Um ensaio automatizado rápida iterativo Geotaxis negativo para analisar o comportamento de adultos de escalada em um modelo de drosófila de neurodegeneração
12 de setembro de 2017
Este passo a passo protocolo analisa o comportamento de geotaxis negativo de drosófila usando um sistema automatizado de vários cilindro que hospeda centenas de moscas e sincroniza a sua acção por um motor elétrico. Após a sincronização, comportamento de voar geotaxis negativo é analisado, digitalmente gravada e analisados utilizando o software RflyDetection auto-concebidos.
O objetivo geral deste ensaio automatizado de geotaxia negativa rápida e iterativa é analisar os déficits de escalada de adultos de Drosophila associados à neurodegeneração. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência, como o mecanismo dos déficits locomotivos associados à neurodegeneração. A principal vantagem desta técnica é que a atividade de escalada das moscas pode ser analisada de forma automatizada e profissional com alto grau de precisão.
As implicações desta técnica se estendem para a terapia e diagnóstico da neurodegeneração, porque as doenças neurodegenerativas estão frequentemente associadas a uma perda progressiva da capacidade de movimento e vida útil reduzida, e neurodegeneração dependente da idade. Nós primeiro tivemos a ideia para este método. Queríamos medir a atividade locomotora dos adultos de Drosophila de uma forma mais precisa.
Para realizar a coleta das moscas, comece mantendo-as em alimentação padrão para moscas a 25 graus Celsius, 70% de umidade e ciclo de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão. Colete as virgens UAS-Dicer2 DDC-GAL4 sob anestesia com dióxido de carbono. Cruze as virgens com machos adultos de dois dias de idade, portadores dos seguintes genótipos, com uma proporção macho/fêmea de um para dois.
Colete separadamente machos e fêmeas recém-ecloídos em três frascos para cada grupo por experimento, colocando 10 moscas em cada frasco padrão com alimentação padrão. Em seguida, ajuste os frascos a 25 graus Celsius. Para realizar o ensaio RING automatizado, transfira 10 moscas unissex por genótipo para cada frasco.
Então, prenda o frasco com um parafuso. Analise as moscas controle e as moscas portadoras de diferentes genótipos juntas para cada conjunto de experimentos. Ligue a câmera digital colocada na frente do aparato e, uma vez que as moscas estejam carregadas e prontas, comece a gravar.
A câmera deve ser colocada horizontalmente e a câmera a uma distância adequada do aparato RING para capturar as posições em localizações relativamente precisas de todas as moscas. Após permitir um minuto para que as moscas se acomodem nos frascos, ligue o controlador de etapas que controla o driver de etapas. Isso impulsiona o pequeno motor elétrico para controlar a alavanca anexada, de forma que ela consiga subir e bater no aparato consecutivamente quatro vezes em dois segundos.
Após bater no aparato, observe que as moscas começam a subir pela parede. Com a gravação ainda ligada, repita a sincronização como acabamos de demonstrar, em intervalos de 60 segundos por três a cinco tentativas consecutivas. Repita o experimento para moscas de cinco, 15, 25 e 35 dias de idade.
Realize pelo menos três experimentos independentes para cada grupo para cada experimento, com pelo menos 30 moscas coletadas ou três frascos. Para analisar os dados, importe o vídeo gravado para o computador. Para cada tentativa, tire uma foto do vídeo seis segundos após a batida.
No software de detecção de moscas R, use o menu de arquivo para importar a imagem da foto. Em seguida, usando o ícone da linha de base na Barra de Ferramentas, defina precisamente as linhas de base superior e inferior do frasco e, em seguida, use o cursor para marcar as linhas de base superior e inferior na imagem. Na barra de Configurações, no campo Moscas no Retângulo, insira o número de moscas por frasco e, no campo Altura do Tubo, insira o comprimento do frasco.
As posições individuais das moscas são detectadas e marcadas com pontos na tela para cada frasco. Observe que em uma tabela no painel direito, o software determina automaticamente a distância de subida para cada mosca e exibe os valores médios de 10 moscas em cada frasco. Apresente os dados como média mais ou menos ESE.
Calcule os valores P de significância usando uma ANOVA de uma via com um teste de comparação múltipla de Bonferroni. A análise de moscas designadas Dicer2 usando o ensaio RING automatizado apresentado neste vídeo mostrou uma diminuição dependente da idade na distância de subida em um período de seis segundos para moscas macho e fêmea, sugerindo que a expressão aux em neurônios dopaminérgicos ou DA é crucial para a atividade locomotora das moscas. A capacidade de subir não parece ser afetada pela superexpressão de auxGFP em neurônios DA e co-expressão de auxR e auxGFP em neurônios DA resgatados do fenótipo RNAi.
Uma vez dominado, isso pode ser feito em duas a três horas se for realizado adequadamente. Ter esse desenvolvimento é agora uma maneira para pesquisadores no campo da neurociência explorarem a neurodegeneração em Drosophila melanogaster. Não se esqueça de que trabalhar com o aparato elétrico RING pode ser extremamente perigoso e cada confirmação deve ser firmemente presa e cuidadosamente verificada antes de realizar este procedimento.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este protocolo descreve um método automatizado para analisar o comportamento de geotaxia negativa em Drosophila, com foco em déficits de escalada em adultos associados à neurodegeneração. A técnica utiliza um sistema de múltiplos cilindros para sincronizar e registrar os movimentos das moscas, fornecendo informações sobre déficits locomotores.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Análise Comportamental
- Neurodegeneração
Contexto
- Drosophila atua como organismo modelo para o estudo de doenças neurodegenerativas.
