Name: Isolamento de glândulas mamárias de Mouse intacto, todo para a análise da expressão de matriz extracelular e morfologia da glândula (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: Aprenda a isolar glândulas mamárias intactas de camundongos para análise de expressão de proteínas da matriz extracelular e morfologia ductal. Este método preserva interações teciduais para estudos em biologia do desenvolvimento e pesquisa tumoral.

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Os autores gostaria de reconhecer abril Wiles e Dr. Roger Broderson para obter assistência com animal necropsia e isolamento de glândula, respectivamente. Financiamento para este trabalho foi apoiado pelo Philadelphia College of Osteopathic Medicine Centers para doenças crônicas do envelhecimento.

procedimentos envolvendo assuntos animais neste protocolo foram revistos e aprovados pelo Comité de utilização da faculdade de Medicina Osteopática de Filadélfia e institucional Cuidado Animal e todas as técnicas foram conduzidas sob rigorosas as diretrizes éticas.
 1. amostra de aquisição e processamento de <ol><li>selecione assunto animal apropriado e coloque em uma câmara de 2 CO. Para este experimento, usar a semana de 8-10 velho fêmeas nulíparas B6. CG-Cav1tmMIs/J e C57BI/6-j.</li>
	<li>Vez no fluxo de gás de 30-40%. Uma vez que o animal está visivelmente inconsciente após cerca de 2 min, abra a válvula de gás à pressão completa um adicional 5 min. 
	Nota: Confirme a morte de animais, observando sinais visíveis de respiração (por exemplo, o movimento do tórax) durante um período de 10 min após a cessação do CO 2 entrega. Se o animal ainda está vivo, podem ser colocado em câmara de CO 2. Deslocamento cervical também pode ser utilizado, embora não seja recomendável como sangue pode acumular-se em torno de glândulas mamárias, interferindo com a dissecção e resultados.</li>
	<li>Após o sacrifício, pino carcaça em posição supina e saturar com etanol a 70%.</li>
	<li>Beliscar a pele logo acima do púbis usando fórceps e nick com pequena tesoura cirúrgica. Girando a tesoura, corte a pele ao longo da linha mediana ventral que movendo caudal ao craniana.</li>
	<li>Com uma tesoura maior ou com uma pinça hemostática, sem rodeios dissecar a fáscia subcutânea bilateralmente, com cuidado para não perfurar o peritoneu. Corte ao longo das margens horizontais em ambas as extremidades distais da incisão.</li>
	<li>Pino de peles retalhos abrir e borrife novamente com etanol a 70%. 
	Nota: Embora permitida a utilização de etanol a 70% melhor distinção visual entre a glândula e o tecido subcutâneo, tenha cuidado para evitar a secagem do tecido como resultado da utilização desta solução. Para evitar a secagem, retire a glândula em um período de tempo não deve exceder 4 min. Como uma alternativa ao etanol a 70%, o investigador também pode substituir uma reserva geral isolada, como a PBS 1x, para evitar a dessecação do tecido.</li>
	<li>Localizar as glândulas mamárias de interesse, deslize uma lâmina de bisturi #4 ao longo do interior dos flaps de pele, corte da glândula mamária e adiposo cutâneo associado livre da derme. 
	Nota: 3.5 x lupas cirúrgicas micro pode ajudar na visualização mais fácil das glândulas.</li>
	<li>Imediatamente submergir glândula recém isolada em tubo cônico contendo o volume de solução de 10:1-tecido de formol tamponado neutro a 10% por 24-48 h. 
	Nota: Dependendo da intenção do estudo, muitos fixadores alternativos podem ser usadas como paraformaldeído, etanol para estudos genômicos e comercialmente disponível RNA preservando buffers de.</li>
	<li>Seguem protocolos institucionais para a incorporação de parafina, enviar amostras a um fornecedor para transformação, incorporação e corte/montagem de slide. Secção de tecidos em 5 µm. 
	Nota: Devido ao excesso adiposa circundante glândula, considere remover 100-200 µm de tecido antes do corte e coloração.</li>
</ol> 2. Coloração do tecido <ol><li>Immunohistochemistry <ol><li>slides de lugar para ser manchado no bloco térmico fixado em 58 ˚ c por 1h derreter parafina. 
		Cuidado: Derretimento da cera de parafina pode fugir de slide. Acompanhar de perto ou coloque compressa sob slide para capturar cera escoamento. 
		Nota: Este passo não é essencial e pode ser ignorado. Se os resultados não são tão esperado, adicionar este passo atrás pode melhorar os resultados.</li>
		Slides de incubar <li>em um slide jar contendo xileno 100% por 30 min, garantindo a completa submersão. Repetir uma vez. 
		Nota: neste ponto, inspeção visual deve ser realizada para garantir que cortes histologicos são livres de tecido adiposo e parafina. Se adicional de tecido adiposo ou cera é evidente, o slide deve ser re-submersa em xilol. Tenha cuidado para minimizar a exposição adicionada ao xileno, pois isso pode causar encolhimento do tecido.</li>
