Name: Um método simples e eficiente para estabelecer linhas de células T de pacientes com infecção crônica ativa vírus Epstein - Barr e NK (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Aprenda a estabelecer linhas de células NK e T de pacientes com infecção crônica ativa pelo vírus Epstein-Barr usando sangue periférico e baixa dose de IL-2. Este método simples e eficiente facilita pesquisas sobre mecanismos da doença.

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Este trabalho foi financiado pela projetos chave da Academia Chinesa de Ciências (KFZD-SW-205), estratégico biológicos recursos tecnologia sistema de suporte de chinês Academia de Ciências (CZBZX-1 e ZSSB-004) e por doações de (Fundação Nacional de ciência da China 81401640) e o fundo de ciências naturais (14ZR1434800) de Shanghai.

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de ética do Instituto de genética e biologia do desenvolvimento, da Academia Chinesa de Ciências, e o protocolo segue as diretrizes institucionais para o bem-estar humano.
Nota: Consulte a Figura 1 para um esquema de fluxo de trabalho.
1. isolamento de PBMC de pacientes CAEBV
<ol><li>Purificar o primário PBMC de 2 mL de sangue total de pacientes CAEBV por gradiente (por exemplo, Ficoll-placa) centrifugação seguindo as instruções do fabricante. Alternativamente, o degelo criopreservado PBMC de nitrogênio líquido com meio RPMI 1640.</li>
	<li>Adicionar 2 µ l de azul de trypan (0,4%) de suspensão de células 18 µ l, espere 3 min para manchar as células, a suspensão de transferência para a placa de contador de células e medir concentração e viabilidade com um contador de célula automatizada das células.</li>
	<li>Preparar a suspensão de células em uma densidade de 2-3 × 106 células/mL suplementado com meio de cultura RPMI 1640 completo contendo 20% de soro humano (calor inativado a 56 ° C), 2 mM L-glutamina e antibióticos (estreptomicina 100 de µ g/mL, 100 penicilina U/mL). 1 mL de suspensão PBMC por bem em placas de cultura de células 24 poços de semente.</li>
	<li>Adicione 150 U rhIL-2 por bem.</li>
	<li>Colocar as placas de cultura numa incubadora 5% CO2 a 37 ° C.</li>
	<li>No dia 2, observar a morfologia celular sob um microscópio (ampliação de X 200); as células estão em boas condições quando eles são brilhantes e redondos.</li>
</ol>2. a expansão das células e as células viáveis de numeração
<ol><li>Observar a morfologia celular sob um microscópio (ampliação de X 200) e monitorar a condição do crescimento celular, numerando as células antes de alterar o médio: adicionar 2 µ l de azul de trypan (0,4%) de suspensão de células 18 µ l e calcular a concentração das células (ver 1.2, Figura 2).</li>
	<li>Descartar a 500 µ l de meio em uma placa de 24 e adicionar 500 µ l completa cultura meio fresco. Adicione 150U rhIL-2 por bem.</li>
	<li>Mude o meio duas vezes por semana como no passo 2.2.</li>
	<li>Traçar a curva de crescimento de célula (Figura 3).</li>
	<li>Quando a concentração de células viáveis excede 5 × 106/mL, divida células em novos poços na concentração de 1 a 2 × 106 células/mL em cada poço. Este processo demora de 2 a 4 semanas.</li>
</ol>3. célula fenotipagem por citometria de fluxo
<ol><li>Quando as células têm se expandido, colete 1 × 106 células para determinar os fenótipos de linhas celulares. Centrifugar as células a 240 x g por 5 min à temperatura ambiente (células NK/T irão precipitar no fundo do tubo).</li>
	<li>Desprezar o sobrenadante, lave a precipitação pela adição de 7 mL de PBS. Centrifugue por 5 min a 240 x g , à temperatura ambiente. Repeti uma vez.</li>
	<li>Adicionar 200 µ l de soro humano para cada tubo, misture bem e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Centrifugar as células a 240 x g por 5 min à temperatura ambiente. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 × 106/mL com PBSA frio (PBS+0.2%BSA). Divida células em 5 tubos, cada tubo contendo 2 × 105 células.</li>
	<li>Células de centrífuga a 240 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células com PBSA buffer ou PBSA contendo 10 µ l PE (ou PE-Cy7) e 10 µ l FITC rotulado anticorpos para manchar os receptores celulares de células T ou NK no gelo como é indicado pela Figura 4. Células suspendidas com buffer PBSA são usadas como um controle negativo.</li>
	<li>Incube as células com anticorpos para 20-30 min no gelo no escuro.</li>
	<li>Lavar as células duas vezes com frio PBSA, re-suspender as células com 300 µ l PBSA frio.</li>
