Por fim, a necrose, que é "não planejada" ou acidental, termina em lise celular.

Este vídeo discutirá importantes descobertas que levaram à identificação desses caminhos, explorará questões que os pesquisadores ainda estão fazendo sobre a morte celular, discutirá ferramentas que usam para respondê-las e, finalmente, revisará alguns experimentos de exemplo.

Primeiro, vamos rever alguns dos principais pesquisadores que ajudaram a decifrar diferentes caminhos de morte celular.

Os termos modernos usados para descrever esses caminhos podem ser rastreados até Hipócrates, um médico na Grécia antiga. Ele usou o termo apoptose, que significa "cair", para descrever a "trituração" óssea observada após uma fratura. Chegando à era moderna, a primeira menção notável de "necrose" ocorreu em 1859, quando Rudolf Virchow — em sua compilação chamada Patologia Celular— usou este termo para descrever "colapso tecidual avançado".

Com os avanços da microscopia e histologia ao longo da década seguinte, em 1877 Carl Weigert e Julius Cohnheim foram capazes de estudar necrose no nível celular. Eles forneceram uma visão das características morfológicas associadas a esse tipo de morte, como a perda de núcleos.

Quase 70 anos depois, Christian de Duve descobriu a "autofagia", um processo no qual componentes celulares são engolidos e quebrados por organelas ligadas à membrana chamadas autofagossos, que se fundem com outro tipo de organela — lisosomos — para destruir ainda mais seu conteúdo. Sabemos agora que a autofagia realmente desempenha um papel duplo na célula, seja facilitando a sobrevivência ou induzindo a morte.

Em 1972, John Kerr, A. R. Currie e Andrew Wyllie observaram outro tipo de morte celular com morfologia peculiar. Uma vez que este processo envolvia peças "caindo" de células mortas, eles deram-lhe o antigo nome grego apoptose. Mais tarde, a apoptose foi reconhecida como uma forma de "morte celular programada" em 1977, quando H. R. Horvitz e John Sulston estavam estudando o desenvolvimento de C. elegans. Eles notaram que células específicas seriam submetidas à apoptose ao mesmo tempo em vermes diferentes.

Uma vez que isso estava acontecendo no início durante o desenvolvimento, ele insinuou que os genes podem guiar apoptose. Esta hipótese foi confirmada pelo grupo de Horvitz na década de 1980, quando observaram que células com mutações em certos genes de ced ou "C. elegans morte" não morreram durante o desenvolvimento desses vermes. Mais tarde, Horvitz mostrou que o gene ced-3 codifica uma enzima degradante de proteínas chamada caspase. Agora, sabemos que existem várias caspases, e elas desempenham papéis importantes na morte celular.

Esses avanços no campo da morte celular abriram novos caminhos para os pesquisadores explorarem. Vamos olhar para alguns deles.

Sempre houve interesse em descobrir quais fatores desencadeiam a morte celular. Para identificá-las, os pesquisadores estão atualmente expondo células a radiação, produtos químicos e moléculas de sinalização e, em seguida, procurando mudanças no grau ou tipo de morte.

Outros cientistas estão interessados em elucidar as vias bioquímicas envolvidas em cada mecanismo de morte celular. Atualmente, sabemos que a apoptose segue um caminho onde as caspases são as enzimas-chave, enquanto a autofagia envolve proteínas necessárias para a formação autofagossa. No entanto, existem componentes nessas vias que são desconhecidos, e os pesquisadores estão tentando descobrir maneiras de explicá-los. Além disso, os pesquisadores também estão estudando se algum "crosstalk" ocorre entre as vias de morte celular. Se o crosstalk estiver presente, então o mesmo sinal pode fatorar na apoptose, bem como na autofagia.

Por fim, uma área popular de pesquisa lida com a compreensão de por que certas células — como células cancerosas — se tornam imortais. Os cientistas estão constantemente procurando mutações em células cancerosas, e avaliando se alguma delas afeta os fatores de codificação de genes envolvidos nas vias da morte.