		<li>Tecidos de hidratar num frasco slide contendo 100% de etanol de 10 min. repetem uma vez.</li>
		<li>Mover slides para um frasco de slide contendo etanol a 95% durante 10 min. repetem uma vez.</li>
		<li>Mover slides um slide frasco contendo 75% de etanol por 5 min.</li>
		<li>Mover slides um slide frasco contendo 50% de etanol por 5 min.</li>
		<li>Solução de citrato de sódio de 10 mM (pH 6,0) em uma chapa quente ou um microondas de ferver e despeje em uma jarra de Coplin. 
		Cuidado: Cuidadosamente monitorar solução ao aquecimento e tomar cuidado para evitar ferver sobre. O recipiente será muito quente. Use proteção para evitar queimaduras.</li>
		<li>Lentamente lugar slides em Coplin jar, garantindo a completa submersão e incubam a 100 ° C por 10 min recuperar os resumos. Retire e seque cuidadosamente slides.</li>
		<li>Desenhar uma barreira em torno do tecido com um marcador hidrofóbico. Adicionar suficiente bloqueador de enzima endógena (peróxido de hidrogênio e azida de sódio, disponível comercialmente) para cobrir o tecido e incubar durante 10 min.</li>
		<li>Slides de submergir em 1 fosfato x tampão salino (PBS) durante 10 min.</li>
		<li>Adicionar soro suficiente burro de 10% em PBS 1x para cobrir o tecido e incubar por 1h à temperatura ambiente em uma câmara umidificada. 
		Nota: O experimento pode ser pausado aqui armazenando os slides na câmara umidificada a 4 ° C durante a noite. Enquanto o soro burro foi encontrado para produzir óptimos resultados de coloração, o investigador pode desejar testar diferentes soros como albumina de soro bovino (BSA), soro de cabra ou soro de cavalo para determinar os resultados ideais. Se usando BSA, o investigador deve preparar este fresco antes da utilização.</li>
		<li>Decantar excesso bloqueador de slides e adicione anticorpo primário corretamente diluído em 1% de soro diretamente para slides, garantindo que o tecido é uniformemente coberto em solução. Incubar durante 30 min à temperatura ambiente em uma câmara umidificada. 
		Nota: Este passo pode ser continuado por períodos mais longos de tempo com câmara húmida armazenada em 4 ° C. Certifique-se de incluir slides adequado controlo negativo (por exemplo, um slide com nenhum anticorpo primário, conhecido antígeno negativo tecido, etc.) neste passo.</li>
		<li>Cuidadosamente lave slides fluindo cerca de 1ml de diH 2 O sobre tecido e incubar em 1 troca de 1X PBS durante 5 min.</li>
		<li>Decantar excesso PBS e adicionar suficiente rótulo de peroxidase de rábano para cobrir o tecido e incube por 30 min em uma câmara umidificada. 
		Nota: Neste passo, o investigador poderá proceder à fluorescente coloração usando anticorpos secundarios conjugados fluorescente. Se isto for desejado, os próximos passos descritos devem ser modificados em conformidade.</li>
		<li>Cuidadosamente lave slides fluindo cerca de 1ml de diH 2 O sobre tecido e incubar em 1 troca de 1X PBS durante 5 min.</li>
		<li>Fazer diaminobenzidina (DAB) mais solução de cromogénio, de acordo com a proporção sugerida do fabricante e misture por vórtice. 
		Nota: Muitos kits pré-fabricados são comercialmente disponíveis além de um usado neste protocolo.</li>
		<li>Decantar excesso de buffer de slides e adicione 2-3 gotas (10-50 µ l) de cromogénio mancha diretamente para os tecidos e incube durante 5 min em câmara úmida. Lavar cuidadosamente slides por fluxo cerca de 1 mL diH, 2 O sobre tecido. 
		Cuidado: DAB-cromogénio é altamente tóxico. Evitar contato direto da mancha com fluxo de pele e cobrar fora de resíduos perigosos.</li>
	</ol></li> <li>Hematoxilina e eosina (H &#38; E) <ol><li>após o enxágue final após incubação de cromogénio, submergir slides em hematoxilina de Harris para slides de 2 a 2,5 min. enxaguar delicadamente sob água da torneira por 1-2 min. 
		Nota: tenha cuidado para evitar jacto directo de água sobre tecidos.</li>
		<li>Submergir desliza para 2-3 s em solução de diferenciação (0,25 mL de ácido clorídrico em 100 mL de etanol a 70%). Enxágue desliza suavemente sob água da torneira para cerca de 1-2 min.</li>
		<li>Submergir slides em agente azul (4,5 mg de carbonato de cálcio em 100 mL de água de torneira, pH ajustado para 9,4) para 60 slides de enxaguamento s. em etanol a 95% por 30 s.</li>
		<li>Slides de submergir em alcoólica eosina Y para 2-3 min.</li>
		<li>Desidratar o tecido em 2 trocas de etanol a 95% por 1 min cada.</li>
		<li>Desidratando tecido em 1 mudar de etanol 100% por 1 min.</li>
		<li>Slides cuidadosamente secos com uma limpeza de fiapos. Aplique 1 gota (aproximadamente 100-200 µ l) sintético, aquosos, resina à base de montagem de mídia para deslizar e lamela. 