	<li>Analise o fenótipo da célula com um citômetro de fluxo.<ol>
<li>Configure o citômetro de fluxo, na condição de "Criar planilha". Configure o modelo experimental com uma trama de pontos que exibe a dispersão para a frente (FSC) versus dispersão lateral (SSC).</li>
		<li>Carregar o isotipo controle tubo para otimizar as tensões SSC e FSC e otimizar o valor de limiar do FSC para eliminar detritos sem interferir com a população de células de interesse. Exclua todos os parâmetros, exceto o FSC, SSC, FITC, PE e PE-Cy7.</li>
		<li>Realize a compensação usando o isotipo controle e um único controlo positivo em cada grupo de análise de 2 cores.</li>
		<li>Carregar amostras e criar HLA-DR VS CD19, CD4 CD8 VS, CD56 VS CD16 e CD3 VS CD16 lotes do ponto mostrando diferente população de células. Nota: PBMC foram utilizados para realizar a compensação usando o controle negativo/isotype e o único controle positivo. 2-cor imunofluorescência com citômetro de fluxo foi usada rotineiramente para analisar a expressão de marcadores de superfície. Os anticorpos seguintes estão incluídos: anti-HLA-DR, anti-CD4, anti-CD16 conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC), anti-CD8, anti-CD56, CD3, conjugado com ficoeritrina (PE) e anti-CD19 conjugados com PE-Cy7.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. expansão e criopreservação de células NK/T
<ol><li>Mude o meio quando for concluída a análise do fenótipo celular. Retire metade do líquido sobrenadante cuidadosamente e evite tocar as células na parte inferior da placa. Adicione o mesmo volume de meio de cultura fresco contendo 300 U/mL rhIL-2 para as placas da célula.</li>
	<li>Mudar metade do meio de cada 3 dias (como 2.2) até a célula clusters são claramente visíveis sob o microscópio (Figura 2). Normalmente, este processo leva 2-3 semanas.</li>
	<li>Transferi as células de placas de 24 poços para frascos de cultura T25 após a mistura de diferentes poços da mesma linhagem. Dobro do volume do meio de cultura é o que parece amarelo até o volume do meio de expande para 10-15 mL. Adicione rhIL-2 com a concentração de 150 U/mL.</li>
	<li>Mudar o médio 24 h antes de congelar após 2-3 semanas, crescendo, quando a célula massa pode ser observada a olho nu. Medir a concentração de células com um contador de célula.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão de eritrócitos durante 5 min à 240 x g e ressuspender o pellet de células em uma densidade de 5-10 x 106 células/mL com a solução de estoque congelada que contém 90% de soro fetal bovino e 10% dimetilsulfóxido (DMSO). Congelar a uma taxa de 1 ° C / min a-80 ° C e depois transferir diretamente para o nitrogênio líquido.</li>
</ol>

<ol><li>Cohen, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus infection.</a> N Engl J Med. 343 (7), 481-492 (2000).</li>
<li>Cohen, J. I., Kimura, H., Nakamura, S., Ko, Y. H., Jaffe, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus-associated+lymphoproliferative+disease+in+non-immunocompromised+hosts%3A+a+status+report+and+summary+of+an+international+meeting%2C+8-9+September+2008%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease in non-immunocompromised hosts: a status report and summary of an international meeting, 8-9 September 2008.</a> Ann Oncol. 20 (9), 1472-1482 (2009).</li>
<li>Oshimi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+understanding+and+managing+natural+killer-cell+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Progress in understanding and managing natural killer-cell malignancies.</a> Br J Haematol. 139 (4), 532-544 (2007).</li>
<li>Kawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+allergy+and+Epstein-Barr+virus-associated+T%2Fnatural+killer-cell+lymphoproliferative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mosquito allergy and Epstein-Barr virus-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disease.</a> Blood. 98 (10), 3173-3174 (2001).</li>
<li>Kimura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection%3A+is+this+an+infectious+disease%2C+lymphoproliferative+disorder%2C+or+immunodeficiency%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of chronic active Epstein-Barr virus infection: is this an infectious disease, lymphoproliferative disorder, or immunodeficiency?</a> Rev Med Virol. 16 (4), 251-261 (2006).</li>
