Name: Geração dos anticorpos monoclonais humanos discriminativa de rara B antígeno-específicas células circulantes no sangue (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 14 s
Description: Aprenda a gerar anticorpos monoclonais humanos a partir de linfócitos B circulantes no sangue. Este método permite discriminar antígenos altamente relacionados para aplicações em imunoterapia.

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Agradecemos a facilidade de citometria "CytoCell" (SFR Santé, Biogenouest, Nantes) por assistência técnica especializada. Agradecemos também toda a equipe de produção de proteína recombinante (P2R) e de plataformas de impacto (1232 INSERM, SFR Santé, Biogenouest, Nantes) pelo apoio técnico. Agradecemos-Emmanuel Scotet e Richard Breathnach comentários construtivos sobre o manuscrito. Este trabalho foi apoiado financeiramente pelo projecto IHU-Cesti, financiado pelo programa de governo francês «Investissements d'Avenir», gerido pelo francês nacional investigação agência (ANR) (ANR-10-IBHU-005). O projeto IHU-Cesti também é suportado pelo Nantes Métropole e Région Pays de la Loire. Este trabalho foi realizado no contexto do LabEX IGO programa apoiado pela Agência de investigação nacional, através do investimento do futuro programa ANR-11-LABX-0016-01.

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O protocolo proposto é um método poderoso para a geração de mAbs humano diretamente de células B Ag específicos circulantes no sangue. Ele combina três aspectos importantes: (i) a utilização de um enriquecimento magnético tetrâmero-associados, que permite um isolamento ex vivo de mesmo raras células B Ag-ligação; (ii) uma estratégia associada que usa três tetrâmeros de Ag (dois entes relevantes e um irrelevante) rotulados com três diferentes fluorochromes para isolar, por citometria de fluxo, apenas as células B...

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The Affiliations section was corrected from:
Marie-Claire Devilder1,2,&#160;M&#233;linda Moyon1,2,&#160;Xavier Saulquin1, Laetitia Gautreau-Rolland1 
1Centre R&#233;gional de Recherche en Canc&#233;rologie et Immunologie Nantes/Angers, INSERM 1232, LabEx IGO, Universit&#233; de Nantes 
2CHU Nantes
to:
Marie-Claire Devilder1,2,3,&#160;M&#233;linda Moyon1,2,3,&#160;Xavier Saulquin1,2, Laetitia Gautreau-Rolland1,2&#160; 
1CRCINA, Inserm, CNRS, Universit&#233; d&#39;Angers, Universit&#233; de Nantes 
2LabEx IGO, &#34;Immunotherapy, Graft, Oncology&#34; 
3CHU, Nantes, France

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Erratum: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