São perguntas complicadas, mas felizmente os pesquisadores têm uma variedade de ferramentas à sua disposição para respondê-las.

O ensaio azul trypan é uma ferramenta de triagem comumente usada para avaliar o efeito de um composto na morte celular. O ensaio baseia-se em uma mancha que não pode entrar em células vivas, pois possui "membranas seletivas", mas podem facilmente entrar em células mortas à medida que suas membranas são "rompidas". Este ensaio identifica a morte celular, mas não identifica a via específica da morte celular.

Portanto, os cientistas projetaram técnicas como ensaios de atividade caspase. Uma vez que as caspases são ativadas durante a apoptose, os cientistas podem adicionar substratos para essas enzimas que fluorescem quando são ativadas por caspases. Isso ajuda na identificação de células apoptóticas.

Da mesma forma, a fragmentação de DNA que acontece durante a apoptose pode ser facilmente identificada usando o ensaio TUNEL, que se baseia em reagentes que marcam as extremidades "cortadas" do DNA danificado. Como este método é relativamente fácil de executar, é um ensaio comumente empregado no campo.

Quando os cientistas querem determinar o mecanismo de morte celular que ocorre em sua população, eles podem emparelhar manchas de iodeto de anexo v e propidium (PI) com análise de citometria de fluxo. O anexo V liga-se aos resíduos de fosfatidilaserina na membrana, enquanto pi entra através das membranas danificadas para se associar ao DNA. Ao estudar os dados resultantes, os cientistas podem separar células submetidas a diferentes caminhos de morte.

Por fim, os cientistas podem usar imagens de células vivas para ver o processo de morte celular em tempo real. Esta é uma técnica abrangente que pode ser usada para identificar células autofágicas, necróticas ou apoptóticas baseadas em características morfológicas únicas.

Como você viu, existem vários métodos para detectar a morte celular, alguns dos quais não são específicos, outros que podem ajudar a identificar células apoptóticas, e alguns que distinguem entre diferentes caminhos.

Agora, vamos ver como os cientistas estão usando essas técnicas para estudar mais sobre a morte celular.

A dieta desempenha um papel importante na saúde, podendo afetar a morte celular em diferentes tecidos. Neste ensaio in vitro, os pesquisadores expuseram neurônios de camundongos ao ácido palmítico, um ácido graxo saturado presente em produtos lácteos e carne, e depois usaram um ensaio de caspase para avaliar apoptose. Eles descobriram que as células tratadas com ácido palmítico demonstravam aumento da atividade caspase e morte celular.

Outros pesquisadores estão usando esses ensaios para determinar como as drogas induzem diferentes mecanismos de morte. Aqui, camundongos transgênicos com células cancerígenas fluorescentes foram injetados com doxorubicina, uma droga anticâncgena. Os cientistas então imaginaram células em animais vivos, e ao procurar mudanças na morfologia celular do câncer, determinaram que o tratamento medicamentoso desencadeou tanto apoptose quanto necrose.

Finalmente, alguns cientistas estão investigando se a morte celular pode ser revertida. Neste experimento, pesquisadores expuseram células cancerígenas humanas ao etanol, e confirmaram através de uma variedade de ensaios que esse tratamento as fez embarcar no caminho da apoptose. Ao lavar o etanol, as células afetadas foram capazes de se recuperar da apoptose através de um processo chamado "anastase". Isso forneceu uma visão de como os cânceres podem retornar após o tratamento medicamentoso.

Você acabou de assistir a introdução de JoVE às vias de morte celular. Este vídeo revisou a rica história da pesquisa sobre morte celular — dos tempos antigos ao século XX — e depois discutiu algumas questões atuais. Também explicamos métodos populares para avaliar a morte celular, e demonstramos como essas técnicas estão sendo usadas para entender melhor a conexão entre ambiente, doença e morte celular. Como sempre, obrigado por assistir!