<li>Kimura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+virologic+characteristics+of+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Clinical and virologic characteristics of chronic active Epstein-Barr virus infection.</a> Blood. 98 (2), 280-286 (2001).</li>
<li>Ohshima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proposed+categorization+of+pathological+states+of+EBV-associated+T%2Fnatural+killer-cell+lymphoproliferative+disorder+%28LPD%29+in+children+and+young+adults%3A+overlap+with+chronic+active+EBV+infection+and+infantile+fulminant+EBV+T-LPD%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol+Int%22%5BJournal%5D)">Proposed categorization of pathological states of EBV-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disorder (LPD) in children and young adults: overlap with chronic active EBV infection and infantile fulminant EBV T-LPD.</a> Pathol Int. 58 (4), 209-217 (2008).</li>
<li>Okano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+and+problematic+standpoints+of+severe+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Oncol+Hematol%22%5BJournal%5D)">Overview and problematic standpoints of severe chronic active Epstein-Barr virus infection syndrome.</a> Crit Rev Oncol Hematol. 44 (3), 273-282 (2002).</li>
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<li>Nagata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+novel+natural+killer+%28NK%29-cell+and+gammadelta+T-cell+lines+established+from+primary+lesions+of+nasal+T%2FNK-cell+lymphomas+associated+with+the+Epstein-Barr+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Characterization of novel natural killer (NK)-cell and gammadelta T-cell lines established from primary lesions of nasal T/NK-cell lymphomas associated with the Epstein-Barr virus.</a> Blood. 97 (3), 708-713 (2001).</li>
<li>Nagata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+natural+killer-cell+clones+with+variable+proliferative+capacity+in+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol+Int%22%5BJournal%5D)">Presence of natural killer-cell clones with variable proliferative capacity in chronic active Epstein-Barr virus infection.</a> Pathol Int. 51 (10), 778-785 (2001).</li>
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<li>Tsuchiyama, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+novel+human+natural+killer-cell+line+%28NK-YS%29+established+from+natural+killer+cell+lymphoma%2Fleukemia+associated+with+Epstein-Barr+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Characterization of a novel human natural killer-cell line (NK-YS) established from natural killer cell lymphoma/leukemia associated with Epstein-Barr virus infection.</a> Blood. 92 (4), 1374-1383 (1998).</li>
<li>Tsuge, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Epstein-Barr+virus+%28EBV%29-infected+natural+killer+%28NK%29+cell+proliferation+in+patients+with+severe+mosquito+allergy%3B+establishment+of+an+IL-2-dependent+NK-like+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of Epstein-Barr virus (EBV)-infected natural killer (NK) cell proliferation in patients with severe mosquito allergy; establishment of an IL-2-dependent NK-like cell line.</a> Clin Exp Immunol. 115 (3), 385-392 (1999).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+cytological+and+cytogenetic+features+of+Epstein-Barr+virus+%28EBV%29-positive+natural+killer+%28NK%29+cells+and+cell+lines+derived+from+patients+with+nasal+T%2FNK-cell+lymphomas%2C+chronic+active+EBV+infection+and+hydroa+vacciniforme-like+eruptions%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Common cytological and cytogenetic features of Epstein-Barr virus (EBV)-positive natural killer (NK) cells and cell lines derived from patients with nasal T/NK-cell lymphomas, chronic active EBV infection and hydroa vacciniforme-like eruptions.</a> Br J Haematol. 121 (5), 805-814 (2003).</li>
<li>Oyoshi, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+expansion+of+Vgamma9-JgammaP%2FVdelta2-Jdelta3+gammadelta+T+cells+in+nasal+T-cell+lymphoma+and+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Preferential expansion of Vgamma9-JgammaP/Vdelta2-Jdelta3 gammadelta T cells in nasal T-cell lymphoma and chronic active Epstein-Barr virus infection.</a> Am J Pathol. 162 (5), 1629-1638 (2003).</li>
<li>Imadome, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+mouse+xenograft+models+reveal+a+critical+role+of+CD4%2B+T+cells+in+the+proliferation+of+EBV-infected+T+and+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Novel mouse xenograft models reveal a critical role of CD4+ T cells in the proliferation of EBV-infected T and NK cells.</a> PLoS Pathog. 7 (10), e1002326(2011).</li>