O método descrito aqui permite a produção rápida e versátil de totalmente humanas-anticorpos monoclonais (mAbs) contra um antígeno desejado (Ag). Celia é ferramentas essenciais em muitas aplicações de investigação fundamental em vitro e em vivo: fluxo cytometry, histologia, mancha ocidental, bloqueio e experimentos, por exemplo. Além disso, mAbs estão sendo usados cada vez mais na medicina para tratar doenças auto-imunes, câncer e controle de rejeição de transplante1. Por exemplo, mAbs anti-CTLA-4 e anti-PD-1 (ou anti-PD-L1) foram recentemente usados como inibidores de ponto de verificação imune em tratamentos de câncer2.
Os primeiros mAbs foram produzidos por imunoglobulinas (Ig)-secretoras de hibridomas obtidos a partir das células no baço de ratos imunizados ou ratos. No entanto, a forte resposta imune contra murino ou rato mAbs dificulta seu uso terapêutico em humanos, devido a sua rápida liberação e a provável indução de reações de hipersensibilidade3. Para resolver este problema, sequências de proteína animal de mAbs foram parcialmente substituídas por dos humanos para gerar anticorpos chamados de rato-humano ou humanizados quiméricoes. No entanto, esta estratégia apenas parcialmente diminui imunogenicidade, aumentando substancialmente tanto o custo e o tempo-escala de produção. Uma solução melhor é gerar mAbs humano diretamente de células humanas de B e várias estratégias para isso estão disponíveis. Um deles é o uso do fago ou fermento de exibição. Isto envolve exibindo domínios variáveis de uma biblioteca combinatorial de Ig humana aleatória pesado e luz encadeia no fago ou leveduras e realização de uma etapa de seleção usando o antígeno específico de interesse. Uma grande desvantagem dessa estratégia é que correntes pesadas e claras são aleatoriamente associadas, levando a um aumento muito grande na diversidade de anticorpos gerados. Anticorpos obtidos são improváveis corresponder a aqueles que surgem de uma resposta imune natural contra um particular Ag. Além disso, dobradura de proteína humana e modificações borne-translational não são sistematicamente reproduzidas em procariontes ou mesmo em leveduras. Um segundo método de produção humana mAb é o immortalization de células B humanas naturais, pela infecção do vírus Epstein - Barr ou expressão dos fatores anti apoptótica BCL-6 e BCL-XL4. No entanto, este método é aplicável apenas às células de memória B e ineficiente, que exige triagem de numerosos mAb imortalizado B células que produzem a identificar os clones mAb poucos (se houver) com a especificidade antigênica desejada. O método é, portanto, caro e demorado.
Recentemente foi descrito um novo protocolo para produção de mAbs humano isolado único B células5. Baseia-se em um otimizado monocelulares reverter transcrição-cadeia da polimerase (RT-PCR) para amplificação de ambos os pesados e luz-cadeia codificação segmentos a partir de uma única célula B classificada. Isto é seguido pela clonagem e expressão desses segmentos em um sistema de expressão eucarióticos, permitindo assim a reconstrução de um mAb plenamente humano. Este protocolo tem sido usado com sucesso a partir de células B de doadores vacinados. As células foram colhidas várias semanas após a vacinação para obter frequências mais altas de células B dirigidas contra o Ag desejado e, portanto, limitar o tempo necessário para a seleção de6. Também foram produzidos outros mAbs plenamente humanos de infectados pelo HIV+ (vírus de imunodeficiência humana) pacientes7 e melanoma pacientes8. Apesar destes avanços, ainda não há nenhum procedimento disponível que permite o isolamento de células B Ag específico independentes de seu fenótipo de memória ou frequência.
O procedimento descrito aqui leva a isolamento eficiente ex vivo de células humanas de B circulantes, com base na sua especificidade BCR, seguida pela produção de plenamente humano mAbs antígeno-específicas em alto rendimento e com um tempo de rastreio de baixo. O método não está restrita a células B de memória ou pilhas de B de desegregação induzidas após uma resposta imune, mas também pode ser aplicado ao repertório B célula humana ingênua. Que funciona mesmo a partir de células B Ag específicos presentes em muito baixas frequências é uma boa indicação de sua eficiência. O princípio do método é como segue: células mononucleares de sangue periférico (PBMC) estão manchadas com dois tetrâmeros apresentando o antígeno de interesse, cada um marcado com um fluorocromo diferente (por exemplo, ficoeritrina (PE) e Allophycocyanin (APC)), e um terceiro tetrâmero apresentando um antígeno estreitamente relacionado conjugados com um fluorocromo terceiro (por exemplo, Brillant violeta 421 (BV421)). Para enriquecer para ligação de antígeno de células, as células então são incubadas com pérolas revestidas com anti-PE e Abs anti-APC e classificada em colunas de separação de células. A fração de célula APC PE+ + é selecionada, manchadas com uma variedade de mAbs específicos para diferentes tipos de células PBMC permitir a identificação de células B e sujeito a classificação de célula de citometria de fluxo. Células B, que são PE+ e APC+, mas violeta brilhante-, são isoladas. Esta etapa Counter-seleciona as células que não são células B ou que não se ligam ao antígeno tetramerized, mas vincular a PE ou APC (estas células serão PE+ APC– ou PE– APC+) ou a parte não-antígeno dos tetrâmeros usado (estas as células serão BV421+). Células B não altamente específicas para o epítopo de interesse também são Counter-Selecionadodas para esta etapa (estas células também será BV421+). Assim, este método pode purificar altamente específicas B celulas que expressam receptores de células B (BCRs) capazes de discriminar entre dois antígenos muito aparentados. Única células B específicas são colhidas em tubos e suas PCR amplificados Ig cDNAs (os ácidos desoxirribonucleico complementares) clonado e expressa por uma linhagem de células humanas como secretada mAbs IgG.
Como uma prova de conceito, este estudo descreve a geração eficiente de mAbs humana, que reconhecem um peptídeo apresentado por uma classe de complexo principal de histocompatibilidade I (MHC-eu) molécula e podem discriminar entre este peptídeo e outros peptídeos carregados na mesma MHC-eu alelo. Embora o nível de complexidade deste Ag é importante, esse método permite que (i) recuperação de alto rendimento de mAbs Ag-específicos; (ii) produção de mAbs capaz de discriminar entre dois estruturalmente fechar Ags. Esta abordagem pode ser estendida para pacientes infectados ou vacinados sem qualquer modificação do protocolo e também já foi implementada com sucesso em um rato humanizado sistema9. Assim, este estudo descreve uma abordagem versátil e eficiente para gerar mAbs totalmente humana que pode ser usado em pesquisa básica e imunoterapia.

