Fabricação e caracterização de andaimes de fibra Griffithsin-modificado para a prevenção de doenças sexualmente transmissíveis

O objetivo geral deste procedimento é fabricar e modificar a superfície de ácido polilático, ácido co-glicólico, fibras eletrofiadas, com quantidades variáveis da proteína antiviral Griffithsin. Esse método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da entrega de medicamentos, como formular e caracterizar novos veículos de entrega que podem prevenir infecções virais sexualmente transmissíveis, como o HIV-1. A principal vantagem da técnica é que a atividade antiviral da Griffithsin é maximizada usando fibras poliméricas-eletrofiadas como um andaime estacionário para Griffithsin altamente localizado na superfície da fibra.

As implicações dessa técnica se estendem à terapia de outras infecções virais e bacterianas, devido ao potente potencial profilático e terapêutico de Griffithsin contra uma variedade de tipos de infecção. Embora esse método possa fornecer informações sobre a prevenção da infecção pelo HIV-1, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como outras infecções virais ou bacterianas nas quais Griffithsin demonstrou potência. Para iniciar este procedimento, pesar 720 miligramas de PLGA 50/50 em uma cintilação vil de 10 mililitros.

Usando uma pipeta de vidro sorológica, adicione 3,0 mililitros de HFIP. Cubra o vil com filme plástico. Em seguida, meça e registre a massa vil.

Incube a suspensão de polímero a 37 graus Celsius durante a noite para garantir a dissolução completa do polímero. Depois disso, prepare o aparelho de eletrofiação conforme descrito no protocolo de texto. Use uma seringa de três mililitros para aspirar a solução de polímero.

Em seguida, conecte uma ponta de agulha romba de calibre 18 de 0,5 polegada à seringa. Dispense o excesso de solução para remover o espaço vazio da agulha. Coloque a seringa em uma bomba de seringa e ajuste a vazão do instrumento para 2.0 mililitros por hora.

Conecte a fonte de alimentação à agulha da seringa. Eletrospin a solução de polímero usando uma tensão positiva de 27 quilovolts. Depois que toda a solução for eletrofiada, desligue a fonte de alimentação.

Deixe o mandril girar por mais 30 minutos, para evaporar totalmente o solvente. Em seguida, desligue o coletor de mandril giratório. Usando uma lâmina de barbear, retire suavemente a fibra do mandril.

Colete a fibra PLGA eletrofiada em uma placa de Petri rotulada. Coloque o prato em um dessecador durante a noite para remover qualquer solvente residual. Para começar, prepare as soluções PBS e MES conforme descrito no protocolo de texto.

Em seguida, remova o EDC e o NHS do freezer. Deixe-os descansar para equilibrar a temperatura ambiente. Depois disso, pesar quatro miligramas de EDC em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Pesar seis miligramas de NHS em um tubo de microcentrífuga diferente. Adicione um mililitro de tampão MES a cada tubo. Vortex ambos os tubos vigorosamente para garantir que os reagentes estejam totalmente dissolvidos.

Em seguida, pesar 70 miligramas de hidroxilamina em um tubo de centrífuga cônico de 50 mililitros. Adicione 20 mililitros de PBS e vórtice. Massa

Adicione oito mililitros de tampão MES à fibra. Em seguida, adicione um mililitro das soluções EDC e NHS. Use filme plástico para selar o tubo de centrífuga cônico de 15 mililitros.

Coloque o tubo em um rotador para inverter suavemente a solução por 15 minutos em temperatura ambiente. Depois disso, adicione 14 microlitros de beta-mercaptoetanol para extinguir a reação. Inverta o tubo várias vezes para garantir uma mistura completa.

Descarte o sobrenadante e enxágue a fibra PLGA duas vezes usando 10 mililitros de PBS para cada lavagem. Adicione uma quantidade apropriada de solução estoque GRFT ao tubo, conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, adicione PBS suficiente para trazer o volume final para oito mililitros.

Feche e inverta o tubo para garantir uma mistura completa. Sele o tubo com filme plástico. Coloque o tubo no rotador para inverter suavemente a solução por duas horas.

