Name: Isolamento de glândulas mamárias de Mouse intacto, todo para a análise da expressão de matriz extracelular e morfologia da glândula (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: Aprenda a isolar glândulas mamárias intactas de camundongos para análise de expressão de proteínas da matriz extracelular e morfologia ductal. Este método preserva interações teciduais para estudos em biologia do desenvolvimento e pesquisa tumoral.

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Os autores gostaria de reconhecer abril Wiles e Dr. Roger Broderson para obter assistência com animal necropsia e isolamento de glândula, respectivamente. Financiamento para este trabalho foi apoiado pelo Philadelphia College of Osteopathic Medicine Centers para doenças crônicas do envelhecimento.

procedimentos envolvendo assuntos animais neste protocolo foram revistos e aprovados pelo Comité de utilização da faculdade de Medicina Osteopática de Filadélfia e institucional Cuidado Animal e todas as técnicas foram conduzidas sob rigorosas as diretrizes éticas.
 1. amostra de aquisição e processamento de <ol><li>selecione assunto animal apropriado e coloque em uma câmara de 2 CO. Para este experimento, usar a semana de 8-10 velho fêmeas nulíparas B6. CG-Cav1tmMIs/J e C57BI/6-j.</li>
	<li>Vez no fluxo de gás de 30-40%. Uma vez que o animal está visivelmente inconsciente após cerca de 2 min, abra a válvula de gás à pressão completa um adicional 5 min. 
	Nota: Confirme a morte de animais, observando sinais visíveis de respiração (por exemplo, o movimento do tórax) durante um período de 10 min após a cessação do CO 2 entrega. Se o animal ainda está vivo, podem ser colocado em câmara de CO 2. Deslocamento cervical também pode ser utilizado, embora não seja recomendável como sangue pode acumular-se em torno de glândulas mamárias, interferindo com a dissecção e resultados.</li>
	<li>Após o sacrifício, pino carcaça em posição supina e saturar com etanol a 70%.</li>
	<li>Beliscar a pele logo acima do púbis usando fórceps e nick com pequena tesoura cirúrgica. Girando a tesoura, corte a pele ao longo da linha mediana ventral que movendo caudal ao craniana.</li>
	<li>Com uma tesoura maior ou com uma pinça hemostática, sem rodeios dissecar a fáscia subcutânea bilateralmente, com cuidado para não perfurar o peritoneu. Corte ao longo das margens horizontais em ambas as extremidades distais da incisão.</li>
	<li>Pino de peles retalhos abrir e borrife novamente com etanol a 70%. 
	Nota: Embora permitida a utilização de etanol a 70% melhor distinção visual entre a glândula e o tecido subcutâneo, tenha cuidado para evitar a secagem do tecido como resultado da utilização desta solução. Para evitar a secagem, retire a glândula em um período de tempo não deve exceder 4 min. Como uma alternativa ao etanol a 70%, o investigador também pode substituir uma reserva geral isolada, como a PBS 1x, para evitar a dessecação do tecido.</li>
	<li>Localizar as glândulas mamárias de interesse, deslize uma lâmina de bisturi #4 ao longo do interior dos flaps de pele, corte da glândula mamária e adiposo cutâneo associado livre da derme. 
	Nota: 3.5 x lupas cirúrgicas micro pode ajudar na visualização mais fácil das glândulas.</li>
	<li>Imediatamente submergir glândula recém isolada em tubo cônico contendo o volume de solução de 10:1-tecido de formol tamponado neutro a 10% por 24-48 h. 
	Nota: Dependendo da intenção do estudo, muitos fixadores alternativos podem ser usadas como paraformaldeído, etanol para estudos genômicos e comercialmente disponível RNA preservando buffers de.</li>
	<li>Seguem protocolos institucionais para a incorporação de parafina, enviar amostras a um fornecedor para transformação, incorporação e corte/montagem de slide. Secção de tecidos em 5 µm. 
	Nota: Devido ao excesso adiposa circundante glândula, considere remover 100-200 µm de tecido antes do corte e coloração.</li>
</ol> 2. Coloração do tecido <ol><li>Immunohistochemistry <ol><li>slides de lugar para ser manchado no bloco térmico fixado em 58 ˚ c por 1h derreter parafina. 
		Cuidado: Derretimento da cera de parafina pode fugir de slide. Acompanhar de perto ou coloque compressa sob slide para capturar cera escoamento. 
		Nota: Este passo não é essencial e pode ser ignorado. Se os resultados não são tão esperado, adicionar este passo atrás pode melhorar os resultados.</li>
		Slides de incubar <li>em um slide jar contendo xileno 100% por 30 min, garantindo a completa submersão. Repetir uma vez. 
		Nota: neste ponto, inspeção visual deve ser realizada para garantir que cortes histologicos são livres de tecido adiposo e parafina. Se adicional de tecido adiposo ou cera é evidente, o slide deve ser re-submersa em xilol. Tenha cuidado para minimizar a exposição adicionada ao xileno, pois isso pode causar encolhimento do tecido.</li>