		Nota: Se um método de coloração diferente foi eleito, uma mídia de montagem diferente poderá ser necessária. Por exemplo, se o investigador escolheu um anticorpo secundário conjugado fluorescente, um monte de aquoso seria mais ideal.</li>
		<li>Permitir slides definir a noite à temperatura ambiente.</li>
	</ol></li> <li>Coloração de Picrosirius vermelho (PSR) <ol><li>selecione slides para ser manchado e seguir o protocolo de imuno-histoquímica através do passo 6 (embeber de 50% de etanol).</li>
		<li>Slides de submergir no PSR macular durante 1 h.</li>
		<li>Submergir slides em 0,5% de ácido acético para s 1-2, duas vezes para diferenciar mancha.</li>
		<li>Desidratar tecidos em 2 trocas de etanol a 95% por 1 min cada.</li>
		<li>Desidratando tecidos em 1 mudar de etanol 100% por 1 min.</li>
		<li>Clara slides submergindo brevemente em 100% de xilol para sobre 3-4 s.</li>
		<li>Slides cuidadosamente secos com uma limpeza de fiapos. Aplique 1 gota (aproximadamente 100-200 µ l) sintético, aquosos, resina à base de montagem de mídia para deslizar e lamela.</li>
	</ol></li></ol> 3. Análise da amostra <ol><li>Análise Ductal <ol><li>selecione lâminas coradas para α-SMA. Usando um microscópio óptico equipado com um câmera montada objetivo, coletar imagens representativas na ampliação de 20 X.</li>
		<li>Usando o ImageJ (NIH), distinguir e contar os dutos em cada imagem. Estas podem ser enumeradas manualmente ou se pode atribuir uma pontuação numérica às condutas individuais. Para atribuir uma pontuação numérica, abra o ImageJ e selecione Plugins. Em seguida selecione a analisar e escolher o contador de célula do menu drop-down. Clique em Initialize então destacar tipo 1 para começar a etiquetar dutos. Ao terminar, selecione resultados para exibir a contagem ductal. 
		Nota: tenha cuidado para verificar estruturas são ductal e não vascular.</li>
		<li>Em &#39; conjunto de medição &#39; opções, verifique &#39; perímetro &#39; e &#39; área &#34;.</li>
		<li>Usando a ferramenta polígono à mão livre, desenhar uma linha ao redor de cada duto no compartimento do mioepiteliais (visibilidade auxiliada pela mancha de α-SMA). Selecione &#39; medida &#39; e gravar o perímetro e área.</li>
		<li>Novamente usando a ferramenta polígono à mão livre, desenhe uma linha ao longo da parte apical do epitélio ductal no interior do lúmen. Selecione &#39; medida &#39; e gravar o perímetro e área.</li>
		<li>Subtrair do perímetro do compartimento luminal do perímetro do compartimento mioepiteliais para obter a circunferência do epitélio ductal. Subtrair da área do compartimento luminal da área do compartimento para obter a área do epitélio ductal mioepiteliais.</li>
	</ol></li> <li>Análise imuno-histoquímica <ol><li>Upload de imagens brightfield para um software analítico, como o ImageJ ou FIJI Suite. 
		Nota: Este protocolo descreve as etapas para coloração análise usando o ImageJ e o plugin de ferramentas IHC.</li>
		<li>Abrir o Toolbox de IHC no menu Plugin. Na &#34; selecionar modelo &#34; caixa de combinação que abre, selecione o apropriado mancha (ou seja, H-DAB, PSR, etc.). Selecione o &#34; cor &#34; opção para isolar a mancha. Isto irá abrir uma janela de resultado. 
		Nota: Este método é apropriado se uma proteína de interesse situa-se nos espaços extracelulares ou citosol, ou está vinculada a membrana plasmática. Se a proteína de interesse é nuclear, selecionando &#34; núcleos &#34; solicitará o plugin para analisar a imagem para núcleos positivamente manchadas.</li>
		<li>Usar o deslize de seletor de cor para garantir um isolamento adequado da mancha sem fundo de inclusão ou exclusão de mancha excessiva. 
		Nota: Se o modo automático é incapaz de detectar a mancha ou não resulte em imagens aceitáveis, desenhe um quadrado de região de interesse (ROI) sobre um identificados manchado a região. Na janela de ferramentas de IHC, selecione &#34; trem &#34; para direcionar o plugin para o destino apropriado.</li>
		<li>Converter a imagem de 16 bits. Vá para imagem &#8594; tipo &#8594; 16bit.</li>
		<li>Limite a imagem. Vá para imagem &#8594; ajustar &#8594; Auto limiar.</li>
		<li>Definir a escala de medição de imagem desenhando uma linha ROI directamente por cima da barra de escala da imagem, em seguida, atribuir o comprimento. Para definir a barra de escala, vá para Analyze &#8594; definir escala. O número de pixels pela unidade desejada de comprimento (por exemplo, 120 pixels por 50 µm) de entrada.</li>
		<li>Medir a área resultante e quer dizer valor cinza. Vá para Analyze &#8594; definir medidas e recolher a medição clicando Analyze &#8594; medida.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