<table><tbody><tr><td>Linha celular HEK 293A</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>R70507</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Gibco by life technologies</td><td>21969-035</td><td>(+) 4,5g/L D-Glucose 0,11g/L Sodium Pyruvate (-) L-Glutmine</td></tr><tr><td>RPMI medium1640 (1X)</td><td>Gibco by life technologies</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td><td>PAA</td><td>K45-001</td><td></td></tr><tr><td>Nutridoma-SP</td><td>Roche</td><td>11011375001</td><td>100X Conc</td></tr><tr><td>PBS-Fosfato Tampolado Salino (10X) pH 7,4</td><td>Ambion</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) 0,5M pH=8</td><td>Invitrogen by Life Technologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>Dominique Dutscher</td><td>S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll - separação de linfócitos médio</td><td>EuroBio</td><td>CMSMSL01-01</td><td>densidade 1,0777+/-0,001</td></tr><tr><td>estreptavidina R-ficoeritrina conjugado</td><td>Invitrogen da Life Technologies</td><td>S21388</td><td>premiun grau 1mg/ml contém 5mM azida sódica</td></tr><tr><td>Estreptavidina, conjugado aloficocianina</td><td>Invitrogen by thermoFisher scientific</td><td>S32362</td><td>1mg/ml 2mM azida grau premium Violeta</td></tr><tr><td>brilhante 421 estreptavidina</td><td>Biolegend</td><td>405225</td><td>conc : 0,5mg/ml</td></tr><tr><td>MicroBeads magnéticos conjugados Anti-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-801</td><td></td></tr><tr><td>MicroBeads magnéticos conjugados Anti-APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-855</td><td></td></tr><tr><td>MidiMACs ou QuadroMACS separotor</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302/130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>LS Colunas</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>CD3 BV510 BD horizon</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>563109</td><td>Diluição usada 1:20</td></tr><tr><td>CD19 FITC</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>345788</td><td>Diluição usada 1:20</td></tr><tr><td>CD14 PerCPCy5.5</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>561116</td><td>Diluição usada 1:50</td></tr><tr><td>CD16 PerCPCy5.5</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>338440</td><td>Diluição usada 1:50</td></tr><tr><td>7AAD</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>51-68981E (559925)</td><td>Diluição usada 1:1000</td></tr><tr><td>FACS ARIA III Classificador de células Citômetro</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de PCR de 8 tiras</td><td>Axygen</td><td>321-10-061</td><td></td></tr><tr><td>Racks para 96 microtubos</td><td>Dominique Dutscher</td><td>45476</td><td></td></tr><tr><td>RNAseOUT Inibidor de ribonuclease (recombinante)</td> <td>Invitrogen por thermoFisher scientific</td><td>10777-019</td><td>qtd:5000U (40U/ul)</td></tr><tr><td>Água Destilada Dnase/Rnase Free</td><td>Gibco</td><td>10977-035</td><td></td></tr><tr><td>Oligod(T)18 mRNA Primer</td><td>New England BioLabs</td><td>S1316S</td><td>5.0 A260unit</td></tr><tr><td>Hexâmeros aleatórios</td><td>Invitrogen por thermoFisher scientific</td><td>N8080127</td><td>quantidade: 50uM, 5nmoles</td></tr><tr><td>Superscript III Transcriptase reversa</td><td>Invitrogen por thermoFisher scientific</td><td>18080-044</td><td>qtd: 10000U (200U/ul)</td></tr> <tr><td>GoTaq G2 Flexi DNA polimerase</td><td>Promega</td><td>M7805</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Set, grau de biologia molecular</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0182</td><td>4*100umol</td></tr><tr><td>5LVH1</td><td>Eurofins</td><td>ACAGGTGCCCACT CCCAGGTGCAG</td><td>Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers externos - Forward Prmers</td></tr><tr><td>5LVH3</td><td>Eurofins</td><td>AAGGTGTCCAGTG TGARGTGCAG</td><td>Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers externos - Forward Prmers</td></tr><tr><td>5LVL4_6</td><td>Eurofins</td><td>CCCAGATGGGTCC TGTCCCAGGTGCAG</td><td>Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers externos - Forward Prmers</td></tr><tr><td>5LVH5</td><td>Eurofins</td><td>CAAGGAGTCTGTT CCGAGGTGCAG</td><td>Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers externos - Forward Prmers</td></tr><tr><td>3HuIgG_const_anti</td><td>Eurofins</td><td>TCTTGTCCACCTT GGTGTTGCT</td><td>Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers externos -Primers reversos para Ig humana - Triagem de PCR de bactérias</td></tr><tr><td>3CuCH1</td><td>Eurofins</td><td>GGGAATTCTCACA GGAGACGA</td><td>Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers externos - Primers reversos para Ig humana</td></tr><tr><td>5AgeIVH1_5_7</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC GAGGTGCAGCTGGTGCAG</td><td>Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers internos -Primers diretos</td></tr><tr><td>5AgeIVH3</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGGTGGAG</td><td>Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers internos -Primers diretos</td></tr><tr><td>5AgeIVH3_23</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGTTGGAG</td><td>Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers internos -Primers diretos</td></tr><tr><td>5AgeIVH4</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTGCAGGAG</td><td>Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers internos - Primers diretos</td></tr><tr><td>5AgeIVH4_34</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTACAGCAGTG</td><td>Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers internos - Primers diretos</td></tr><tr><td>5AgeIVH1_18</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTTCAGCTGGTGCAG</td><td>Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers internos -Primers diretos</td></tr><tr><td>5AgeIVH1_24</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTCCAGCTGGTACAG</td><td>Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers internos -Primers diretos</td></tr><tr><td>5AgeIVH3__9_30_33</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCT GAAGTGCAGCTGGTGGAG</td><td>Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers internos -Primers diretos</td></tr><tr><td>5AgeIVH6_1</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTACAGCTGCAGCAG</td><td>Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers internos -Primers diretos</td></tr><tr><td>3SalIJH1_2_4_5</td><td>Eurofins</td><td>TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCAG</td><td>Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers internos -Primers reversos</td></tr><tr><td>3SalIJH3</td><td>Eurofins</td><td>TGCGAAGTCGACG CTGAAGAGACGGTGACCATTG</td><td>Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers internos -Primers reversos</td></tr><tr><td>3SalIJH6</td><td>Eurofins</td><td>TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCGTG</td><td>Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers internos -Primers reversos</td></tr><tr><td>5' LVk1_2</td><td>Eurofins</td><td>ATGAGGSTCCCYG CTCAGCTGCTGG</td><td>Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers externos -Primers diretos</td></tr><tr><td>5'LVk3</td><td>Eurofins</td><td>CTCTTCCTCCTGC TACTCTGGCTCCCAG</td><td>Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers externos -Primers diretos</td></tr><tr><td>5'LVk4</td><td>Eurofins</td><td>ATTTCTCTGTTGC TCTGGATCTCTG</td><td>Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers externos -Primers diretos</td></tr><tr><td>3'Ck543_566</td><td>Eurofins</td><td>GTTTCTCGTAGTC TGCTTTGCTCA</td><td>Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers externos -Primers reversos- Triagem de PCR de bactérias</td></tr><tr><td>5'AgeIVk1</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCT GACATCCAGATGACCCAGTC</td><td>Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers internos -Primers avançados</td></tr><tr><td>5'AgeIVk1_9_1&ndash; 