		<li>Tecidos de hidratar num frasco slide contendo 100% de etanol de 10 min. repetem uma vez.</li>
		<li>Mover slides para um frasco de slide contendo etanol a 95% durante 10 min. repetem uma vez.</li>
		<li>Mover slides um slide frasco contendo 75% de etanol por 5 min.</li>
		<li>Mover slides um slide frasco contendo 50% de etanol por 5 min.</li>
		<li>Solução de citrato de sódio de 10 mM (pH 6,0) em uma chapa quente ou um microondas de ferver e despeje em uma jarra de Coplin. 
		Cuidado: Cuidadosamente monitorar solução ao aquecimento e tomar cuidado para evitar ferver sobre. O recipiente será muito quente. Use proteção para evitar queimaduras.</li>
		<li>Lentamente lugar slides em Coplin jar, garantindo a completa submersão e incubam a 100 ° C por 10 min recuperar os resumos. Retire e seque cuidadosamente slides.</li>
		<li>Desenhar uma barreira em torno do tecido com um marcador hidrofóbico. Adicionar suficiente bloqueador de enzima endógena (peróxido de hidrogênio e azida de sódio, disponível comercialmente) para cobrir o tecido e incubar durante 10 min.</li>
		<li>Slides de submergir em 1 fosfato x tampão salino (PBS) durante 10 min.</li>
		<li>Adicionar soro suficiente burro de 10% em PBS 1x para cobrir o tecido e incubar por 1h à temperatura ambiente em uma câmara umidificada. 
		Nota: O experimento pode ser pausado aqui armazenando os slides na câmara umidificada a 4 ° C durante a noite. Enquanto o soro burro foi encontrado para produzir óptimos resultados de coloração, o investigador pode desejar testar diferentes soros como albumina de soro bovino (BSA), soro de cabra ou soro de cavalo para determinar os resultados ideais. Se usando BSA, o investigador deve preparar este fresco antes da utilização.</li>
		<li>Decantar excesso bloqueador de slides e adicione anticorpo primário corretamente diluído em 1% de soro diretamente para slides, garantindo que o tecido é uniformemente coberto em solução. Incubar durante 30 min à temperatura ambiente em uma câmara umidificada. 
		Nota: Este passo pode ser continuado por períodos mais longos de tempo com câmara húmida armazenada em 4 ° C. Certifique-se de incluir slides adequado controlo negativo (por exemplo, um slide com nenhum anticorpo primário, conhecido antígeno negativo tecido, etc.) neste passo.</li>
		<li>Cuidadosamente lave slides fluindo cerca de 1ml de diH 2 O sobre tecido e incubar em 1 troca de 1X PBS durante 5 min.</li>
		<li>Decantar excesso PBS e adicionar suficiente rótulo de peroxidase de rábano para cobrir o tecido e incube por 30 min em uma câmara umidificada. 
		Nota: Neste passo, o investigador poderá proceder à fluorescente coloração usando anticorpos secundarios conjugados fluorescente. Se isto for desejado, os próximos passos descritos devem ser modificados em conformidade.</li>
		<li>Cuidadosamente lave slides fluindo cerca de 1ml de diH 2 O sobre tecido e incubar em 1 troca de 1X PBS durante 5 min.</li>
		<li>Fazer diaminobenzidina (DAB) mais solução de cromogénio, de acordo com a proporção sugerida do fabricante e misture por vórtice. 
		Nota: Muitos kits pré-fabricados são comercialmente disponíveis além de um usado neste protocolo.</li>
		<li>Decantar excesso de buffer de slides e adicione 2-3 gotas (10-50 µ l) de cromogénio mancha diretamente para os tecidos e incube durante 5 min em câmara úmida. Lavar cuidadosamente slides por fluxo cerca de 1 mL diH, 2 O sobre tecido. 
		Cuidado: DAB-cromogénio é altamente tóxico. Evitar contato direto da mancha com fluxo de pele e cobrar fora de resíduos perigosos.</li>
	</ol></li> <li>Hematoxilina e eosina (H &#38; E) <ol><li>após o enxágue final após incubação de cromogénio, submergir slides em hematoxilina de Harris para slides de 2 a 2,5 min. enxaguar delicadamente sob água da torneira por 1-2 min. 
		Nota: tenha cuidado para evitar jacto directo de água sobre tecidos.</li>
		<li>Submergir desliza para 2-3 s em solução de diferenciação (0,25 mL de ácido clorídrico em 100 mL de etanol a 70%). Enxágue desliza suavemente sob água da torneira para cerca de 1-2 min.</li>
		<li>Submergir slides em agente azul (4,5 mg de carbonato de cálcio em 100 mL de água de torneira, pH ajustado para 9,4) para 60 slides de enxaguamento s. em etanol a 95% por 30 s.</li>
		<li>Slides de submergir em alcoólica eosina Y para 2-3 min.</li>
		<li>Desidratar o tecido em 2 trocas de etanol a 95% por 1 min cada.</li>
		<li>Desidratando tecido em 1 mudar de etanol 100% por 1 min.</li>
		<li>Slides cuidadosamente secos com uma limpeza de fiapos. Aplique 1 gota (aproximadamente 100-200 µ l) sintético, aquosos, resina à base de montagem de mídia para deslizar e lamela. 