Depois disso, extinguir a reação adicionando dois mililitros da solução de hidroxilamina preparada e vórtice por 30 segundos. Descarte o sobrenadante. Enxágue a fibra PLGA modificada da superfície duas vezes, usando 10 mililitros de água ultrapura e vórtice para cada lavagem.

Em seguida, transfira a fibra lavada para uma placa de Petri. Coloque a placa de Petri dentro de um dessecador, até que a fibra esteja completamente seca. Em seguida, armazene a placa de Petri a quatro graus Celsius.

Para começar, coloque três tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Massa Em seguida, adicione um mililitro de DMSO a cada tubo.

Vortex por um minuto em temperatura ambiente para dissolver completamente a fibra. Depois disso, diluir uma alíquota de 10 microlitros pelo menos 100 vezes, em tampão TE. Armazene a menos 20 graus Celsius, até carregar a caracterização com Eliza.

Pesar entre 5 e 10 miligramas de fibra modificada superficialmente e transferi-la para um tubo de microcentrífuga. Registre a massa de fibra colocada em cada tubo. Em seguida, adicione um mililitro de uma solução que imite o ambiente fisiológico de cada amostra.

Incubar as amostras num agitador rotativo a 200 RPM e 37 graus Celsius durante uma hora. Em seguida, retirar cerca de um mililitro da solução que contém a FTGR dessorvida e alíquota para tubos de agrupamento. Armazene a menos 20 graus Celsius até que esteja pronto para realizar a quantificação da proteína.

Em seguida, transfira a amostra para um novo tubo de microcentrífuga. Adicione um mililitro de solução tampão fresca e incube até o próximo ponto de tempo, conforme descrito no protocolo de texto. Neste estudo, são examinadas as condições para a fabricação de fibras eletrofiadas de PLGA.

A análise de MEV de fibras GRFT em branco, 0,05 nanomole, 0,5 nanomol e 5 nanomoles indica que a modificação GRFT não tem efeito na morfologia da fibra. Todas as formações têm diâmetros médios semelhantes, em torno de 1,9 mícrons, demonstrando a consistência do processo de fabricação modificado entre os lotes. A quantidade de GRFT conjugada nas fibras eletrofiadas é então determinada.

A modificação de 5 nanomoles contém 373 nanogramas de GRFT, enquanto as modificações de 0,5 e 0,05 contêm 165 e 42, respectivamente. Isso demonstra que as fibras conjugadas com maior densidade teórica de modificação de superfície resultam em mais GRFT conjugado à fibra. No entanto, uma correlação inversa pode ser vista na eficiência de conjugação resultante.

Em seguida, avalia-se a quantidade de GRFT conjugada covalentemente à fibra. Nas primeiras quatro horas, 113 nanogramas, 25 nanogramas e 10 nanogramas de GRFT por miligrama de fibra eletrofiada são detectados nas concentrações teóricas de modificação de 5 nanomoles, 0,5 nanomol e 0,05 nanomoles, respectivamente. Após quatro horas, o GRFT insignificante é detectado no eluimento de liberação para todas as três formulações.

Esses dados indicam que a maior parte do GRFT está ligada covalentemente às fibras eletrofiadas e que o GRFT absorvido na superfície é liberado nas primeiras quatro horas. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em aproximadamente quatro dias. A eletrofiação do andaime de fibra de polímero requer dois dias para preparar a solução de polímero e eletrofiar.

Já a modificação da superfície, a secagem subsequente e a caracterização da fibra exigiram pelo menos dois dias adicionais. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter as proporções adequadas de reagentes para garantir a modificação ideal. Além disso, também é importante verificar se os parâmetros de eletrofiação estão corretos para garantir a morfologia adequada da fibra.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de administração de medicamentos fabricarem fibras eletrofiadas, que não apenas encapsulam agentes antivirais dentro da fibra, mas têm a capacidade de conjugar agentes ativos através da superfície da fibra. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como eletrogirar fibra polimérica, realizar modificação da superfície da fibra com a proteína antiviral Griffithsin, e Griffithsin qualitativa conjugada à fibra. Não se esqueça de que trabalhar com reagentes como HFIP, beta-mercaptoetanol, EDC e NHS pode ser extremamente perigoso.

Precauções como a aplicação adequada de EPI e o uso de capelas de exaustão química devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.