Name: Fabricação e caracterização de andaimes de fibra Griffithsin-modificado para a prevenção de doenças sexualmente transmissíveis (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Aprenda a fabricar e modificar fibras eletrofiadas de PLGA com Griffithsin para atividade antiviral contra HIV-1. Este método maximiza a eficácia do agente antiviral em sistemas de liberação de fármacos.

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Estamos gratos ao fundo de herança judaica por excelência para o financiamento desta pesquisa. Agradecemos o Dr. Stuart Williams II para generosamente proporcionando o uso do sistema eletrofiação. Agradecemos também o Dr. Kenneth Palmer para nos fornecer com Griffithsin. Além disso, nós agradecemos Dr. Nobuyuki Matoba e seu laboratório para treinamento que na GRFT ELISA trabalhar.

1. preparação e fabricação de andaime fibra Electrospun atenção: todo trabalho com solventes ou soluções de polímero deve ser executado em uma coifa química . Consulte a folha de dados material da segurança de cada reagente antes de iniciar o protocolo.
<ol><li>Para electrospin uma solução de polímero 3 mL 15% w/w PLGA, pesa 720 mg de 50: 50 poli (ácido lático-co-glicólico) (PLGA; 0,55 a 0,75 dL/g, 31-57 kDa) em um frasco de 10ml cintilação. O volume da solução baseia-se o tamanho do lote típico usado em estudos atuais. 
	Nota: A massa de polímero para adicionar a um determinado volume de solvente deve ser calculada pelo primeiro determinar a densidade do solvente utilizado para dissolver o polímero. A densidade do solvente Hexafluoro-2-propanol (HFIP) é 1,59 g/mL. Assim, o peso do solvente, baseado em um volume de 3,0 mL HFIP precisava, é de 4,8 g (3,0 mL x 1,59 g / mL). Por uma fração de 15% w/w de PLGA para HFIP, 720 mg PLGA deve ser adicionado à 3,0 mL HFIP (0,15 x 4.800 mg = 720 mg). A vantagem de usar um % w/w polímero/solução, em vez de % p/v, é que isso dá um peso definido da solução final. Este peso definido permite substituição de solvente mais exata, no caso de evaporação de solvente durante a etapa 1.3.</li>
	<li>, Adicionar 3,0 mL HFIP o frasco de cintilação de vidro contendo PLGA (da etapa 1.1) utilizando uma pipeta de vidro serológicos. Cubra o frasco com filme plástico, em seguida, medir e gravar o frasco Mass.</li>
	<li>Incube a suspensão de polímero durante a noite a 37 ° C, para garantir a completa dissolução do polímero. Se qualquer solvente evapora, diminuindo a massa do frasco, adicione HFIP até o frasco atinge sua massa original na etapa 1.2.</li>
	<li>Após a incubação, preparar o aparelho eletrofiação ( Figura 2). Embora um mandril de qualquer tamanho pode ser usado, aqui, um mandril de aço inoxidável de diâmetro externo de 25 mm rotativa foi usado como o coletor de. 
	Nota: Um maior diâmetro do mandril irá diminuir a espessura da fibra, dada o mesmo volume de solução de eletrofiação.</li>
	<li>Aspirar a solução de polímero em uma seringa de 3 mL.</li>
	<li>Conecte uma ponta de agulha romba 18-gauge, ½ polegada na seringa e dispense o excesso de solução (normalmente de 0,25 mL) para remover o headspace vazio na ponta da agulha.</li>
	<li>Coloque a seringa numa bomba e definir a taxa de fluxo do instrumento a 2,0 mL/h. 
	Nota: Esta taxa de fluxo foi baseado na viscosidade do polímero para esta formulação previamente otimizada.</li>
	<li>Ligar a fonte de alimentação para a agulha da seringa e electrospin a solução de polímero usando uma tensão de + 27 kV. A distância entre a agulha e o coletor deve ser definida como aproximadamente 25 cm ( Figura 2 B). 
	Atenção: O processo de eletrofiação cria um vapor de solvente. Usar uma coifa ou um aparelho fechado ( Figura 2) para remover os vapores nocivos .</li>
	<li>Uma vez que toda a solução é electrospun, desligue a fonte de energia e permitir que o mandril de girar por um adicional 30 min totalmente evaporar o solvente.</li>
	<li>Vez fora o coletor de mandril rotativo e use uma lâmina de barbear para cortar a fibra do mandril. Use a lâmina para descascar suavemente a fibra de mandril.</li>
	<li>Coletar a fibra PLGA electrospun em um prato de Petri etiquetados e coloque em um desiccatorovernight para remover o solvente residual.</li>