		Nota: Se um método de coloração diferente foi eleito, uma mídia de montagem diferente poderá ser necessária. Por exemplo, se o investigador escolheu um anticorpo secundário conjugado fluorescente, um monte de aquoso seria mais ideal.</li>
		<li>Permitir slides definir a noite à temperatura ambiente.</li>
	</ol></li> <li>Coloração de Picrosirius vermelho (PSR) <ol><li>selecione slides para ser manchado e seguir o protocolo de imuno-histoquímica através do passo 6 (embeber de 50% de etanol).</li>
		<li>Slides de submergir no PSR macular durante 1 h.</li>
		<li>Submergir slides em 0,5% de ácido acético para s 1-2, duas vezes para diferenciar mancha.</li>
		<li>Desidratar tecidos em 2 trocas de etanol a 95% por 1 min cada.</li>
		<li>Desidratando tecidos em 1 mudar de etanol 100% por 1 min.</li>
		<li>Clara slides submergindo brevemente em 100% de xilol para sobre 3-4 s.</li>
		<li>Slides cuidadosamente secos com uma limpeza de fiapos. Aplique 1 gota (aproximadamente 100-200 µ l) sintético, aquosos, resina à base de montagem de mídia para deslizar e lamela.</li>
	</ol></li></ol> 3. Análise da amostra <ol><li>Análise Ductal <ol><li>selecione lâminas coradas para α-SMA. Usando um microscópio óptico equipado com um câmera montada objetivo, coletar imagens representativas na ampliação de 20 X.</li>
		<li>Usando o ImageJ (NIH), distinguir e contar os dutos em cada imagem. Estas podem ser enumeradas manualmente ou se pode atribuir uma pontuação numérica às condutas individuais. Para atribuir uma pontuação numérica, abra o ImageJ e selecione Plugins. Em seguida selecione a analisar e escolher o contador de célula do menu drop-down. Clique em Initialize então destacar tipo 1 para começar a etiquetar dutos. Ao terminar, selecione resultados para exibir a contagem ductal. 
		Nota: tenha cuidado para verificar estruturas são ductal e não vascular.</li>
		<li>Em &#39; conjunto de medição &#39; opções, verifique &#39; perímetro &#39; e &#39; área &#34;.</li>
		<li>Usando a ferramenta polígono à mão livre, desenhar uma linha ao redor de cada duto no compartimento do mioepiteliais (visibilidade auxiliada pela mancha de α-SMA). Selecione &#39; medida &#39; e gravar o perímetro e área.</li>
		<li>Novamente usando a ferramenta polígono à mão livre, desenhe uma linha ao longo da parte apical do epitélio ductal no interior do lúmen. Selecione &#39; medida &#39; e gravar o perímetro e área.</li>
		<li>Subtrair do perímetro do compartimento luminal do perímetro do compartimento mioepiteliais para obter a circunferência do epitélio ductal. Subtrair da área do compartimento luminal da área do compartimento para obter a área do epitélio ductal mioepiteliais.</li>
	</ol></li> <li>Análise imuno-histoquímica <ol><li>Upload de imagens brightfield para um software analítico, como o ImageJ ou FIJI Suite. 
		Nota: Este protocolo descreve as etapas para coloração análise usando o ImageJ e o plugin de ferramentas IHC.</li>
		<li>Abrir o Toolbox de IHC no menu Plugin. Na &#34; selecionar modelo &#34; caixa de combinação que abre, selecione o apropriado mancha (ou seja, H-DAB, PSR, etc.). Selecione o &#34; cor &#34; opção para isolar a mancha. Isto irá abrir uma janela de resultado. 
		Nota: Este método é apropriado se uma proteína de interesse situa-se nos espaços extracelulares ou citosol, ou está vinculada a membrana plasmática. Se a proteína de interesse é nuclear, selecionando &#34; núcleos &#34; solicitará o plugin para analisar a imagem para núcleos positivamente manchadas.</li>
		<li>Usar o deslize de seletor de cor para garantir um isolamento adequado da mancha sem fundo de inclusão ou exclusão de mancha excessiva. 
		Nota: Se o modo automático é incapaz de detectar a mancha ou não resulte em imagens aceitáveis, desenhe um quadrado de região de interesse (ROI) sobre um identificados manchado a região. Na janela de ferramentas de IHC, selecione &#34; trem &#34; para direcionar o plugin para o destino apropriado.</li>
		<li>Converter a imagem de 16 bits. Vá para imagem &#8594; tipo &#8594; 16bit.</li>
		<li>Limite a imagem. Vá para imagem &#8594; ajustar &#8594; Auto limiar.</li>
		<li>Definir a escala de medição de imagem desenhando uma linha ROI directamente por cima da barra de escala da imagem, em seguida, atribuir o comprimento. Para definir a barra de escala, vá para Analyze &#8594; definir escala. O número de pixels pela unidade desejada de comprimento (por exemplo, 120 pixels por 50 µm) de entrada.</li>
		<li>Medir a área resultante e quer dizer valor cinza. Vá para Analyze &#8594; definir medidas e recolher a medição clicando Analyze &#8594; medida.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