No artigo, descrevemos uma técnica para isolar as glândulas mamárias rato intacta para análise histológica a jusante de expressão ECM e morfologia ductal. No que diz respeito a análises da morfologia ductal, esta metodologia permite a rápida investigação de arquitetura ductal baseada fora de cortes histológicos corados. Outros métodos de análises Ductais dependem de injeções de corantes para permitir a visualização da árvore ductal, métodos que podem ser tecnicamente desafiador e demorado.
No ...

Câncer de mama é caracterizado por um grau substancial de tecido fibrose1,2,3,4. Conhecido como o ECM, esta entidade não celular encontra-se em diferentes graus em todos os tecidos e é composta principalmente de uma malha complexa de fibrillar e não-fibrillar colágenos, elastina e glicoproteínas, além de várias moléculas de sinalização que estão isolado nesta matriz. Sob condições homeostáticas, a deposição e a degradação de ECM é rigidamente controlado. 5 durante a tumorigênese da mama, o equilíbrio da deposição de ECM e degradação é interrompido. Como tal, tumores de mama têm sido relatados para expressar proteínas abundantes de ECM como colágenos, fibronectina e tenascin-C, entre outros. 6 a expressão anormal destas proteínas além de padrões de aumento de reticulação de matriz tem sido documentada para promover mama tumor progressão, metástase e terapia resistência1,3, 4,7,8,9.
Para avaliar a composição de ECM e morfologia ductal, realizou-se o isolamento de intactas as glândulas mamárias. Aqui, usamos fêmeas nulíparas camundongos deficientes para caveolin-1, uma proteína integral de membrana que tem sido associada a um agressivo tumor assinatura10,11,12de mama e controlar fêmeas nulíparas B6 ratos. Processamento histológico e coloração desses tecidos permitiu a identificação de várias proteínas de ECM, juntamente com a caracterização da morfologia ductal.
No geral, o isolamento de todo, intactos glândulas mamárias dá pesquisadores a oportunidade de investigar mudanças morfológicas ou celulares todo o tecido que ocorrem em resposta a fatores exógenos ou endógenos. Desvantagens da técnica são associadas com as análises de 2 secções de tecido de dimensão (2D) em oposição a uma perspectiva 3D, o que renderia uma imagem mais completa da morfologia complexa da árvore ductal. Dada a complexidade das interações célula-célula e célula-ECM que ocorrem na glândula mamária, o isolamento das glândulas inteira, intactas é vantajoso para analisar eficientemente ductal expressão morfologia e proteínas em várias regiões da mamária o murino glândula.