</ol> 2. Modificação de superfície das fibras com GRFT <ol><li>preparar soluções de tampão fosfato salino (PBS) e 2-(N-Morpholinos) etanesulfónico ácido (tampão de MES). Prepare o PBS dissolvendo-se 8 g NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4 e 0,24 g KH 2 PO 4 em 1 L de água ultrapura. Da mesma forma, dissolver 19,52 g MES (ácido livre, 195.2 MW) e 29,22 g de NaCl em 1 L de água ultrapura, para preparar o tampão MES. Garantir que o pH final de cada solução é entre 7,2-7,5 e 5.0-6.0, respectivamente, usando um medidor de pH.</li>
	<li>Preparar soluções de trabalho individuais de EDC (2 mM) e NHS (5 mM).
	<ol><li>Remover a EDC e NHS do congelador e permitir-lhes equilibrar a temperatura ambiente antes da pesagem.</li>
		<li>Pesar 4 mg de EDC em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.</li>
		<li>Pesa 6 mg de NHS em outro tubo de microcentrifugadora.</li>
		<li>Adicionar 1 mL MES buffer para cada tubo. Vórtice de ambos os tubos vigorosamente para garantir os reagentes são totalmente dissolvidos.</li>
	</ol></li> <li>Preparar uma solução de hidroxilamina pesando 70 mg em um tubo de centrifuga conico de 50 mL.</li>
	<li>Adicionar 20 mL de PBS para a hidroxilamina e vortex a dissolver-se.</li>
	<li>Massa para fora uma quantidade adequada de fibra PLGA em um tubo de centrifuga conico de 15 mL. Normalmente, 75 mg de fibra é utilizado para cada lote de reação.</li>
	<li>Adicionar 8 mL de tampão MES para o tubo de 15 mL.</li>
	Adicionar 1 mL cada uma das soluções de EDC e NHS preparado anteriormente para o tubo de <li>. O volume final da solução deve ser de 10 mL. As concentrações finais de EDC e NHS devem ser 0,4 mg/mL e 0,6 mg/mL, respectivamente.</li>
	<li>Fechar e selar o tubo de 15ml com filme plástico e coloque em um rotador para permitir que a solução para inverter suavemente durante 15 minutos à temperatura ambiente ( Figura 3 B). Esta etapa ativa os grupos carboxila em polímero para permitir a modificação de ligações covalente com a proteína GRFT ( Figura 3).</li>
	<li>Após a ativação, cuidadosamente saciar a reação adicionando 14 µ l de β-Mercaptoetanol ao tubo. Inverter o tubo várias vezes para assegurar uma mistura completa. 
	Cuidado: β-Mercaptoetanol é altamente tóxico e só deve ser usado em uma coifa química.</li>
	<li>Desprezar o sobrenadante e lavar a fibra PLGA duas vezes, com 10 mL de PBS, para remover qualquer restante β-Mercaptoetanol.</li>
	<li>Após o enxágue, adicionar uma quantidade adequada de solução-mãe GRFT no tubo. Por exemplo, um 5 nmol fibra GRFT/mg exigiria 6,35 µ l de solução-mãe GRFT (a partir de um estoque de 10 mg/mL) por mg de fibra. Assim, uma amostra de fibra 75mg exigiria 476.25 µ l de 10 mg/mL de solução GRFT. 
	Nota: As fibras GRFT com cargas teóricas de 0,05 e 0,5 nmol 5 GRFT por fibra mg foram fabricadas.</li>
	<li>Adicionar suficiente PBS para trazer o volume final de 8ml, fechar e inverter o tubo para assegurar uma mistura completa.</li>
	<li>Fechar o tubo com filme plástico e coloque sobre um rotor novo, este tempo de 2 h.</li>
	<li>Após o 2 h incubação, saciar a reação adicionando 2 mL de solução de hidroxilamina no tubo de centrífuga de 15 mL. As instruções do fabricante, a concentração final de hidroxilamina durante a reação de têmpera deve ser 0,7 mg/mL.</li>
	<li>Misturar a solução bem e descartar o sobrenadante. Enxaguar a superfície modificada fibra PLGA duas vezes com 10 mL de água ultrapura para remover qualquer unconjugated GRFT.</li>
	<li>Transferir a fibra para um prato de Petri e lugar dentro num exsicador até a fibra está completamente seca. Transferir a placa de Petri a 4 ° C, para armazenamento.</li>
</ol> 3. SEM fibras de caracterização da superfície GRFT-modificado <ol><li>lugar uma tira de fita dupla-face de carbono em um SEM montagem de amostra. Rotular o fundo da montagem da amostra com as informações de identificação de amostra usando um marcador permanente.</li>
	<li>Cortar três amostras de uma fibra de superfície modificada e colocá-los em montagens de amostra separada. A espessura de cada amostra é de aproximadamente 0,5 mm.</li>
	<li>Sputter revestir as amostras usando a deposição de partículas induzida por elétrons de uma placa de ouro. Salpicar o casaco para 90 s, a 2.4 kV. 