No artigo, descrevemos uma técnica para isolar as glândulas mamárias rato intacta para análise histológica a jusante de expressão ECM e morfologia ductal. No que diz respeito a análises da morfologia ductal, esta metodologia permite a rápida investigação de arquitetura ductal baseada fora de cortes histológicos corados. Outros métodos de análises Ductais dependem de injeções de corantes para permitir a visualização da árvore ductal, métodos que podem ser tecnicamente desafiador e demorado.
No ...

Câncer de mama é caracterizado por um grau substancial de tecido fibrose1,2,3,4. Conhecido como o ECM, esta entidade não celular encontra-se em diferentes graus em todos os tecidos e é composta principalmente de uma malha complexa de fibrillar e não-fibrillar colágenos, elastina e glicoproteínas, além de várias moléculas de sinalização que estão isolado nesta matriz. Sob condições homeostáticas, a deposição e a degradação de ECM é rigidamente controlado. 5 durante a tumorigênese da mama, o equilíbrio da deposição de ECM e degradação é interrompido. Como tal, tumores de mama têm sido relatados para expressar proteínas abundantes de ECM como colágenos, fibronectina e tenascin-C, entre outros. 6 a expressão anormal destas proteínas além de padrões de aumento de reticulação de matriz tem sido documentada para promover mama tumor progressão, metástase e terapia resistência1,3, 4,7,8,9.
Para avaliar a composição de ECM e morfologia ductal, realizou-se o isolamento de intactas as glândulas mamárias. Aqui, usamos fêmeas nulíparas camundongos deficientes para caveolin-1, uma proteína integral de membrana que tem sido associada a um agressivo tumor assinatura10,11,12de mama e controlar fêmeas nulíparas B6 ratos. Processamento histológico e coloração desses tecidos permitiu a identificação de várias proteínas de ECM, juntamente com a caracterização da morfologia ductal.
No geral, o isolamento de todo, intactos glândulas mamárias dá pesquisadores a oportunidade de investigar mudanças morfológicas ou celulares todo o tecido que ocorrem em resposta a fatores exógenos ou endógenos. Desvantagens da técnica são associadas com as análises de 2 secções de tecido de dimensão (2D) em oposição a uma perspectiva 3D, o que renderia uma imagem mais completa da morfologia complexa da árvore ductal. Dada a complexidade das interações célula-célula e célula-ECM que ocorrem na glândula mamária, o isolamento das glândulas inteira, intactas é vantajoso para analisar eficientemente ductal expressão morfologia e proteínas em várias regiões da mamária o murino glândula.

