Marcação com Anexina V e Iodeto de Propídio

A rotulagem de células de iodeto de tônias (PI) é uma técnica usada para identificar a morte celular e distinguir entre seus diferentes caminhos: apoptose, ou morte celular programada, e necrose. As células sofrem alterações morfológicas distintas dependendo da via. Ao identificar as condições específicas que levam uma célula a se submeter a apoptose ou necrose, os cientistas ganham uma visão da fisiologia celular e da fisiopatologia da doença. A rotulagem anexa V e PI, seguida pela citometria de fluxo, foi estabelecida como um dos métodos mais eficientes para categorizar o tipo de morte celular.

Hoje, descreveremos como este ensaio ajuda na identificação de caminhos de morte celular, como executar essa técnica, e alguns experimentos de exemplo emocionantes que usam esse método para responder a questões importantes no campo da biologia celular.

Primeiro, vamos dar uma olhada nos princípios por trás da coloração de anexos V e PI.

Como mencionado anteriormente, as células apoptóticas exibem características morfológicas distintas. Estes incluem encolhimento celular, sangramento de membrana, fragmentação nuclear, e o aparecimento de corpos apoptóticos. Além disso, após a indução da apoptose — ou seja, no estágio apoptótico inicial — certas alterações características aparecem na membrana. Uma membrana celular normal tem todos os resíduos de fosfatidilaserina ou PS no folheto interno. No entanto, nas primeiras células apoptóticas, alguns desses resíduos de PS são translocados para a superfície externa — mas como?

Para entender isso, vamos dar um passo atrás. Durante a apoptose, é sabido que caspases citosócidas são ativadas. Essas enzimas, por sua vez, ativam uma enzima ligada à membrana chamada scramblase. Scramblase “embaralha” a membrana celular translocando resíduos de PS do lado citoplasmado para a superfície externa. Em contraste, durante a necrose os resíduos de PS permanecem onde estão, mas a própria membrana se rompe. A rotulagem anexa V e PI capitalizam essas diferenças nas alterações de membrana dos dois tipos de morte celular.

Annexin V conjugado com corante fluorescente, como isothiocyanato de fluoresceína — comumente conhecido como FITC — é uma membrana impermeável, ligante natural para PS, e, portanto, identifica facilmente células apoptóticas precoces ligando-se ao PS externalizado. No entanto, após a ruptura da membrana, que ocorre durante a necrose e também durante estágios posteriores da apoptose, a anexação também pode se ligar ao PS na face interna e produzir falsos positivos.

Para evitar isso, os cientistas usam PI. Esta molécula de corante de ligação de DNA é novamente impermeável da membrana, e só pode entrar em uma célula quando a membrana é rompida. Portanto, se uma célula está apenas anexada é apoptótica precoce, enquanto uma célula que é tanto PI quanto anexada manchada pode ser necrosa ou tardia apoptótica.

Agora que você aprendeu os princípios básicos por trás deste ensaio, vamos passar pelo procedimento de coloração e análise da morte celular.

Primeiro, as células são colhidas e centrifadas em baixa velocidade para evitar qualquer interrupção morfológica, e resuspensadas em tampão de lavagem fisiológica, como o soro fisiológico tamponado, também conhecido como PBS. Após outra etapa de centrifugação, as células são resuspentadas em tampão de ligação anexo V contendo cálcio, o que é necessário para anexar a ligação ao PS. O anexo V conjugado com FITC é então adicionado à solução, que é incubada à temperatura ambiente no escuro para permitir anexação e associação PS. No próximo passo, o PI é diretamente adicionado à solução de célula de coloração anexa e incubado no escuro. Após a incubação, as células são lavadas em PBS por centrifugação, resuspended em tampão de lavagem, e mantidos no gelo. Agora eles estão prontos para análise.

A atividade de fluorescência das células é analisada por citometria de fluxo, uma técnica baseada em laser que captura dados de fluorescência de células únicas suspensas em um fluxo de fluido. Após a calibração da fluorescência usando células separadamente manchadas com cada corante, são adquiridos dados de células manchadas duplas. Sinais de fluorescência da população celular são usados para criar um enredo onde a intensidade fitc ligada a anexos é traçada no eixo X logarítmico, e PI no eixo Y logarítmico. As células que são anexadas-FITC positivas e pi negativas agruparão-se no lado inferior direito da trama, representando as células apoptóticas precoces, e as células duplamente positivas para anexo-FITC e PI ocorrerão no canto superior direito, representando as células apoptóticas ou necróticas tardias. As células que permanecem sem manutenção ou insignificantemente manchadas tanto para a anexação quanto para pi são células vivas.

Já que você sabe por que os biólogos celulares confiam nessa técnica para estudar a morte celular, por que não revisamos algumas de suas aplicações.

Usando este procedimento, os cientistas podem seguir quais proteínas intracelulares estão envolvidas na apoptose. Neste vídeo, os pesquisadores analisaram o efeito da cisplatina, uma droga anticâncer, em células renais normais para ver se ela induz a apoptose. Um conjunto de células foi transduzido para superexpressar uma forma ativa da proteína enzimática quinase C, ou PKC, e o outro conjunto foi transduzido com uma forma não funcional – PKC negativo dominante. As células expressas PKC e tratadas com cisplatina foram submetidas à apoptose ao longo do tempo, mas as células que expressavam o PKC negativo inativo eram resistentes à apoptose, indicando que a enzima é um player chave na via de apoptose induzida por cisplatina.

Os pesquisadores também usam essas manchas para testar o potencial citotóxico de células T específicas. As células T citotóxicas podem reconhecer proteínas de membrana específicas em sua célula-alvo, e induzir sua morte ao se ligar a ela. Aqui, os pesquisadores incubaram células T específicas de antígeno com células tumorais-alvo e anexam V, e então observaram a indução da apoptose das células tumorais pelo engajamento celular T. Os dados de citometria de fluxo revelaram a porcentagem de morte celular alvo na presença e ausência de células T citotóxica.

Por fim, os cientistas usam esse método para avaliar a viabilidade celular após a entrega de genes. Neste caso, os pesquisadores queriam avaliar a sobrevivência celular após a nucleofecção — um método que usa uma combinação de produtos químicos e um campo elétrico aplicado para criar poros transitórios em membranas celulares e nucleares, facilitando assim a entrega de genes. Usando anexo V mais um corante chamado 7-aminoactinomicina D ou 7-AAD, que, semelhante ao PI se liga ao DNA, eles mostraram que a nucleofecção causou baixa morte celular por apoptose ou necrose.

Você acabou de assistir o vídeo do JoVE na rotulagem anexa em V e PI. Neste vídeo, discutimos brevemente as características distintivas das células apoptóticas e necróticas, revisamos os princípios por trás desse método, assistimos a um procedimento generalizado para essa técnica comumente usada e visualizamos algumas aplicações. Dada a importância de entender como diferentes células morrem em diferentes condições, a rotulagem em V e PI serve como uma ferramenta importante para biólogos celulares interessados nesse fenômeno. Como sempre, obrigado por assistir!