	Nota: O tempo de revestimento por pulverização catódica pode variar dependendo dos parâmetros do equipamento, incluindo a voltagem e amperagem.</li>
	<li>As amostras de imagem em 8 kV com uma ampliação variando de 1.000 a 5, 000 x.</li>
</ol> 4. Extração de GRFT de superfície modificada de fibras <ol><li>em massa para fora de 2 mg de fibra em triplicado para tubos de 1,5 mL microcentrifuge.</li>
	<li>Adicionar Dimetilsulfóxido 1ml (DMSO) para o tubo, então o vórtex e incubar durante 1 minuto na temperatura para dissolver completamente a fibra.</li>
	<li>Após a incubação, diluir uma alíquota de 10 µ l de a solução de DMSO-fibra da etapa 4.2, pelo menos 100 vezes em tampão Tris-EDTA (TE) (pH = 8,0).</li>
	<li>Armazenar amostras a-20 º C até carregar caracterização com ELISA.</li>
</ol> 5. Medição GRFT dessorção de fibras <ol><li>para avaliar a quantidade de GRFT lançado ou em estudo dessorvida da fibra, pesa 5-10 mg de fibra de superfície modificada e coloque em um tubo de microcentrifugadora. Gravar a massa de fibra em cada tubo.</li>
	<li>Adicionar 1 mL de uma solução adequada que imita o ambiente fisiológico (por exemplo, PBS, tampão de TE, fluido vaginal simulado (SVF), etc.) para cada amostra.</li>
	<li>Incubar as amostras por 1h num agitador rotativo a 200 rpm, 37 ° C.</li>
	<li>Após a incubação, remove aproximadamente 1 mL de tampão TE contendo o GRFT dessorvida do frasco e a alíquota para cluster de tubos. Loja a-20 ° C até quantificação da proteína.</li>
	<li>Transferir a amostra para um tubo de microcentrifugadora novo, adicionar 1 mL de solução tampão fresco para a fibra no interior do tubo de microcentrifugadora e incubar até o próximo ponto de tempo.</li>
	<li>Pontos de tempo típico utilizados para medir a liberação incluem: 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48, 72 h e 1 semana insignificante dessorção foi observada nestes estudos após 4 h.</li>
</ol> 6. Quantificação de extração GRFT e dessorção através de ELISA placa <ol><li>casaco um ELISA 96 poços com 0,1 mL de HA (10 µ g/mL) por bem como descrito anteriormente 51. A placa com a película plástica do selo e incubar durante uma noite a 4 ° C ( Figura 4).</li>
	<li>Remover o buffer de revestimento e adicionar 0,3 mL bloqueio de buffer (2-3% albumina de soro bovino (BSA) em PBS com 0,05% polissorbato 20) para cada poço. Incubar a placa pelo menos 2 h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Após a incubação, lavar a placa 3 vezes com PBS 1x com 0,1% polissorbato 20 (PBS-P). Após o enxágue, dispense 0,1 mL de amostra, padrão ou PBS como controlo negativo nos respectivos poços. Incubar a placa novamente por 1h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar a placa 3 vezes com PBS-P. Após o enxágue, adicionar 0,1 mL de anticorpo primário (soro de cabra anti-GRFT) em cada poço e incubar durante pelo menos 1 h à temperatura ambiente. Normalmente, a solução de anticorpo primário é diluída pela 1:10,000 em PBS.</li>
	<li>Após a incubação das amostras com enxágue do anticorpo primário as placas novamente 3 vezes com PBS-P. Adicionar 0,1 mL de anticorpo secundário (peroxidase de rábano (HRP)-anti-cabra de coelho Conjugado IgG) para cada um bem e incubar por 1h à temperatura ambiente. A solução de anticorpo secundário é diluída pela 1:10,000 em PBS.</li>
	<li>Lavar a placa 3 vezes. Adicione o substrato de peroxidase-2 0,1 mL TMB a cada poço. Monitorar o desenvolvimento de cor (aproximadamente 2 min) e, em seguida, adicionar 0,1 mL H 2 então 4 (1 N) para saciar a reação. Leia a placa a 450 nm em um leitor de placa.</li>
	<li>Média os valores de OD de fundo (poços que receberiam apenas PBS) e isto subtrair os grupos experimentais.</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Devido a suas estruturas porosas e grandes áreas de superfície, EFs têm encontrado uma variedade de aplicações na área da saúde, um dos quais inclui servir como veículos de entrega terapêutica. Drogas e outros agentes ativos podem ser incorporados dentro de EFs para entrega sintonizável, enquanto produtos biológicos e químicos ligantes podem ser conjugadas com a superfície da fibra para célula específica alvo52 ou biosensing53. Aqui a fabricação de GRFT superfície modificad...