<table><tbody><tr><td>Microscópio de Luz</td><td>Olympus</td><td>BX43</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Câmera</td><td>Olympus</td><td>DP73</td><td></td></tr><tr><td>Software de Análise de Imagem</td><td>Olympus</td><td>cellSens Software de</td><td></td></tr><tr><td></td> entrada <td>NIH</td><td>ImageJ</td><td></td></tr><tr><td>3.5x-R Micro lupas cirúrgicas</td><td>Rose Micro Solutions</td><td></td><td>Ampliação à preferência do pesquisador</td></tr><tr><td>Mayo Tesoura</td><td>Medline</td><td>DYND04035</td><td></td></tr><tr><td>Staining Rack</td><td>Fisher Scientific</td><td>121</td><td></td></tr><tr><td>Prato de coloração</td><td>Fisher Scientific</td><td>112</td><td></td></tr><tr><td>Frascos Coplin</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-4</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas de vidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>Tamanho apropriado para tecido</td></tr><tr><td>IHC EnVision+ Kit (HRP, Mouse, DAB+)</td><td>Dako</td><td>K400611-2</td><td></td></tr><tr><td>Picrosirius Red Kit</td><td>Abcam</td><td>AB150681</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y, alcoólico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT110132</td><td></td></tr><tr><td>Harris Hematoxilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HHS16</td><td></td></tr><tr><td>Soro de burro</td><td>EMD Millipore</td><td>S30</td><td></td></tr><tr><td>10% Formalina tamponada neutra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Xilenos, Grau Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 200 prova</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792780</td><td>adequado para biologia molecular</td></tr><tr><td>Fosfato Tampolado Salino, 1x</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de Sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S279-500</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato de Cálcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>202932</td><td></td></tr><tr><td>Permanente Meio de montagem</td><td>Dako</td><td>S1964</td><td></td></tr><tr>Meio de montagem <td>Sigma-Aldrich</td><td>3989</td><td></td>da<td>Eukitt</td></tr><tr><td>Anticorpo de fibronectina</td><td>Abcam</td><td>AB23750</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Tenascina-C</td><td>Abcam</td><td>AB108930</td><td></td></tr><tr><td>Alpha Smooth Muscle Actin anticorpo</td><td>Abcam</td><td>AB124964</td><td></td></tr><tr><td>Dako Envision Dual Link System HRP</td><td>Dako</td><td>K4065</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de glândulas mamárias de mouse intacto, todo para a análise da expressão de matriz extracelular e morfologia da glândula