<table><tbody><tr><td>Microscópio de Luz</td><td>Olympus</td><td>BX43</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Câmera</td><td>Olympus</td><td>DP73</td><td></td></tr><tr><td>Software de Análise de Imagem</td><td>Olympus</td><td>cellSens Software de</td><td></td></tr><tr><td></td> entrada <td>NIH</td><td>ImageJ</td><td></td></tr><tr><td>3.5x-R Micro lupas cirúrgicas</td><td>Rose Micro Solutions</td><td></td><td>Ampliação à preferência do pesquisador</td></tr><tr><td>Mayo Tesoura</td><td>Medline</td><td>DYND04035</td><td></td></tr><tr><td>Staining Rack</td><td>Fisher Scientific</td><td>121</td><td></td></tr><tr><td>Prato de coloração</td><td>Fisher Scientific</td><td>112</td><td></td></tr><tr><td>Frascos Coplin</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-4</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas de vidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>Tamanho apropriado para tecido</td></tr><tr><td>IHC EnVision+ Kit (HRP, Mouse, DAB+)</td><td>Dako</td><td>K400611-2</td><td></td></tr><tr><td>Picrosirius Red Kit</td><td>Abcam</td><td>AB150681</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y, alcoólico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT110132</td><td></td></tr><tr><td>Harris Hematoxilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HHS16</td><td></td></tr><tr><td>Soro de burro</td><td>EMD Millipore</td><td>S30</td><td></td></tr><tr><td>10% Formalina tamponada neutra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Xilenos, Grau Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 200 prova</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792780</td><td>adequado para biologia molecular</td></tr><tr><td>Fosfato Tampolado Salino, 1x</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de Sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S279-500</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato de Cálcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>202932</td><td></td></tr><tr><td>Permanente Meio de montagem</td><td>Dako</td><td>S1964</td><td></td></tr><tr>Meio de montagem <td>Sigma-Aldrich</td><td>3989</td><td></td>da<td>Eukitt</td></tr><tr><td>Anticorpo de fibronectina</td><td>Abcam</td><td>AB23750</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Tenascina-C</td><td>Abcam</td><td>AB108930</td><td></td></tr><tr><td>Alpha Smooth Muscle Actin anticorpo</td><td>Abcam</td><td>AB124964</td><td></td></tr><tr><td>Dako Envision Dual Link System HRP</td><td>Dako</td><td>K4065</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de glândulas mamárias de mouse intacto, todo para a análise da expressão de matriz extracelular e morfologia da glândula

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

O objetivo deste procedimento foi colher as glândulas mamárias abdominal de #4 dos ratos fêmeas nulíparas a fim de avaliar a expressão de ECM e arquitetura ductal. Aqui, um pequeno bolso abaixo da pele foi criado com uma tesoura de Mayo, permitindo a separação das glândulas dentro do tecido subcutâneo do peritônio subjacente. Visualização das glândulas foi auxiliada pelo uso de 3.5 lupas micro cirúrgicas x-R. O pelt foi invertido e preso de volta que permite identificação das almofadas de gordura mamárias do intactas. Cada uma das glândulas abdominais #4 sem rodeios foi dissecada deslizando a lâmina de bisturi lateralmente entre a camada subcutânea e as glândulas. Imediatamente após a colheita, as glândulas foram colocadas em neutro formol a 10% tamponada para processamento subsequente do tecido. Excisão da glândula inteira é vantajosa porque principalmente elimina o risco de excluir importantes interações de todo o tecido entre as células epiteliais Ductais e outras populações celulares microenvironmental que podem ser perdidas em uma biópsia parcial. Uma desvantagem da metodologia é o uso de seções seriais de tecidos fixos que limita as análises de expressão ductal de morfogênese e proteína para locais discretos dentro da glândula. Como tal, mudanças na expressão de arquitetura e proteína ductal em 3 dimensões (3D) não é prontamente obteníveis. Em geral, a técnica é aplicável a estudos exigindo toda intactas murino as glândulas mamárias para investigações a jusante, tais como câncer de peito ou morfogênese ductal do desenvolvimento.

Ratos fêmeas têm 5 pares de glândulas mamárias. Especificamente, há um par de glândulas do colo do útero (#1), dois pares de glândulas torácicas (#2 e #3), um par de glândulas abdominais (#4) e 1 par de glândulas inguinais (#5) (Figura 1A). Aqui, isolamos as glândulas #4 como eles são facilmente identificáveis. Em algumas circunstâncias, ambos #4 e #5 glândulas foram isoladas juntos como distinção entre os dois era difícil. Para isolar intact...

Aqui, apresentamos um protocolo para a isolação do rato inteiro, intacto, glândulas mamárias para investigar a expressão da matriz extracelular (ECM) e morfologia ductal. Mouse #4 glândulas abdominais foram extraídas dos ratos de 8-10 semanas nulíparas fêmeas, fixados em formalina tamponada neutra, seccionado e manchado usando imuno-histoquímica para proteínas de ECM.