13</td><td>Eurofins</td><td>TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT</td><td>Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers internos -Primers diretos</td></tr><tr><td>5'AgeIVk1D_43_1_8</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTGT GCCATCCGGATGACCCAGTC</td><td>Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers internos -Primers diretos</td></tr><tr><td>5'AgeIVk2</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACCCAGAC</td><td>Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers internos -Primers diretos</td></tr><tr><td>5'AgeIVk2_28_2_30</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACTCAGTC</td><td>Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers internos -Primers diretos</td></tr><tr><td>5'AgeVk3_11_3D_11</td><td>Eurofins</td><td>TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC</td><td>Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers internos -Primers diretos</td></tr><tr><td>5'AgeVk3_15_3D_15</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCA GAAATAGTGATGACGCAGTC</td><td>Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers internos -Primers diretos</td></tr><tr><td>5'AgeVk3_20_3D_20</td><td>Eurofins</td><td>TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT</td><td>Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers internos -Primers diretos</td></tr><tr><td>5'AgeVk4_1</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCG GACATCGTGATGACCCAGTC</td><td>Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers internos -Primers diretos</td></tr><tr><td>3'BsiWIJk1_2_4</td><td>Eurofins</td><td>GCCACCGTACGTT TGATYTCCACCTTGGTC</td><td>Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers internos -Primers diretos</td></tr><tr><td>3'BsiWIJk3</td><td>Eurofins</td><td>GCCACCGTACGTT TGATATCCACTTTGGTC</td><td>Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers internos -Primers diretos</td></tr><tr><td>3'BsiWIJk5</td><td>Eurofins</td><td>GCCACCGTACGTT TAATCTCCAGTCGTGTC</td><td>Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers internos -Primers diretos</td></tr><tr><td>5'LVl1</td><td>Eurofins</td><td>GGTCCTGGGCCCA GTCTGTGCTG</td><td>Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves &lambda; - Primers externos -Primers diretos</td></tr><tr><td>5'LVl2</td><td>Eurofins</td><td>GGTCCTGGGCCCA GTCTGCCCTG</td><td>Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves &lambda; - Primers externos -Primers diretos</td></tr><tr><td>5'LVl3</td><td>Eurofins</td><td>GCTCTGTGACCTC CTATGAGCTG</td><td>Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves &lambda; - Primers externos -Forward primers</td></tr><tr><td>5'LVl4_5</td><td>Eurofins</td><td>GGTCTCTCTCSCA GCYTGTGCTG</td><td>Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves &lambda; - Primers externos -Primers diretos</td></tr><tr><td>5'LVl6</td><td>Eurofins</td><td>GTTCTTGGGCCAA TTTTATGCTG</td><td>Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves &lambda; - Primers externos -Primers diretos</td></tr><tr><td>5'LVl7</td><td>Eurofins</td><td>GGTCCAATTCYCA GGCTGTGGTG</td><td>Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves &lambda; - Primers externos -Primers diretos</td></tr><tr><td>5LVl8</td><td>Eurofins</td><td>GAGTGGATTCTCA GACTGTGGTG</td><td>Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves &lambda; - Primers externos -Primers diretos</td></tr><tr><td>3'Cl</td><td>Eurofins</td><td>CACCAGTGTGGCC TTGTTGGCTTG</td><td>Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves &lambda; - Primers externos -Forward primers</td></tr><tr><td>5'AgeIVl1</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGTGCTGACKCAG</td><td>Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves &lambda; - Primers internos -primers diretos</td></tr><tr><td>5'AgeIVl2</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGCCCTGACTCAG</td><td>Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves &lambda; - Primers internos -primers diretos</td></tr><tr><td>5'AgeIVl3</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCTGTGACC TCCTATGAGCTGACWCAG</td><td>Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves &lambda; - Primers internos -primers diretos</td></tr><tr><td>5'AgeIVl4_5</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCTCTCTCS CAGCYTGTGCTGACTCA</td><td>Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves &lambda; - Primers internos -primers diretos</td></tr><tr><td>5'AgeIVl6</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCTTGGGCC AATTTTATGCTGACTCAG</td><td>Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves &lambda; - Primers internos -primers diretos</td></tr><tr><td>5'AgeIVl8</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCCAATTCY CAGRCTGTGGTGACYCAG</td><td>Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves &lambda; - Primers internos -primers diretos</td></tr><tr><td>3'XhoICl</td><td>Eurofins</td><td>CTCCTCACTCGAG GGYGGGAACAGAGTG</td><td>Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves &lambda; - Primers internos -Primers reversos - Triagem de PCR de bactérias</td></tr><tr><td>Ab-vec-sense</td><td>Eurofins</td><td>GCTTCGTTAGAAC GCGGCTAC</td><td>Triagem de PCR de bactérias</td></tr><tr><td>QA Agarose-TM, Biologia Molecular Grau</td><td>MP Bio</td><td>AGAH0500</td><td></td></tr><tr><td>NucleoFast 96 PCR Plate</td><td>Macherey Nagel</td><td>743.100.100</td><td></td></tr><tr><td>Enzima Idade I HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3552L</td><td>20000U/ml</td></tr><tr><td>Enzima SalI HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3138L</td><td>20000U/ml</td></tr><tr><td>Enzima Xho I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146L</td><td>20000U/ml</td></tr><tr><td>Enzima BSIWI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0553L</td><td>10000U/ml</td></tr><tr><td>HCg1 (número de acesso FJ475055 do Genbank)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LCk (número de acesso ao Genbank FJ475056</td><td></td><td></td><td></td></tr>)<tr><td>LCl (acesso ao Genbank número FJ517647)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>T4 DNA ligase</td><td>Invitrogen por thermoFisher scientific</td><td>15224.017</td><td>100U (1U/ul)</td></tr> <tr><td>2X YT médio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y1003-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10835242001</td><td></td></tr><tr><td>LB (Luria Bertani) Caldo (Lennox)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>L3022-250G</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin Plasmid DNA, RNA e purificação de proteínas</td><td>Macherey Nagel</td><td>740588.250</td><td></td></tr><tr><td>Jet PEI DNA reagente de transfecção PolyPlus</td><td></td><td>101-40</td><td></td></tr><tr><td>Fundo planoPlaca de 96 poços</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 poços</td><td>Nunc/Thermofisher</td><td>055142</td><td></td></tr><tr><td>Nunc easy 175 cm2 frascos</td><td>Nunc/Thermofisher</td><td>12-562-000</td><td></td></tr><tr><td>ELISA/ELISPOT tampão de revestimento</td><td>eBiosciences</td><td>00-0044-59</td><td></td></tr><tr><td>Nunc maxisorp fundo plano 96 poços placas ELISA</td><td>Nunc / Thermofisher</td><td>44-2404-21</td><td>alta ligação a proteínas</td></tr><tr><td>IgG anti-humano Ab conjugado à peroxidase de rábano (HRP)</td> <td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>55788</td><td></td></tr><tr><td>substrato TMB</td><td>BD Biosciences</td><td>555214</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Sigma</td><td>S0677</td><td></td></tr><tr><td>1 mL-HiTrap proteína A coluna HP</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0402-01</td><td></td></tr><tr><td>&Auml; KTA FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>18190026</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 coluna 10/300 GL</td> Sistema de cromatografia <td>GE Healthcare</td><td>17517501</td><td></td></tr><tr><td>NGC Quest 10 Plus</td><td>BioRad</td><td>7880003</td><td></td></tr></tbody></table>