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

O objetivo deste procedimento foi colher as glândulas mamárias abdominal de #4 dos ratos fêmeas nulíparas a fim de avaliar a expressão de ECM e arquitetura ductal. Aqui, um pequeno bolso abaixo da pele foi criado com uma tesoura de Mayo, permitindo a separação das glândulas dentro do tecido subcutâneo do peritônio subjacente. Visualização das glândulas foi auxiliada pelo uso de 3.5 lupas micro cirúrgicas x-R. O pelt foi invertido e preso de volta que permite identificação das almofadas de gordura mamárias do intactas. Cada uma das glândulas abdominais #4 sem rodeios foi dissecada deslizando a lâmina de bisturi lateralmente entre a camada subcutânea e as glândulas. Imediatamente após a colheita, as glândulas foram colocadas em neutro formol a 10% tamponada para processamento subsequente do tecido. Excisão da glândula inteira é vantajosa porque principalmente elimina o risco de excluir importantes interações de todo o tecido entre as células epiteliais Ductais e outras populações celulares microenvironmental que podem ser perdidas em uma biópsia parcial. Uma desvantagem da metodologia é o uso de seções seriais de tecidos fixos que limita as análises de expressão ductal de morfogênese e proteína para locais discretos dentro da glândula. Como tal, mudanças na expressão de arquitetura e proteína ductal em 3 dimensões (3D) não é prontamente obteníveis. Em geral, a técnica é aplicável a estudos exigindo toda intactas murino as glândulas mamárias para investigações a jusante, tais como câncer de peito ou morfogênese ductal do desenvolvimento.

Ratos fêmeas têm 5 pares de glândulas mamárias. Especificamente, há um par de glândulas do colo do útero (#1), dois pares de glândulas torácicas (#2 e #3), um par de glândulas abdominais (#4) e 1 par de glândulas inguinais (#5) (Figura 1A). Aqui, isolamos as glândulas #4 como eles são facilmente identificáveis. Em algumas circunstâncias, ambos #4 e #5 glândulas foram isoladas juntos como distinção entre os dois era difícil. Para isolar intact...

Aqui, apresentamos um protocolo para a isolação do rato inteiro, intacto, glândulas mamárias para investigar a expressão da matriz extracelular (ECM) e morfologia ductal. Mouse #4 glândulas abdominais foram extraídas dos ratos de 8-10 semanas nulíparas fêmeas, fixados em formalina tamponada neutra, seccionado e manchado usando imuno-histoquímica para proteínas de ECM.

Isolamento de glândulas mamárias de Mouse intacto, todo para a análise da expressão de matriz extracelular e morfologia da glândula

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

O objetivo geral desta técnica de colheita de glândula mamária inteira é facilitar a análise da apresentação histológica do tecido mamário de uma glândula intacta ex-vivo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia tumoral, como como o tecido estromal é remodelado em tumores ou como a expressão aberrante de genes ou proteínas altera a arquitetura ductal mamária. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite aos pesquisadores a capacidade de caracterizar e quantificar a expressão proteica e a arquitetura ductal em glândulas mamárias inteiras de camundongos saudáveis e doentes.Demonstrando essa técnica estará Chris Thompson, um estudante de pós-graduação em meu laboratório. Depois de sacrificar camundongos nulíparas fêmeas de oito a 10 semanas de idade de acordo com o protocolo de texto, prenda a carcaça em decúbito dorsal e use etanol a 70% para saturá-la. Use uma pinça para beliscar a pele logo acima do púbis e corte-a com uma pequena tesoura cirúrgica.Em seguida, girando a tesoura, corte a pele ao longo da linha média ventral, movendo-se caudal para cranial. Com uma tesoura maior ou um hemostático, disseque sem corte a fáscia subcutânea bilate

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este método descreve como dissecar e avaliar o desenvolvimento da glândula mamária e na função de camundongos. Excisadas glândulas mamárias são avaliados quanto ao grau de desenvolvimento usando montar todo, enquanto a ejeção do leite é avaliada através de um ensaio de oxitocina baseado contração mioepiteliais celular.

Avaliação do desenvolvimento da glândula mamária e Função em modelos de ratos

Lapso de tempo de imagem é utilizado para avaliar o comportamento dos principais pré-neoplásicas células epiteliais mamárias derivados de modelos de ratos geneticamente modificados de risco de câncer de mama para determinar se há correlação entre os parâmetros específicos de comportamento e distintas lesões genéticas.