Isolamento de glândulas mamárias de Mouse intacto, todo para a análise da expressão de matriz extracelular e morfologia da glândula

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

O objetivo geral desta técnica de colheita de glândula mamária inteira é facilitar a análise da apresentação histológica do tecido mamário de uma glândula intacta ex-vivo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia tumoral, como como o tecido estromal é remodelado em tumores ou como a expressão aberrante de genes ou proteínas altera a arquitetura ductal mamária. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite aos pesquisadores a capacidade de caracterizar e quantificar a expressão proteica e a arquitetura ductal em glândulas mamárias inteiras de camundongos saudáveis e doentes.Demonstrando essa técnica estará Chris Thompson, um estudante de pós-graduação em meu laboratório. Depois de sacrificar camundongos nulíparas fêmeas de oito a 10 semanas de idade de acordo com o protocolo de texto, prenda a carcaça em decúbito dorsal e use etanol a 70% para saturá-la. Use uma pinça para beliscar a pele logo acima do púbis e corte-a com uma pequena tesoura cirúrgica.Em seguida, girando a tesoura, corte a pele ao longo da linha média ventral, movendo-se caudal para cranial. Com uma tesoura maior ou um hemostático, disseque sem corte a fáscia subcutânea bilateralmente, tomando cuidado para não perfurar o peritônio. Corte ao longo das margens horizontais em ambas as extremidades distais da incisão.Em seguida, abra as abas da pele e borrife o tecido com PBS para mantê-lo úmido. Em seguida, localizando as glândulas mamárias de interesse, deslize uma lâmina de bisturi ao longo do interior das abas de pele, cortando a glândula mamária e o tecido adiposo subcutâneo associado da derme. Antes de separar a glândula abdominal da inguinal, tome cuidado para identificar as glândulas o mais distintamente possível.Mergulhe imediatamente a glândula recém-isolada em um tubo cônico contendo aproximadamente seis mililitros de uma solução de 10 para um volume de tecido 10% de formalina tamponada neutra e incube-a por 24 a 48 horas. Depois de derreter a parafina das lâminas e reidratar as fatias de acordo com o protocolo de texto, ferva a solução de citrato de sódio a 10 milimolares em uma placa quente ou no micro-ondas e despeje a solução em um frasco de Coplin. Coloque lentamente as lâminas no frasco de Coplin, garantindo a submersão completa, e incube as lâminas a 100 graus Celsius por 10 minutos para recuperar os epítopos.Em seguida, remova e seque cuidadosamente as lâminas. Em seguida, desenhe uma barreira ao redor do tecido com um marcador hidrofóbico. Depois de seco, enxágue as lâminas com PBS por um a dois segundos.Em seguida, adicione bloqueador enzimático endógeno suficiente para cobrir o tecido e incube as lâminas por 10 minutos. Mergulhe as lâminas em 1X PBS por 10 minutos. Em seguida, adicione soro de burro a 10% e PBS suficientes para cobrir o tecido e incube as amostras em temperatura ambiente em uma câmara umidificada por uma hora.Transvase o excesso de bloqueador das lâminas e adicione o anticorpo primário devidamente diluído em soro a 1% diretamente nas lâminas, garantindo que o tecido seja uniformemente coberto pela solução. Incube as lâminas à temperatura ambiente em uma câmara umidificada por 30 minutos. Lave cuidadosamente as lâminas fluindo cerca de um mililitro de água deionizada sobre o tecido e, em seguida, incube as lâminas em uma troca de 1X PBS por cinco minutos.Transvase o excesso de PBS e adicione anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano suficiente e incube as amostras em uma câmara umidificada por 30 minutos. Lave cuidadosamente as lâminas fluindo cerca de um mililitro de água deionizada sobre o tecido e incube o tecido em uma troca de 1X PBS por cinco minutos como antes. Depois de preparar a solução de DAB mais cromogênio, transvase o excesso de tampão das lâminas e adicione duas a três gotas de coloração de cromogênio diretamente no tecido.Incubar as amostras em uma câmara umidificada por cinco minutos. Em seguida, lave cuidadosamente as lâminas fluindo cerca de um mililitro de água deionizada sobre o tecido. Após um enxágue final após a incubação do cromogênio, mergulhe as lâminas na hematoxilina Harris por dois a dois minutos e meio.Em seguida, enxágue suavemente as lâminas em água da torneira por um a dois minutos. Mergulhe as lâminas na solução de diferenciação por dois a três segundos. Em seguida, enxágue suavemente as lâminas com água da torneira por cerca de um a dois minutos.Mergulhe os slides no agente azul por 60 segundos. Em seguida, enxágue as lâminas em etanol a 95% por 30 segundos. Transfira as lâminas para a eosina Y alcoólica por dois a três minutos antes de desidratar o tecido em duas trocas de etanol a 95% por um minuto cada.Então, finalmente, desidrate o tecido uma vez em 100% de etanol por um minuto. Seque cuidadosamente as lâminas com um pano sem fiapos. Em seguida, aplique uma gota de meio de montagem sintético à base de resina não aquosa na lâmina e aplique uma lamínula.Para realizar a análise ductal, selecione lâminas coradas para alfa SMA. Em seguida, usando um microscópio de luz equipado com uma objetiva montada em câmera, colete imagens representativas