Isolamento de Salmonella typhimurium-contendo Phagosomes de macrófagos

O objetivo geral deste procedimento é isolar bactérias intactas e enriquecidas contendo fagossomos. Este método pode nos ajudar a responder a questões-chave no campo da Imunologia, como mudanças na maturação do fagossomo e no processamento de antígenos quando microrganismos patogênicos invadem as células hospedeiras. A principal vantagem da técnica é que ela produz bactérias de alta qualidade contendo fagossomos usando etapas simples e sem a necessidade de equipamentos especializados.

Indivíduos novos no método o achariam tecnicamente acessível em comparação com as não metodologias. Tivemos a ideia de desenvolver esse método pela primeira vez quando estávamos estudando os mecanismos pelos quais os patógenos intracelulares sequestram os fagossomos em seu benefício. Demonstrando este procedimento estará Saray Gutierrez, uma pós-doutoranda do meu laboratório.

Para iniciar a cultura de Salmonella Typhimurium, use uma alça de bactérias para inocular uma única colônia bacteriana em 5 mililitros de caldo de infusão cérebro-coração. Em seguida, incube a suspensão em uma incubadora de 37 graus Celsius durante a noite enquanto agita. Transfira um mililitro desta suspensão bacteriana para 19 mililitros de caldo BHI em um frasco cônico no dia seguinte.

Incube novamente na incubadora de 37 graus Celsius enquanto agita. Quando o OD600 atingir um, remova o frasco da incubadora e transfira a cultura para um tubo de 50 mililitros. Em seguida, centrifugue o tubo a 5400 x G a 4 graus Celsius por 15 minutos.

Depois de remover o sobrenadante, ressuspenda o pellet bacteriano em 10 mililitros de PBS estéril. Depois de repetir a centrifugação uma vez, ressuspenda o pellet em 4,9 mililitros de PBS. Em seguida, adicione 100 microlitros de solução de ligação de biotina recém-preparada à suspensão bacteriana.

Depois de dividir esta suspensão em cinco tubos de 1,5 mililitro, incubar em um bloco térmico à temperatura ambiente com agitação constante a 350 rpm por duas horas. Depois de centrifugar os tubos a 15 000 x G à temperatura ambiente durante dez minutos, rejeitar o sobrenadante. Após mais duas etapas de centrifugação e remoção completa da solução de ligação à biotina, ressuspenda esta bactéria codificada por biotina em um PBS estéril de um mililitro em um único tubo de 1,5 mililitro.

Transfira 100 microlitros de solução de esferas magnéticas conjugadas com estreptavidina para um tubo novo de 1,5 mililitro e coloque-o em um rack magnético por cinco minutos. Depois de remover o solvente do tubo, remova o tubo do rack magnético. Em seguida, ressuspenda as esferas que permaneceram no tubo com um mililitro de suspensão bacteriana codificada por biotina.

Incube o tubo em um bloco térmico em temperatura ambiente por uma hora enquanto agita a 350 rpm. Em seguida, coloque o tubo no suporte magnético por cinco minutos. Use uma pipeta para remover as bactérias que não aderiram à parede e transfira para um novo tubo rotulado como bactérias não codificadas.

O tubo com esferas magnéticas aderidas à parede contém bactérias codificadas por biotina estreptavidina. Remova o tubo com bactérias codificadas por biotina estreptavidina do rack magnético e ressuspenda em um mililitro de PBS estéril. Depois que o tubo estiver no rack magnético por cinco minutos, remova o PBS.

Finalmente, ressuspenda as bactérias codificadas de biotina estreptavidina lavadas em 500 microlitros de PBS estéril e rotule o tubo como bactérias codificadas. No dia anterior à infecção, coloque BMDMs totalmente diferenciados em um prato de seis centímetros em RPMIs suplementados com dez por cento de FBS. No dia seguinte, centrifugar a suspensão bacteriana codificada a 15 000 x G a quatro graus Celsius durante cinco minutos.