O uso do EFs como uma plataforma de entrega tópica tem o potencial para reduzir significativamente as DSTs. Atualmente, existem mais 36 milhões as pessoas que vivem com HIV, com mais 2 milhões de novos casos de relatado em 2015 sozinho1,2. Além disso, o vírus herpes simplex tipo 2 (HSV-2) infecção afeta centenas de milhões de pessoas em todo o mundo e foi mostrado para melhorar a aquisição do HIV por 2-5 vezes3. Devido a esta relação entre infecção por HSV-2 e aquisição do HIV, há um interesse significativo no desenvolvimento de novos agentes ativos que fornecem a proteção simultânea contra várias DSTs. Além disso, o desenvolvimento de novos veículos para melhorar a entrega destes agentes antivirais oferece o potencial para aumentar ainda mais a potência protetora e terapêutica. Para atingir esta meta, EFs têm sido investigados como uma nova plataforma de entrega para reduzir a prevalência de infecções de HIV-1 e HSV-2.
Durante as últimas duas décadas, EFs têm sido extensivamente usados nas áreas de administração de medicamentos e de engenharia de tecidos4. Muitas vezes, polímeros biocompatíveis são selecionados para traduzir facilmente para aplicações terapêuticas. Para fabricar EFs poliméricos, o polímero selecionado é dissolvido em uma solução aquosa ou solvente orgânica, dependendo do grau de polímero hidrofobicidade5. Agentes ativos de interesse são adicionados à solução aquosa ou solvente antes do processo de eletrofiação. A solução de polímero é então aspirada para a seringa e ejectada lentamente enquanto sujeito a uma corrente elétrica. Este processo normalmente resulta em fibras de polímero com folha ou macrostructures cilíndrico (Figura 1) e diâmetros de fibras que variam do micro para nano-escala6. Para aplicações mais terapêuticas, agentes ativos são incorporados dentro das fibras durante o processo de eletrofiação e são liberados da fibra via difusão e a degradação da fibra subsequentes. A taxa de degradação ou de lançamento pode ser alterada usando diferentes tipos de polímeros ou misturas de polímero para estabelecer um perfil do lançamento desejado transmitir propriedades químicas e físicas únicas7e promover o encapsulamento de praticamente qualquer composto. Como tal, EFs provaram ser benéficas para a entrega de drogas de pequenas moléculas e agentes biológicos, incluindo proteínas, peptídeos, oligonucleotides e fatores de crescimento6,8,9.
No campo da prevenção de DST, EFs têm sido recentemente utilizados para incorporar e fornecer sustentada ou inducible-liberação de agentes antivirais10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19. Em um dos primeiros estudos, pH-responsivo fibras foram desenvolvidas para liberar agentes ativos em resposta às mudanças ambientais dentro do trato reprodutivo feminino (FRT), como um método de demanda de proteção contra o HIV-111. Desde então, outros estudos têm investigado a misturas de polímero compostas de óxido de polietileno (PEO) e ácido poli-L-láctico (pilão), para avaliar a liberação sintonizável de agentes antivirais e anticoncepcionais para HIV-1 prevenção e contracepção em vitro 12. estudos adicionais demonstraram a viabilidade de EFs para fornecer o seguinte: prolongada liberação de pequenas moléculas antivirais14, forte e flexível propriedades mecânicas20, arquiteturas de entrega 3-d21 , inibição da penetração de esperma12e a capacidade de mesclar com outras tecnologias de entrega13. Finalmente, o trabalho anterior avaliou fibras poliméricas para a entrega sustentada dos agentes antivirais contra vírus co-infective comuns, o HSV-2 e o HIV-114. Neste estudo, fibras de polímero fornecido atividade complementar para entrega antiviral, mantendo a sua estrutura para até 1 mês e fornecendo uma barreira física a entrada viral. Nesses resultados, foi observado que o EFs podem ser usados para fisicamente e quimicamente impedem a infecção pelo vírus.
Enquanto propriedades de liberação sintonizável EFs poliméricos uma plataforma de entrega atraente para entrega de microbicida, EFs têm sido desenvolvidas em outras aplicações para servir como superfície-modificado andaimes7. EFs têm sido utilizados para imitar a morfologia da matriz extracelular (ECM), muitas vezes agindo como andaimes para melhorar a regeneração celular22e aumentar a sua utilidade em tecido engenharia23,24. Fibras de composto de polímeros tais como poli-ε-Caprolactona (PCL) e pilão ter sido modificado de superfície com proteínas e fatores de crescimento após eletrofiação conferir propriedades como ECM incluindo aumento celular adesão e proliferação de25 , 26. Além disso, foram avaliadas antimicrobianas EFs superfície modificada para impedir o crescimento de bactérias patogénicas específicas27,28. Devido a essa versatilidade e a capacidade de induzir efeitos biológicos, tecnologia EF continua a expandir-se através de uma variedade de campos para fornecer funcionalidade multi mecanicista. Ainda, apesar de sua utilidade em uma diversidade de aplicações, fibras de superfície modificada só recentemente foi exploradas no campo microbicida29.