- O comportamento de geotaxia negativa é uma medida da capacidade locomotora em moscas.
- A neurodegeneração frequentemente leva à perda progressiva de movimento e à redução da longevidade.
- Sistemas automatizados aumentam a precisão dos ensaios comportamentais.
Objetivo do Estudo
- Analisar déficits de escalada em Drosophila associados à neurodegeneração.
- Explorar os mecanismos subjacentes aos déficits locomotores.
- Melhorar a precisão da medição da atividade locomotora de moscas.
Métodos Utilizados
- Sistema automatizado com múltiplos cilindros para movimento sincronizado de moscas.
- Gravação digital do comportamento de geotaxia negativa.
- Análise utilizando o software de autoria própria RflyDetection.
- Ensaio rápido e iterativo para coleta de dados em alto rendimento.
Resultados Principais
- Sincronização bem-sucedida dos movimentos das moscas para análise precisa.
- Identificação de déficits na escalada associados à neurodegeneração.
- A análise automatizada demonstrou ser eficiente e confiável.
- Implicações potenciais para terapia e diagnóstico de doenças neurodegenerativas.
Conclusões
- O ensaio automatizado fornece um método robusto para estudar o comportamento locomotor em Drosophila.
- Os conhecimentos obtidos podem orientar abordagens terapêuticas para neurodegeneração.
- Esta técnica aprimora a compreensão da relação entre movimento e condições neurodegenerativas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este ensaio automatizado de alto rendimento permite a quantificação rápida de déficits locomotores em modelos de neurodegeneração de Drosophila, apoiando a validação precoce de alvos ao fornecer leituras comportamentais objetivas e reprodutíveis. O método aumenta a confiança preditiva na triagem pré-clínica ao permitir a análise simultânea de centenas de moscas entre múltiplos genótipos e grupos etários, facilitando a avaliação eficiente de compostos ou modificadores genéticos. Sua integração em fluxos de trabalho de descoberta auxilia na redução de riscos mecanicistas de alvos neurodegenerativos por meio de fenotipagem padronizada e escalável.
Aplicações Estratégicas em P&D Biofarmacêutico
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a quantificação de déficits de escalada dependentes da idade, associados à neurodegeneração em modelos genéticos.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos por meio da medição em alto rendimento da atividade locomotora como um indicador da integridade neuronal.
- Valor Preditivo: Gera dados comportamentais quantitativos que auxiliam no triagem de portfólios ao identificar genótipos com comprometimento motor significativo.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Produz métricas padronizadas e reprodutíveis de geotaxia negativa adequadas para validação de ensaios em campanhas de triagem voltadas para neurodegeneração.
- Valor Operacional: Permite a triagem rápida de modificadores genéticos ou farmacológicos por meio de captura automatizada de vídeo e análise pelo software RflyDetection.
- Escalabilidade: Processa dados de centenas de moscas por execução, aumentando a produtividade e reduzindo a variabilidade em comparação com ensaios manuais.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância Translacional: Fornece um sistema relevante à doença para avaliar fenótipos locomotores que refletem déficits motores clínicos em distúrbios neurodegenerativos.
- Continuidade Pré-clínica: Permite avaliação longitudinal ao longo das idades das moscas (5, 15, 25, 35 dias) para modelar a neurodegeneração progressiva.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Possibilita a avaliação de experimentos de resgate genético (por exemplo, coexpressão de auxR/auxGFP) para validar a especificidade do alvo e o envolvimento da via.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio insere-se no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos líderes, oferecendo um desfecho comportamental quantitativo que conecta a manipulação genética ao resultado fenotípico em modelos de neurodegeneração.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao associar a expressão gênica (por exemplo, aux em neurônios dopaminérgicos) à função locomotora por meio de medidas iterativas de geotaxia negativa.
- Triagem: Fornece saídas padronizadas e prontas para ensaio (distância de escalada em 6 segundos) que permitem comparações confiáveis entre diferentes condições experimentais.
- Análise: Gera dados de média ± erro padrão da média (SEM) com rigor estatístico (ANOVA de um fator, correção de Bonferroni) para apoiar comparações entre grupos e testes de significância.
- Pesquisa Translacional: Relaciona respostas comportamentais aos mecanismos neurodegenerativos, permitindo avaliação fenotípica alinhada a biomarcadores em modelos pré-clínicos.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para triagem comportamental longitudinal em múltiplos genótipos, idades e grupos de tratamento.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista por meio de fenotipagem comportamental quantificável e de alta resolução.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e a padronização por meio da sincronização automatizada, gravação digital e análise baseada em software.
- Valor Estratégico: Aprimora a eficiência das decisões de prosseguir ou interromper ao permitir a avaliação rápida de déficits locomotores em grandes tamanhos de amostra.
- Impacto no Portfólio: Facilita a priorização ajustada ao risco de alvos com base em dados robustos de progressão fenotípica dependente da idade.
Considerações de Implementação
- Requer experiência no manejo de Drosophila, manutenção de cruzamentos genéticos e montagem de ensaios comportamentais.
- Depende de instrumentação especializada, incluindo o aparelho RING automatizado, controlador de passos, câmera digital e iluminação compatível.
- Necessita de infraestrutura computacional para importação de vídeos, extração de instantâneos e operação do software RflyDetection.
- Envolve a padronização das condições ambientais (25°C, 70% de umidade, ciclo de 12h claro/escuro) e dos protocolos de preparação de frascos.
- Inclui considerações de segurança devido aos componentes elétricos; o aparelho deve ser fixado e verificado antes da operação.