Após remover o sobrenadante, ressuspenda o pellet bacteriano em meio RPMI suplementado com dez por cento de FBS. Remova o meio dos BMDMs e adicione cinco mililitros de suspensão bacteriana codificada em meio RPMI para infectar as células. Para sincronizar a fagocitose, incube em temperatura ambiente por dez minutos.

Em seguida, para iniciar a fagocitose, incube a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono a cinco por cento por 30 minutos. Após a incubação, remova o meio da louça e lave as células três vezes em RPMI para remover bactérias não internalizadas. Para matar qualquer bactéria não fagocitizada a dez mililitros de RPMI contendo dez por cento de FBS em 50 microgramas por mililitro de gentamicina.

Finalmente, incube os BMDMs infectados a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono a cinco por cento até o ponto de tempo desejado. Primeiro, prepare o volume do tampão de isolamento de fagossomo A necessário adicionando DTT e citocalasina B antes do uso e inibidores de protease e fosfatase conforme recomendado pelo fabricante. Remova o meio das células infectadas no ponto de tempo desejado e lave as células com PBS estéril pré-aquecido à temperatura ambiente.

Em seguida, adicione 750 microlitros de tampão de isolamento de fagossomo A ao prato e incube no gelo por 20 minutos. Lembre-se de balançar o prato ocasionalmente. Em seguida, adicione 250 microlitros de Phagosome Isolation Buffer B e, em seguida, balance as placas para garantir que o buffer cubra completamente a superfície.

Raspe suavemente as células usando um policial de borracha para removê-las do prato e transfira-as para um tubo pré-resfriado de 1,5 mililitro. Em seguida, use uma seringa de um mililitro para passar a suspensão celular por uma agulha de calibre 26 pelo menos 15 vezes. Em seguida, coloque a suspensão da célula no rack magnético por cinco minutos.

As partículas presas às esferas magnéticas são fagossomos contendo S.Typhimurium codificado. Transfira então a suspensão que contém o resto dos componentes celulares para um novo tubo de 1,5 mililitro rotulado como Citosol. Remova o tubo contendo fagossomos isolados do rack e ressuspenda em um PBS estéril de um mililitro.

Coloque o tubo de volta no rack magnético por cinco minutos e remova o PBS. Depois de repetir esta lavagem com PBS uma vez, remova o PBS e, finalmente, ressuspenda S.Typhimurium contendo fagossomos no tampão necessário. Para avaliar a eficácia da biotinilação de S.Typhimurium por microscopia confocal, os BMDMs foram infectados com mCherry S.Typhimurium marcado com biotina.

Após fixação e incubação com Cy5-Streptavidin, a biotinilação bem-sucedida foi confirmada pelo sinal fluorescente Cy5-Streptavidin. Este sinal foi observado exclusivamente em mCherry S.Typhimurium biotinilado, enquanto não houve sinal em mCherry S.Typhimurium não biotinilado. A análise de imunobloqueio de fagossomos isolados mostrou enriquecimento significativo de mCherry expressando S.Typhimurium em fagossomos em comparação com a fração citosólica.

A análise de imunobloqueio usando marcadores de endossomo e lisossomo em fagossomos isolados mostrou enriquecimento dos marcadores testados em fagossomos isolados quatro horas após a infecção em comparação com 30 minutos após a infecção. Quando este protocolo foi aplicado a Staphylococcus aureus, foi demonstrada uma biotinilação bem-sucedida de GFP expressando S. aureus. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em aproximadamente uma hora e meia, dependendo do tempo de incubação escolhido para a infecção pelo investigador.

Para garantir o sucesso do isolamento de bactérias contendo fagossomos, certifique-se de que os tampões contêm as concentrações indicadas e que as placas são agitadas para garantir a cobertura homogênea das células. Além disso, seja gentil ao raspar as células e ao passar a suspensão celular pela agulha. Após este procedimento, outras técnicas como proteômica ou metabolômica podem ser realizadas com fagossomos isolados para estudar alterações causadas por patógenos sob fatores patogênicos envolvidos.