Em paralelo com o desenvolvimento de novas tecnologias de entrega para prevenir e tratar as DSTs, desenvolveram-se novos terapêutica biológica. Um dos mais promissores candidatos microbicida é o adesiva lectina antiviral, GRFT30. Originalmente derivado de uma espécie de algas vermelhas, GRFT demonstrou atividade como um potente inibidor de HIV, HSV-2, SARS, assim como a hepatite C vírus31,32,33,34, 35 , 36. na verdade, entre inibidores biologicamente baseados, GRFT tem a mais potente atividade anti-HIV, inativando HIV-1 quase imediatamente em cima do contato30, mantendo estabilidade e atividade na presença de meios de cultura de vaginal micróbios para até 10 dias37. Mais recentemente, um gel GRFT 0,1% foi mostrado para proteger camundongos contra o desafio de HSV-2 intravaginal, tornando-se um candidato promissor para a primeira linha de proteção contra o HSV-2 e HIV-132, 38. para HIV especificamente, GRFT inibe infecção por fisicamente ligação gp120 ou terminal de resíduos de N-ligadas glicano manose em superfícies de envelope viral para impedir entrada38,39,40,41 ,,42. Esta inibição é altamente potente, com IC50s se aproximando a 3 ng/mL.43. Além de inibir a infecção pelo HIV, estudos também têm demonstrado que GRFT protege contra infecção por HSV-2, inibindo a propagação de célula para célula dos vírus32. Em todos os casos, GRFT tem demonstrado ser adesivo de partículas virais, enquanto demonstrando alta resistência à desnaturação. Por último, GRFT demonstrou atividade sinérgica com combinações de Tenofovir (TFV) e outros medicamentos antivirais44, tornando-o viável e provavelmente benéfico para administrar conjuntamente com o EFs. As potentes propriedades de GRFT torná-lo um excelente biologicamente baseados antiviral candidato, em que a entrega pode ser melhorada com tecnologia EF.
Utilizando esse conhecimento das propriedades antivirais adesivos e inatas de GRFT, um andaime de fibras poliméricas foi projetado, que integra essas propriedades para fornecer a primeira camada de entrada de vírus inibição29. Encontrando inspiração da forma que o muco cervicovaginal dificulta o transporte de vírus, principalmente através de interações de mucina mucoadhesive, formulamos a hipótese que usando EFs como um andaime e covalentemente, modificando a superfície com GRFT, uma elevada densidade de conjugados a superfície GRFT seria debilitar e inativar o vírus em seu entrypoint45,46,47. Aqui o EFs foram desenvolvidos como um andaime estacionário para fornecer uma base de proteína, viral adesivo-Inactive barreira plataforma. Nós procuramos combinar as propriedades antivirais potentes de GRFT com uma plataforma de polímero biocompatível, modificável e durável, para criar um novo vírus "armadilha".
Para atingir essas metas, fibras compostas de PLGA eram electrospun, e química de EDC-NHS foi usada para modificar posteriormente a superfície EF com GRFT. PLGA serviu como um polímero modelo devido ao uso extensivo em eletrofiação48, combinado com sua biocompatibilidade e custo-efetividade. Além disso, a modificação da superfície explora a grande área de superfície de EFs e fornece uma alternativa útil que pode ser combinada com encapsulamento para maximizar a utilidade de fibra49. Ao contrário dos métodos de encapsulamento tradicional onde somente uma parcela de GRFT está disponível (e apenas transitoriamente, presente no FRT), modificação da superfície pode permitir GRFT manter Bioatividade máxima durante toda a duração do tratamento. Além disso, a incorporação de compostos hidrofílicos como proteínas, pelos métodos tradicionais eletrofiação, pode resultar em menor eficiência de encapsulação e perda de proteína atividade50. Portanto, fibras de superfície-modificado GRFT podem oferecer um método promissor de entrega alternativo que pode ser usado sozinho ou em combinação com eletrofiação para aumentar a proteção contra a infecção de STI.