com ampliação de 20X. Para contar dutos em cada imagem, conte-os manualmente ou abra o ImageJ e selecione plug-ins.Em seguida, selecione analisar e, no menu suspenso, escolha o contador de células. Clique em inicializar e realce o tipo um para começar a rotular os dutos. Quando terminar, selecione os resultados para visualizar a contagem ductal.Comece desenhando uma linha sobre a barra de escala da imagem com a ferramenta de linha. Em seguida, clique em analisar e definir escala. Na próxima janela, digite a distância em distância conhecida e as unidades em unidade de comprimento.Em seguida, clique em OK. Em seguida, em definir opções de medição, verifique a área e o perímetro. Em seguida, usando a ferramenta de polígono à mão livre, desenhe uma linha ao redor de cada ducto no compartimento mioepitelial.Selecione medir e registre o perímetro e a área. Usando a ferramenta de polígono à mão livre novamente, desenhe uma linha ao longo do lado apical do epitélio ductal dentro do interior do lúmen. Em seguida, selecione medir e registre o perímetro e a área.Subtraia a área do compartimento luminal da área do compartimento mioepitelial para obter a área do epitélio ductal. Subtraia o perímetro do compartimento luminal do perímetro do compartimento mioepitelial para obter a circunferência do epitélio ductal. Para realizar a análise imuno-histoquímica, faça upload de imagens de campo claro para um software analítico, como ImageJ ou Fiji Suite.Usando o menu de plug-ins no ImageJ, abra a caixa de ferramentas do IHC. Na caixa de combinação selecionar modelo que é aberta, selecione a mancha apropriada. Selecione a opção de cor para isolar a mancha.Isso abrirá uma janela de resultados. Use o slide seletor de cores para garantir o isolamento adequado da mancha, sem inclusão de fundo ou exclusão excessiva de manchas. Vá para o tipo de imagem, 16 bits, para converter a imagem em 16 bits.Em seguida, limite a imagem acessando a imagem, ajuste o limite. Por fim, vá para analisar, defina a medição para medir a área resultante e o valor médio de cinza e escolha analisar, medir, para coletar a medição. Nesses cortes fixos das glândulas mamárias número quatro, a expressão de colágeno, fibronectina e tenascina-C foi analisada.As setas indicam a presença de ductos nesses tecidos. Para quantificar as características morfológicas dos ductos, é importante tratar os cortes histológicos com cuidado, pois o manuseio inadequado pode resultar em tecidos danificados e ductos que não são mensuráveis. Um exemplo de tecido danificado que não pode ser usado para análise é mostrado aqui.Uma amostra de tecido intacto onde os ductos são mensuráveis e quantificáveis é mostrada neste painel. Os ductos não são caracterizados apenas pelo estroma corado com fibronectina circundante, mas também pela densa população de células epiteliais que revestem o lúmen dos ductos. Nesta seção corada com fibronectina, vários ductos intactos contêm ramos indicados por setas.Para efeitos desta análise, estes ramos ductais não devem ser considerados como estruturas ductais separadas. Ao avaliar e medir os ductos, é importante distinguir os ductos das estruturas vasculares. As estruturas vasculares são indicadas por setas vermelhas e as estruturas ductais são indicadas por setas pretas.As estruturas vasculares podem ser identificadas não apenas pela presença de uma monocamada endotelial que reveste o lúmen, mas também pela presença de estruturas eosinofílicas anucleares indicativas de glóbulos vermelhos dentro do lúmen. Uma vez dominada, a colheita de tecido pode ser feita em aproximadamente 15 minutos por animal, e as colorações de seção podem ser concluídas em cerca de sete a oito horas, com imagens de lâminas tiradas no dia seguinte, se tudo for realizado corretamente. Ao tentar esses procedimentos, é importante lembrar que os objetivos individuais do seu experimento podem exigir otimizações em etapas específicas.Após este procedimento, outros métodos, como geração de segundo harmônico ou espalhamento Raman anti-Stokes coerente, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a composição ou arquitetura do estroma do tecido. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores em muitos campos, como biologia tumoral, explorarem a organização de tecidos e padrões de expressão de proteínas em vários modelos animais de doenças e patologias humanas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como dissecar e isolar as glândulas mamárias de camundongos.Você também deve entender os procedimentos de coloração imuno-histoquímica de seções de tecido, incluindo o uso de contra-manchas. Não se esqueça de que trabalhar com animais e seus tecidos e produtos químicos, como xilenos e cromogênio DAB, pode ser extremamente perigoso, e precauções como treinamento adequado de criação e uso de equipamentos de proteção individual devem sempre ser tomadas durante a realização desses procedimentos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este método descreve como dissecar e avaliar o desenvolvimento da glândula mamária e na função de camundongos. Excisadas glândulas mamárias são avaliados quanto ao grau de desenvolvimento usando montar todo, enquanto a ejeção do leite é avaliada através de um ensaio de oxitocina baseado contração mioepiteliais celular.