geração dos anticorpos monoclonais humanos discriminativa de rara b antígeno-específicas células circulantes no sangue

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Anticorpos monoclonais (mAbs) são poderosas ferramentas úteis para ambas as pesquisas fundamentais e em biomedicina. Sua alta especificidade é indispensável quando o anticorpo precisa distinguir entre estruturas altamente relacionadas (por exemplo, uma proteína normal e uma versão mutante respectivas). A maneira atual de gerar tais discriminatórios mAbs envolve extensa seleção de várias células B produtoras de Ab, que é caro e demorado. Propomos aqui um método rápido e econômico para a geração de discriminativa, mAbs plenamente humano a partir de sangue humano circulam os linfócitos B. A originalidade desta estratégia é devido a seleção de células de ligação B antígeno específico combinado com a Counter-seleção de todas as outras células, usando prontamente disponível periférico sangue mononucleares células (PBMC). Uma vez que células B específicas são isoladas, sequências de cDNA (complementar ácido desoxirribonucleico) que codifica para o mAb correspondente são obtidas usando a tecnologia de célula única reverso transcrição-cadeia da polimerase (RT-PCR) e posteriormente expressos em humanos células. Dentro de menos de 1 mês, é possível produzir miligramas de mAbs humana altamente discriminativa, dirigido contra praticamente qualquer antígeno desejado naturalmente detectado pelo repertório de células B.