<table><tbody><tr><td>Poli(Lactide-co-Glycolide) (PLGA) 50:50</td><td>Lactel</td><td>B6013-2P</td><td></td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP)</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>147541000</tr><tr><td>Agulha de Dispensação Blunt 18g X 1/2</td><td>Seringa Brico Medical Supplies</td><td>BN1815</td><td></td></tr><tr><td>BD 3mL Ponta Luer-lok</td><td>Parafilme (</td>filme plástico) <td>309657 Sigma</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Aldrich</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-Morpholino)ácido etanossulfônico (Tampão MES)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3671&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Potássio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Hidroxisuccinimida (NHS)</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>24500</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC)</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Fisher</td><td>BP176</td><td></td></tr><tr><td>Griffithsin (GRFT)</td><td>Kentucky Bioprocessing</td><td>NA</td><td>feito sob medida, sem número de produto</td></tr><tr><td>Dimetil Sulfóxido</td><td>Milipore</td><td>317275</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenoglicol sorbitano monolaurato (Polissorbato, Tween 20)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris EDTA Buffer</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93283</td><td></td></tr> Placas de Fundo <tr><td>Plano Imuno Não Estéril de 96 Poços</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>3355</td><td></td></tr><tr><td>Influenza Hemagglutinina (HA)</td><td>Kentucky Bioprocessing</td><td>NA</td><td>feito sob medida, sem número de produto</td></tr><tr><td>Goat Anti-GRFT (Anticorpo Primário)</td><td>Kentucky Bioprocessing</td><td>NA</td><td>feito sob medida, sem número de produto</td></tr><tr><td>Coelho anti-cabra IgG-HRP (Anticorpo Secundário)</td><td>Santa Cruz</td><td>2056</td><td></td></tr><tr><td>Substrato de Peroxidase de Micropoço TMB Sure Blue</td><td>KPL</td><td>52-00-00</td><td></td></tr></tbody></table>