Lapso de tempo de imagem de pré-neoplásicas primárias células epiteliais mamárias derivados de modelos de rato geneticamente modificado do cancro da mama

O protocolo de imunofluorescência indirecta descrito neste artigo permite a detecção e a localização de proteínas na glândula mamaria do rato. Um método completo é dada para preparar amostras da glândula mamaria, a efectuar imuno-histoquímica, para as secções de tecido imagem por microscopia de fluorescência, e para reconstruir imagens.

Imunofluorescência Indireta em cortes congelados de Rato glândula mamária

Este protocolo descreve métodos para purificar, quantificar e caracterizar vesículas extracelulares (EVs) / exossomos de células epiteliais mamárias não aderentes / mesenquimatosas e para utilizá-las para transferir a capacidade de formação de glândula mamária para células epiteliais mamárias luminal. EVs / exosomas derivados de células epiteliais mamárias semelhantes a tronco podem transferir esta propriedade celular para células que ingerem EVs / exossos.

Transferência de capacidade de formação de glândulas mamárias entre células epiteliais basais mamárias e células luminal mamárias através de vesículas / exossos extracelulares

O desenvolvimento da glândula mamária no roedor tipicamente foi avaliado usando avaliações descritivas ou medindo atributos físicos básicos. A densidade de ramificação é um indicador de desenvolvimento mamário que é difícil de quantificar objetivamente. Este protocolo descreve um método confiável para a avaliação quantitativa das características de ramificação da glândula mamária.

Quantificando a densidade de ramificação em glândulas mamárias de ratos montadas inteiras usando o método de análise Sholl

Desenvolvemos um método para remover, processar, cortar e manchar com sucesso, para avaliação histopatológica, tecido mamário que inicialmente havia sido fixado em slides como montagens inteiras. Este método pode promover a coleta e avaliação de montantes inteiros de glândula mamária em estudos de diretrizes de testes reprodutivos e de desenvolvimento.

Seção de mamíferos mamários completos para identificação de lesões

A glândula mamária é uma estrutura bicamada, composta por células epiteliais mioepiteleliais externas e internas. Apresentado é um protocolo para preparar organóides utilizando a tripspsinização diferencial. Este método eficiente permite que os pesquisadores manipulem separadamente esses dois tipos de células para explorar questões sobre seus papéis na forma e função da glândula mamária.

Geração de Organóides Mammary mosaicos por Trypsinização Diferencial

O método de imagem intravital descrito aqui utiliza colágeno segunda geração harmônica e fluorescência endógena do cofator metabólico NAD(P)H para segmentar não invasivamente um microambiente tumoral não rotulado em compartimentos tumorais, estromaéreos e vasculares para análise aprofundada de imagens intravital 4D.

Uma abordagem de segmentação sem rótulos para imagens intravitais do microambiente tumoral mamário

O presente protocolo descreve uma técnica fácil para a imagem intravital da glândula mamária de camundongos lactantes por microscopia confocal e multifotônica de varredura a laser.

Microscopia Subcelular Intravital da Glândula Mamária

Este protocolo discute uma abordagem para a geração de organoides epiteliais a partir de tecido mamário primário normal e tumoral através da centrifugação diferencial. Além disso, estão incluídas instruções para a cultura tridimensional, bem como imagens imunofluorescentes de organoides incorporados.

Gerando e Imageando Organoides Epitéliares de Camundongos e Humanos a partir de Tecido Mamário Normal e Tumoral Sem Passagem

Este protocolo descreve uma abordagem escalável de triagem intraductal CRISPR, permitindo estudos paralelos in vivo de eliminação e ativação genética na glândula mamária do camundongo.

Triagem In Vivo Paralela da Eliminação e Ativação Gênica na Glândula Mamária do Camundongo

Aprenda a isolar glândulas mamárias intactas de camundongos para análise de expressão de proteínas da matriz extracelular e morfologia ductal. Este método preserva interações teciduais para estudos em biologia do desenvolvimento e pesquisa tumoral.

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