Partir de PBMC de doadores saudáveis, presentes neste projeto a geração de mAbs humana, que reconhece o peptídeo Pp65495 (Pp65, do citomegalovírus humano) apresentado pela classe complexo principal de histocompatibilidade I (MHC-eu) molécula HLA - A * 0201 ( HLA-A2). Esses mAbs podem discriminar entre este complexo e complexos que representam outros peptídeos carregados no mesmo MHC-eu molécula.
PBMC foram corados com...

Nós descrevemos um método para a produção de anticorpos humanos específicos para um antígeno de interesse, a partir de raras células B que circulam no sangue humano. Geração destes anticorpos naturais é rápida e eficiente, e os anticorpos obtidos podem discriminar entre antígenos altamente relacionados.

Geração dos anticorpos monoclonais humanos discriminativa de rara B antígeno-específicas células circulantes no sangue

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

O objetivo geral deste procedimento é produzir anticorpos monoclonais totalmente humanos contra um antígeno desejado a partir de linfócitos B humanos circulando no sangue. Este protocolo permite a geração de anticorpos monoclonais que podem discriminar entre antígenos altamente relacionados. Para algumas aplicações, como imunoterapia, o direcionamento preciso de um antígeno pode ser indispensável.As vantagens dessa técnica são que ela pode ser realizada a partir do sangue de doadores saudáveis ou imunizados e permite o isolamento até mesmo de células B raras de ligação a antígenos. Embora esse método seja descrito a partir de amostras humanas, ele também pode ser aplicado a animais que podem ser pré-imunizados. A demonstração visual deste método é crítica, pois o procedimento realmente está sob uma estratégia de bloqueio analítico múltiplo bastante complexa de linfócitos B discriminados.O procedimento será realizado por Melinda. Ela é engenheira assistente do nosso laboratório. Primeiro pipete 35 mililitros de suspensão de célula diluída em 15 mililitros de gradiente de densidade em um tubo cônico de 50 mililitros.Em seguida, coloque o tubo cônico em um rotor de caçamba oscilante com os freios desligados e centrifugue a 1290 vezes a gravidade por 25 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, na interface do meio gradiente de densidade e da camada plasmática, aspire cuidadosamente a camada de células mononucleares e transfira-a para um novo tubo cônico de 50 mililitros. Adicione a suspensão celular a um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugue a 460 vezes a gravidade por cinco minutos.Em seguida, ressuspenda o pellet em 200 microlitros de solução salina tamponada com fosfato com soro bovino fetal a 2%. Adicionar tetrâmeros conjugados a uma concentração final de 10 microgramas por mililitro. Misture bem e incube em temperatura ambiente por 30 minutos na capela de fluxo laminar, protegida da luz.Em seguida, adicione 10 mililitros de tampão de separação de células geladas à suspensão de células. Centrifugue a suspensão da célula a 460 vezes a gravidade por cinco minutos. Ao pellet celular obtido, adicione 500 microlitros de tampão de separação de células geladas e 50 microlitros de duas variantes de microesferas magnéticas e incube a suspensão celular por 20 minutos.Em seguida, ressuspenda o pellet celular no tampão de separação de células geladas. Transfira cuidadosamente a suspensão da célula no topo de uma coluna equilibrada e deixe-a escorrer completamente. Em seguida, enxágue o tubo com três mililitros de tampão de separação de células e transfira o tampão para a coluna.Depois de enxaguar a coluna três vezes, retire-a do ímã e coloque-a em um tubo coletor cônico de 25 mililitros. Depois de adicionar cinco mililitros de tampão de separação gelado no topo da coluna, lave rapidamente as células da coluna com a ajuda de um êmbolo. Ressuspenda o pellet celular com um coquetel de anticorpos anti-humanos e 7AAD em um volume total de 100 microlitros de solução salina tamponada com fosfato com soro bovino fetal 2%.Em seguida, incube as células a quatro graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, use um citômetro classificador de células para classificar células B específicas no nível de célula única, não excedendo mais de 1.000 eventos por segundo. Em seguida, colete as células B classificadas em tubos de PCR de 8 tiras previamente preenchidos com 10 microlitros de solução salina tamponada com fosfato 1X e 10 unidades de inibidor de RNAse e coloque em um rack para 96 microtubos.Congele rapidamente os tubos a 80 graus Celsius negativos. Aqueça as amostras congeladas em um banho seco mantido a 70 graus Celsius por cinco minutos para lisar as células. Em seguida, coloque a tira no gelo e comece a constituir o master-mix de transcrição reversa.Uma vez que o mastermix de transcrição reversa é preparado, o programa instrui o termociclador. No final da transcrição reversa, execute PCRs aninhados para amplificar os genes da imunoglobulina. Identifique os clones positivos visualizando em um gel de 1,5% de agarose a migração de um produto de PCR de 500 pares de bases para segmentos de codificação e cadeia pesada variável e 350 produtos de PCR de pares de bases para segmentos de codificação de cadeia leve variável.Adicione um microlitro do produto de clonagem a 45 microlitros