fabricação e caracterização de andaimes de fibra griffithsin-modificado para a prevenção de doenças sexualmente transmissíveis

Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections

Fibras de Electrospun (EFs) têm sido amplamente utilizadas em uma variedade de aplicações terapêuticas; no entanto, eles só recentemente foram aplicados como uma tecnologia para prevenir e tratar sexualmente transmissíveis (DSTs). Além disso, muitas tecnologias EF focar encapsulando o agente ativo, em relação ao utilizando a superfície para dar biofunctionality. Aqui nós descrevemos um método para fabricar e superfície-modificar poly(lactic-co-glycolic) ácido (PLGA) electrospun fibras, com a lectina antiviral potente Griffithsin (GRFT). PLGA é um polímero aprovado pela FDA que tem sido amplamente utilizado na administração de medicamentos, devido às suas excelentes propriedades químicas e biocompatíveis. GRFT é um natural, potente e segura lectina que possui ampla atividade contra numerosos vírus incluindo o vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1). Quando combinados, fibras GRFT-modificado demonstraram potente inativação do HIV-1 em vitro. Este manuscrito descreve os métodos para fabricar e caracterizar EFs GRFT-modificado. Primeiro, PLGA é electrospun para criar um andaime de fibra. As fibras são posteriormente modificado de superfície com GRFT usando 1-etil - 3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) e N-Hidroxisuccinimida (NHS) química. Microscopia eletrônica (SEM) foi usado para avaliar o tamanho e morfologia da superfície-modificado formulações. Além disso, um gp120 ou hemaglutinina (HA)-ELISA com base pode ser usado para quantificar a quantidade de GRFT conjugada com, bem como dessorção GRFT da superfície da fibra. Este protocolo pode ser aplicado mais amplamente para fabricar fibras que são modificados de superfície com uma variedade de proteínas diferentes.

Morfologia das fibras tem um efeito significativo sobre a capacidade da superfície-modificado EFs para fornecer proteção contra vírus. Embora eletrofiação é um procedimento simples e conveniente, formulações de polímero não-otimizados podem resultar na morfologia da fibra irregular (Figura 5B-C). Alterações em eletrofiação condições que resultam na formação de frisado ou amorfas morfologias semelhantes a esteira, muitas vezes são causados por...

Este manuscrito descreve o procedimento para fabricar e caracterizar as fibras de electrospun de Griffithsin-modificado poli (ácido lático-co-glicólico) que demonstram potente atividade antiviral e adesiva contra infecção por vírus da imunodeficiência humana tipo 1 em vitro. Métodos utilizados para sintetizar, modificar a superfície e caracterizar a morfologia resultante, conjugação, e dessorção de Griffithsin superfície-modificado com fibras são descritos.

Fabricação e caracterização de andaimes de fibra Griffithsin-modificado para a prevenção de doenças sexualmente transmissíveis

Electrospun fibers (EFs) have been widely used in a variety of therapeutic applications; however, they have only recently been applied as a technology to ...

O objetivo geral deste procedimento é fabricar e modificar a superfície de ácido polilático, ácido co-glicólico, fibras eletrofiadas, com quantidades variáveis da proteína antiviral Griffithsin. Esse método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da entrega de medicamentos, como formular e caracterizar novos veículos de entrega que podem prevenir infecções virais sexualmente transmissíveis, como o HIV-1. A principal vantagem da técnica é que a atividade antiviral da Griffithsin é maximizada usando fibras poliméricas-eletrofiadas como um andaime estacionário para Griffithsin altamente localizado na superfície da fibra.As implicações dessa técnica se estendem à terapia de outras infecções virais e bacterianas, devido ao potente potencial profilático e terapêutico de Griffithsin contra uma variedade de tipos de infecção. Embora esse método possa fornecer informações sobre a prevenção da infecção pelo HIV-1, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como outras infecções virais ou bacterianas nas quais Griffithsin demonstrou potência. Para iniciar este procedimento, pesar 720 miligramas de PLGA 50/50 em uma cintilação vil de 10 mililitros.Usando uma pipeta de vidro soro

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

O processo de eletrofiação polímeros para engenharia de tecidos e de cultura de células é abordada neste artigo. Especificamente, o electrospinning de macromers fotorreativas com capacidades de processamento adicional de photopatterning e multi-polímero eletrofiação é descrito.

