Métodos para analisar os impactos de urânio Natural em In Vitro Osteoclastogenesis

O objetivo geral deste procedimento é investigar os efeitos da exposição natural ao urânio na viabilidade, diferenciação e função dos osteoclastos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da toxicidade ambiental sobre o impacto da exposição ao urânio na fisiologia e metabolismo ósseo. A principal vantagem desta técnica é que ela fornece uma nova ferramenta interessante para a triagem de originadores de urânio.

Quando a cultura de células RAW 264.7 atingir 85 a 90% de confluência, use um raspador de células para levantar mecanicamente as células do fundo do frasco de cultura de células e transferir as células para um tubo cônico estéril de 50 mililitros. Pipetar a solução celular algumas vezes para quebrar os aglomerados e contar a suspensão unicelular resultante. Dilua as células para uma concentração de um vezes 10 a quatro células por mililitro em meio essencial mínimo modificado com alfa, suplementado com L-glutamina e 5% de soro bovino fetal e adicione um mililitro de células por poço a uma placa de cultura de células de 24 poços para uma incubação de seis horas a 37 graus Celsius.

Um parâmetro importante para a reprodutibilidade do ensaio de diferenciação e reabsorção de osteoclastos é a densidade de semeadura celular. Preste atenção especial à contagem de células, preparação da suspensão celular e sua homogeneidade antes de plaquear as células. Para preparar a solução salina para mictório, a partir de uma solução aquosa de bicarbonato de sódio a 7,5% testada para cultura de células estéreis, primeiro prepare e resfrie o bicarbonato 100 milimolar em água sobre gelo e adicione um volume de solução de acetato de mictório 100 milimolar, gota a gota, em nove volumes da solução de bicarbonato gelado com agitação suave.

Deixe a solução se equilibrar à temperatura ambiente. Após três horas, diluir o volume adequado de solução urinol, gota a gota, em meio de diferenciação contendo 50 nanogramas por mililitro de RANKL até atingir a concentração desejada de trabalho no mictório e permitir mais três horas de equilíbrio à temperatura ambiente. As longas etapas de incubação após cada diluição do sal mictório são essenciais para a estabilização dos complexos urinários nas soluções.

No final do segundo período de equilíbrio, substitua suavemente o meio em cada poço por um mililitro de mictório tratado ou meio de controle, conforme apropriado, e retorne as células à incubadora. Os osteoclastos multinucleados devem aparecer entre o terceiro e o quarto dias de cultura. Para avaliar o tamanho e a morfologia dos osteoclastos recém-diferenciados, corar as células com fosfatase ácida resistente ao tartarato, de acordo com as instruções do fabricante, e obter imagens de toda a superfície de cada poço com resolução suficiente para distinguir os núcleos celulares.

Quando todos os poços tiverem sido fotografados, abra uma imagem de um poço com o software ImageJ de código aberto e verifique as unidades de escala. Em seguida, marque a caixa Global na janela pop-up para aplicar as novas unidades de escala a todas as imagens posteriores. No menu Analisar, selecione Definir medidas e marque as caixas Área e Exibir rótulo.

Desmarque todas as outras caixas. No menu Analisar, abra Ferramentas e, em seguida, o Gerenciador de Região de Interesse e selecione a ferramenta de seleção retangular na janela principal do ImageJ. Contorne uma região de interesse de cerca de 1.000 por 1.000 micrômetros e clique no botão Adicionar para adicionar a seleção ao Gerenciador de Região de Interesse.

Em seguida, clique em Mais, Salvar para salvar a região. Para criar uma cópia de uma das cinco regiões a serem analisadas, selecione a região de interesse no Gerenciador de Região de Interesse e clique com o botão direito do mouse dentro da área selecionada para duplicar a região. Marque as caixas Mostrar tudo e Rótulos e selecione a ferramenta de seleção de polígono para delinear manualmente um dos osteoclastos na região duplicada de interesse.

Para adicionar essa estrutura de tópicos ao Gerenciador de Região de Interesse, clique em Adicionar na janela Gerenciador de Região de Interesse. Quando todos os osteoclastos tiverem sido adicionados, selecione todos os contornos e clique em Medir para medir suas superfícies. Em seguida, transfira as medidas que aparecem na janela de resultados para uma planilha.

Para avaliar a função dos osteoclastos tratados com mictório, um dia antes de adicionar o meio de diferenciação, coloque células RAW de uma cultura de células confluentes de 85 a 90% em uma placa de ensaio de osteo de 24 poços em meio de crescimento, como acabamos de demonstrar. No dia seguinte, substitua suavemente o sobrenadante por um mictório de diferenciação contendo meio e permita que as células RAW se diferenciem em osteoclastos, como acabamos de demonstrar. No quinto dia de osteoclastogênese, substitua o meio contendo mictório por solução de alvejante a 10% para remover as células da superfície mimética óssea.

Após cinco minutos em temperatura ambiente, lave os poços duas vezes com água deionizada e deixe-os secar ao ar. Em seguida, core os sais de cálcio nas áreas não reabsorvidas de cada poço com uma solução de sal de sódio 1% Alizarin Red S. Após 10 a 15 segundos, remova a solução de alizarina e lave suavemente os poços três a quatro vezes com água.

Para converter uma imagem RGB dos poços corados com alizarina em um formato de 8 bits em tons de cinza, no menu Imagem, selecione Tipo e 8 bits. Em seguida, usando a ferramenta de seleção oval, contorne toda a superfície do poço a ser analisado para reabsorção e salve a região de interesse, como acabamos de demonstrar. Para facilitar a seleção de limite, selecione Editar e Limpar fora para limpar todos os recursos fora da região de interesse definida.

Duplique a região de interesse como acabamos de demonstrar e selecione Ajustar limite no menu Imagem, ajustando a barra deslizante para selecionar um limite apropriado. Todas as áreas reabsorvidas devem estar acima do limite e aparecer em branco, enquanto todas as áreas não reabsorvidas devem estar abaixo do limite e aparecer em vermelho. Para finalizar a seleção de limite, clique em Aplicar na janela Limite e salve a imagem binária final no formato apropriado de interesse.

Para definir as medições a serem feitas na região de interesse, no menu Analisar, selecione Definir medidas e marque as caixas Área, Fração de área e Limite ao limite e desmarque todas as outras caixas. Em seguida, para obter a fração da área reabsorvida diretamente na janela de resultados, inverta a imagem binária duplicada selecionando Inverter no menu Editar e cuidando para que a região principal de interesse seja selecionada na imagem binária final e meça a fração da área reabsorvida. As mudanças no número e tamanho de osteoclastos recém-diferenciados em resposta ao urânio são facilmente visíveis em imagens compostas de poços inteiros, bem como em imagens ampliadas de regiões selecionadas de interesse.

O tamanho dos osteoclastos cultivados em diferentes condições de cultura pode ser analisado, como demonstrado, delineando todos os osteoclastos dentro de cada região e medindo a área de cada célula delineada. Para investigar o impacto do urânio na atividade de reabsorção dos osteoclastos, as células RAW 264.7 são plaqueadas e diferenciadas em placas de superfície osteomiméticas. No final do ensaio, os osteoclastos são removidos e as áreas não reabsorvidas são coradas e fotografadas conforme demonstrado.

As imagens são então convertidas em escala de cinza de 8 bits e limitadas para facilitar o cálculo das áreas reabsorvidas. Este procedimento também pode ser aplicado ao estudo do impacto de outros metais pesados na osteoclastogênese.