de células eletrocompetentes de E.coli TOP10. Eletroporado. Em seguida, adicione rapidamente 500 microlitros de meio 2X YT às células e incube em banho-maria a 37 graus Celsius por 30 minutos. Espalhe as bactérias transformadas em uma placa de ampicilina 2X YT.Em seguida, incube as placas durante a noite a 37 graus Celsius. Em seguida, configure uma pré-mistura de reação e adicione 25 microlitros dela por tubo de PCR de 8 tiras mantido no gelo. Em seguida, use um palito estéril para escolher as colônias e riscar as colônias na placa de ampicilina 2X YT.Em seguida, mergulhe os palitos no tubo de reação de PCR. Identifique os clones positivos visualizando em um gel de 1,5% de agarose a migração de um produto de PCR de par de bases 850 para o vetor de cadeia pesada e um produto de PCR de par de bases 600 para o vetor de cadeia leve. Em dois mililitros de meio LB, inocular quatro colônias positivas.Incubar o inoculado a 37 graus Celsius durante a noite a 200 rotações por minuto agitando. Semeie 15.000 células renais embrionárias humanas em 200 microlitros do meio Eagle modificado de Dulbecco suplementado com 10% de soro bovino fetal em cada poço de uma placa de fundo plano de 96 poços um dia antes da transfecção. Em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius durante a noite a 5% de dióxido de carbono.Cotransfectar as células usando um reagente de transfecção derivado de polietilenimina linear. Diluir 0,5 microlitros de reagente de transfecção de DNA com 10 microlitros de 150 milimolares de cloreto de sódio. Em seguida, diluir 0,125 micrograma de cada vetor variável de expressão de cadeia pesada e leve em 10 microlitros de cloreto de sódio 150 milimolar.Vortex todas as diluições por 10 segundos cada. Em seguida, misture o reagente de transfecção de DNA previamente diluído com 10 microlitros de solução de DNA. Rapidamente vórtice a mistura de transfecção de DNA por 15 segundos e incube por 15 minutos em temperatura ambiente.Adicione a mistura de transfecção de DNA gota a gota nas células e, em seguida, gire suavemente a placa. Substitua o meio 16 horas após a transfecção e cultive as células por cinco dias em meio sem soro a 37 graus Celsius. Em seguida, use uma pipeta multicanal para aspirar o sobrenadante e transfira-o para a placa de 96 poços de fundo em V.Cubra cada poço em uma placa ELISA de 96 poços com antígeno relevante a quatro graus Celsius durante a noite em 100 microlitros de tampão de revestimento ELISA reconstituído a uma concentração final de dois microgramas por mililitro. Em seguida, adicione 50 microlitros de um sobrenadante de célula transfectada aos poços de uma placa ELISA de 96 poços e incube a placa por duas horas em temperatura ambiente. Em seguida, adicione 100 microlitros de anticorpo antiglobulina G anti-humana conjugado à enzima peroxidase de rábano na concentração de um micrograma por mililitro e incube o poço em temperatura ambiente por uma hora.Por fim, adicione 50 microlitros de substrato cromogênico ao poço e incube por mais 20 minutos. No final da incubação, leia a densidade óptica em 450 nanômetros em um espectrofotômetro. Para isolar as células B específicas, foi usada uma estratégia de gating que discriminou as células B que expressam receptores contra o complexo HLA-A2 / Pp65.Inicialmente, as células eram CD19 positivas, CD3 negativas. Finalmente, as células foram coradas com HLA-A2 / Pp65PE e HLA-A2 / Pp65APC, mas não com tetrâmeros HLA-A2 / MelABV421, foram fechadas para obter as células B altamente específicas. Usando essa estratégia de gating, as células B seletivas podem ser isoladas, o que pode diferenciar entre HLA-A2 / Pp65 e outros complexos peptídicos HLA-A2 relacionados.Em seguida, para estudar a presença do anticorpo PC1.02 contra o tetrâmero HLA-A2/Pp65, foi realizado um ensaio ELISA. No gráfico de barras obtido, o eixo y corresponde às leituras de densidade ótimas e o eixo x corresponde aos peptídeos HLA-A2. A partir do ensaio, mostra que um anticorpo monoclonal se liga ao tetrâmero HLA-A2 / Pp65 de maneira dependente do peptídeo e do complexo principal de histocompatibilidade.Em seguida, a residência da plasmina de superfície foi usada para estudar a afinidade de ligação do anticorpo PC1.02. Em seguida, obteve-se um dado tabular para análise das células B específicas do HLA-A2/Pp65. O impacto da estratégia de exclusão de células B inespecíficas, os rendimentos da amplificação do gene da imunoglobulina e a produção de anticorpos monoclonais a partir de células B específicas para HLA-A2 / Pp65 foram demonstrados.Uma vez dominada, a técnica que vai desde o isolamento de antígenos específicos de células B do sangue humano até a produção de anticorpos monoclonais pode ser feita em menos de um mês. Ao realizar este procedimento, lembre-se de ir direto da classificação de células B para RT-PCR sem pausar.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra um método de geração de anticorpos a partir de células de mamíferos através da introdução de vetores plasmidiais com genes de cadeia pesada e leve. Esses vetores interagem com a polietilenimina e entram nas células formando poliplexos; Posteriormente, eles são traduzidos em proteínas individuais e montados em anticorpos completos, que são secretados no meio extracelular.