Eletrofiação Andaimes Polymer fibrosos para Engenharia de Tecidos e Cultura de Células

Electrospun andaimes podem ser processados ​​de pós-produção para aplicações de engenharia de tecidos. Aqui descrevemos métodos para girar andaimes complexos (por fiação consecutivos), para fazer andaimes mais espessa (por camadas de multi-uso de calor ou vapor de recozimento), para atingir a esterilidade (produção asséptica ou pós-produção de esterilização) e adequadas para atingir as propriedades biomecânicas.

Processamento de pós-produção de Fibras electrospun para Engenharia de Tecidos

Apesar das propriedades mecânicas excelentes e bioquímicos da aranha sedas, este material não pode ser colhido em grandes quantidades por meios convencionais. Aqui nós descrevemos uma estratégia eficiente para produzir fibras de seda de aranha artificial, que é um processo importante para os investigadores que estudam a produção de seda de aranha e sua utilização como a próxima geração de biomateriais.

Produção de seda sintética Aranha em escala de laboratório

Biocompatíveis pH responsivos nanosensors sol-gel pode ser incorporado em poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) andaimes electrospun. Os andaimes de auto-relato produzidos podem ser utilizados para a monitorização in situ de condições micro-ambientais, enquanto a cultura de células sobre o andaime. Isto é benéfico porque a construção celular 3D pode ser monitorado em tempo real, sem perturbar o experimento.

Andaimes auto-relato para cultura de células 3-Dimensional

Este protocolo combina eletrofiação e microesferas para desenvolver andaimes de engenharia de tecidos para direcionar os neurônios. O fator de crescimento nervoso foi encapsulado em microesferas de PLGA e eletrofiado em arcabouços fibrosos de ácido hialurônico (HA).  A bioatividade da proteína foi testada semeando os scaffolds com gânglios primários da raiz dorsal do pintinho e cultivando por 4-6 dias.

Electrospinning Fator de Crescimento Releasing Microesferas em fibrosa Andaimes

Aqui, apresentamos um protocolo para fabricar andaimes electrospun nanofibras com organização gradated de fibras e explorar suas aplicações na regulação da morfologia celular / orientação. Gradientes no que diz respeito às propriedades físicas e químicas dos scaffolds nanofibras oferecer uma ampla variedade de aplicações na área biomédica.

Electrospun nanofibras Andaimes com gradações de Organização Fiber

Os andaimes para engenharia de tecidos precisam recapitular o complexo microambiente bioquímico e biofísico do nicho celular. Aqui, mostramos o uso de fibras de complexação de polieletrólitos interfaciais como uma plataforma para criar andaimes poliméricos compostos e multicomponentes com liberação bioquímica sustentada.

Andaimes de mistura de fibras Interfacial polieletrólito para lançamento Temporalmente controlada de biomoléculas

Um protocolo para a fiação microfluidic e caracterização da microestrutura do monofilamento da fibroína seda regenerada é apresentado.

Microfluidic seco-fiação e caracterização de fibras regeneradas da fibroína de seda

Aqui está um protocolo para a criação de andaimes de alginato macroporoso secos que medeiam a transferência eficiente de genes virais para uso em engenharia genética de células T, incluindo células T para terapia com células CAR-T. Os andaimes demonstraram transduzir células T primárias ativadas com transdução de &gt;85%.

Fabricação e Uso de Andaimes Secos de Alginato Macroporoso para Transdução Viral de Células T

As inserções de cultura de tecidos com membranas plásticas são o padrão ouro em laboratórios de cultura de células como suportes permeáveis para estabelecer camadas celulares e modelos de tecidos de barreira. Aqui, apresentamos um método simples para substituir a membrana plástica por uma membrana mais biologicamente relevante feita de uma proteína de seda de aranha funcionalizada recombinante.

Mímica de membrana basal nanofibrilar feita de seda de aranha funcionalizada recombinante em inserções de cultura de tecidos feitas sob medida

Aprenda a fabricar e modificar fibras eletrofiadas de PLGA com Griffithsin para atividade antiviral contra HIV-1. Este método maximiza a eficácia do agente antiviral em sistemas de liberação de fármacos.

Fabricação e caracterização de andaimes de fibra Griffithsin-modificado para a prevenção de doenças sexualmente transmissíveis

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