Avaliação do desenvolvimento da glândula mamária e Função em modelos de ratos

Lapso de tempo de imagem é utilizado para avaliar o comportamento dos principais pré-neoplásicas células epiteliais mamárias derivados de modelos de ratos geneticamente modificados de risco de câncer de mama para determinar se há correlação entre os parâmetros específicos de comportamento e distintas lesões genéticas.

Lapso de tempo de imagem de pré-neoplásicas primárias células epiteliais mamárias derivados de modelos de rato geneticamente modificado do cancro da mama

O protocolo de imunofluorescência indirecta descrito neste artigo permite a detecção e a localização de proteínas na glândula mamaria do rato. Um método completo é dada para preparar amostras da glândula mamaria, a efectuar imuno-histoquímica, para as secções de tecido imagem por microscopia de fluorescência, e para reconstruir imagens.

Imunofluorescência Indireta em cortes congelados de Rato glândula mamária

Este protocolo descreve métodos para purificar, quantificar e caracterizar vesículas extracelulares (EVs) / exossomos de células epiteliais mamárias não aderentes / mesenquimatosas e para utilizá-las para transferir a capacidade de formação de glândula mamária para células epiteliais mamárias luminal. EVs / exosomas derivados de células epiteliais mamárias semelhantes a tronco podem transferir esta propriedade celular para células que ingerem EVs / exossos.

Transferência de capacidade de formação de glândulas mamárias entre células epiteliais basais mamárias e células luminal mamárias através de vesículas / exossos extracelulares

O desenvolvimento da glândula mamária no roedor tipicamente foi avaliado usando avaliações descritivas ou medindo atributos físicos básicos. A densidade de ramificação é um indicador de desenvolvimento mamário que é difícil de quantificar objetivamente. Este protocolo descreve um método confiável para a avaliação quantitativa das características de ramificação da glândula mamária.

Quantificando a densidade de ramificação em glândulas mamárias de ratos montadas inteiras usando o método de análise Sholl

Desenvolvemos um método para remover, processar, cortar e manchar com sucesso, para avaliação histopatológica, tecido mamário que inicialmente havia sido fixado em slides como montagens inteiras. Este método pode promover a coleta e avaliação de montantes inteiros de glândula mamária em estudos de diretrizes de testes reprodutivos e de desenvolvimento.

Seção de mamíferos mamários completos para identificação de lesões

A glândula mamária é uma estrutura bicamada, composta por células epiteliais mioepiteleliais externas e internas. Apresentado é um protocolo para preparar organóides utilizando a tripspsinização diferencial. Este método eficiente permite que os pesquisadores manipulem separadamente esses dois tipos de células para explorar questões sobre seus papéis na forma e função da glândula mamária.

Geração de Organóides Mammary mosaicos por Trypsinização Diferencial

O método de imagem intravital descrito aqui utiliza colágeno segunda geração harmônica e fluorescência endógena do cofator metabólico NAD(P)H para segmentar não invasivamente um microambiente tumoral não rotulado em compartimentos tumorais, estromaéreos e vasculares para análise aprofundada de imagens intravital 4D.

Uma abordagem de segmentação sem rótulos para imagens intravitais do microambiente tumoral mamário

O presente protocolo descreve uma técnica fácil para a imagem intravital da glândula mamária de camundongos lactantes por microscopia confocal e multifotônica de varredura a laser.

Microscopia Subcelular Intravital da Glândula Mamária

Este protocolo discute uma abordagem para a geração de organoides epiteliais a partir de tecido mamário primário normal e tumoral através da centrifugação diferencial. Além disso, estão incluídas instruções para a cultura tridimensional, bem como imagens imunofluorescentes de organoides incorporados.

Gerando e Imageando Organoides Epitéliares de Camundongos e Humanos a partir de Tecido Mamário Normal e Tumoral Sem Passagem

Este protocolo descreve uma abordagem escalável de triagem intraductal CRISPR, permitindo estudos paralelos in vivo de eliminação e ativação genética na glândula mamária do camundongo.

Triagem In Vivo Paralela da Eliminação e Ativação Gênica na Glândula Mamária do Camundongo

Aprenda a isolar glândulas mamárias intactas de camundongos para análise de expressão de proteínas da matriz extracelular e morfologia ductal. Este método preserva interações teciduais para estudos em biologia do desenvolvimento e pesquisa tumoral.

Isolamento de glândulas mamárias de Mouse intacto, todo para a análise da expressão de matriz extracelular e morfologia da glândula (Vídeo) | JoVE Journal

Isolamento de glândulas mamárias de Mouse intacto, todo para a análise da expressão de matriz extracelular e morfologia da glândula

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