Geração de anticorpos monoclonais recombinantes a partir de culturas de células de mamíferos

O vídeo demonstra uma técnica para gerar anticorpos monoclonais a partir de células B específicas do antígeno. Vetores de expressão eucarióticos que codificam as cadeias pesadas e leves de anticorpos, clonados a partir de células B específicas de antígenos isolados, são introduzidos em células de mamíferos usando poliplexos. Uma vez dentro das células, esses vetores sofrem tradução, e os peptídeos de cadeia pesada e leve resultantes se reúnem em anticorpos, que são posteriormente secretados...

Uma técnica para gerar anticorpos monoclonais a partir de células B específicas do antígeno

Este artigo descreve um método para a geração e propagação de clones de células T humanas que respondem especificamente a um aloantígeno definido. Este protocolo pode ser adaptado para clonagem de células T humanas específicas para uma variedade de ligantes peptídicos-MHC.

Geração de Células T humanas alo-específicos a partir de Sangue Periférico

A síntese de anticorpos monoclonais humanos é o primeiro passo em estudos destinados a desvendar os mecanismos fisiopatológicos das respostas imunes mediadas por auto-anticorpos. Desenvolvemos um protocolo para gerar anticorpos monoclonais de imunoglobulina G humana (IgG) recombinantes a partir de células B classificadas no sangue, incluindo isolamento de células B, clonagem de anticorpos e síntese in vitro.

Geração de IgG Humana Recombinante de Anticorpos Monoclonais As células seleccionadas a partir de B imortalizadas

O sangue periférico humano é comumente usado para a avaliação da resposta imune humoral. Aqui, são descritos os métodos para isolar células B humanas do sangue periférico, diferenciar células B humanas em células B secretoras de anticorpos (Ab) (ASCs) em cultura e enumerar o total de IgM- e IgG-ASCs por meio de um ensaio ELISpot.

O isolamento, a diferenciação e a quantificação de anticorpo humano secretoras de células B de sangue: ELISpot como uma leitura funcional de Imunidade Humoral

Um protocolo otimizado é apresentado para a geração de anticorpos monoclonais baseados na tecnologia de hibridoma. Os camundongos foram imunizados com um imunoconjugado. As células do baço foram fundidas por PEG e um impulso elétrico com células de mieloma imortal. As células de hibridoma produtoras de anticorpos foram selecionadas por HAT e triagem ELISA antígeno-específica.

Geração de anticorpos monoclonais murinos pelo hibridoma Tecnologia

Um método simples, mas eficaz, que emprega nanopartículas magnéticas para detectar e enriquecer as células B antígeno-reativa para análise funcional e fenotípica é descrito.

Detecção e enriquecimento da Rare células B antígeno-específica para a análise do fenótipo e função

Este artigo fornece um protocolo detalhado para a preparação e avaliação de anticorpos monoclonais contra produtos naturais para uso em diversos imunoensaios. Esse procedimento inclui imunização, fusão celular, indirecto ELISA competitivo para clone positivo triagem e preparação de hibridoma monoclonal. As especificações para a caracterização de anticorpo usando análises de ELISA e MALDI-TOF-MS também são fornecidas.

Geração de anticorpos monoclonais contra produtos naturais

O método de BSelex para identificar e recuperar anticorpos antígeno-específicos individuais das pilhas mononucleares do sangue periférico humano combina a citometria do fluxo com o único PCR da pilha e a clonagem.

Método de triagem de célula única para a seleção e recuperação de anticorpos com especificidades desejadas de populações de células B de memória humana enriquecida

Descrevemos aqui uma simples análise da heterogeneidade do compartimento de células B imunes da murina nos tecidos peritônio, baço e medula óssea por citometria de fluxo. O protocolo pode ser adaptado e estendido a outros tecidos do mouse.

Caracterização citométrica de fluxo do desenvolvimento de células B murinas

Aprenda a gerar anticorpos monoclonais humanos a partir de linfócitos B circulantes no sangue. Este método permite discriminar antígenos altamente relacionados para aplicações em imunoterapia.

Geração dos anticorpos monoclonais humanos discriminativa de rara B antígeno-específicas células circulantes no sangue

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