<li>Shibuya, A., Nagayoshi, K., Nakamura, K., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphokine+requirement+for+the+generation+of+natural+killer+cells+from+CD34%2B+hematopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lymphokine requirement for the generation of natural killer cells from CD34+ hematopoietic progenitor cells.</a> Blood. 85 (12), 3538-3546 (1995).</li>
<li>Spits, H., Yssel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+Human+T+and+Natural+Killer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Cloning of Human T and Natural Killer Cells.</a> Methods. 9 (3), 416-421 (1996).</li>
<li>Liu, X., Xu, C., Duan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Red+Blood+Cell+Lysis+Method+for+the+Establishment+of+B+Lymphoblastoid+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines.</a> J Vis Exp. (119), (2017).</li>
<li>Kawabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+flow+cytometric+in+situ+hybridization+assay+to+Epstein-Barr+virus-associated+T%2Fnatural+killer+cell+lymphoproliferative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Application of flow cytometric in situ hybridization assay to Epstein-Barr virus-associated T/natural killer cell lymphoproliferative diseases.</a> Cancer Sci. 103 (8), 1481-1488 (2012).</li>
</ol>

D.Z., X.Z. e X.C. são co-inventores em pendentes pedidos de patentes cobrindo potenciais usos deste método para o estabelecimento de linhas de células NK/T e a linha celular estabelecida neste estudo. D.Z., X.Z. e X.C. declaram sem interesses financeiros concorrentes neste trabalho. Os restantes autores declaram que têm sem interesses financeiros concorrentes.

Neste protocolo, desenvolveu uma nova técnica para o estabelecimento de linhas de células NK/T do sangue inteiro de pacientes CAEBV. Comparado com os métodos existentes, a grande vantagem deste método é sua simplicidade e sua exigência de apenas um pequeno volume de sangue, enquanto que apresenta uma elevada taxa de sucesso e boas condições de viabilidade celular. Além disso, as linhas de células NK/T podem ser estabelecidas por PBMC de cultivo sem determinar os tipos de célula, o EBV Latentemente infectada com antecedên...

Vírus de Epstein - Barr (EBV) é onipresente e infecta não apenas as células B, mas também T e as células killer naturais (NK), que faz com que um número de doenças linfoproliferativas de EBV-associados NK/T (LPD) e linfoma/leucemia, tais como hemofagocítica EBV-associados hemophagocytosis, hydroa vaciniforme, como linfoma, linfoma de células T/NK extranodal, tipo nasal e NK agressiva células leucemia1,2,3. Entre estes é crônica ativa EBV (SCAEBV) doença grave, que é incidente principalmente no leste da Ásia, e que é agora considerado um LPD causada pela expansão clonal de infectadas por EBV T ou NK células4,5,6, 7, mas sem a aparente da imunodeficiência presentes na mononucleose infecciosa (IM)-como sintomas que incluem febre, hepatoesplenomegalia, linfadenopatia e disfunção hepática persistentemente ou periódica, bem como alta EBV-DNA carregar na sangue periférico8,9. Pacientes com CAEBV têm um prognóstico pobre10,11e sua patogênese e desconhece-se o papel do EBV. Portanto, cela linhas derivadas de doenças linfoproliferativas de EBV-associados NK/T e linfomas são muito úteis como modelos de celular para esclarecer o mecanismo de EBV induzida proliferação NK, ou células T e a sua relação com alta incidência de leucemia ou linfoma.
Até à data, foram estabelecidas várias linhagens celulares com diferentes técnicas12,13,14,15,16. Uma linhagem de células NK humana, NK-YS, estabeleceu-se de leucemia/linfoma de células NK, por co cultivo com uma linhagem de células do estroma do rato como alimentador e na presença de rhIL-2 em uma concentração de 20U por mL15. KAI3 era uma outra linha de célula NK estabelecida de pacientes com alergia severa mosquito ou SCAEBV com linha de células autólogas lymphoblastoid (LCL), células B, transformadas por EBV, como células de alimentador e adição de rhIL-2 em 100U/mL16. SNK6 e SNT8 foram derivados de tecidos de tumor da nasais pacientes de linfoma de células NK/T pela adição de altas doses de rhIL-2 (700U/mL)12. Com uma técnica semelhante, a célula de SNK-1 foi de pacientes CAEBV, cultivados de PBMC, removendo as células T e adicionando 700U/mL de rhIL-213,17. SNT13 e SNT15 foram estabelecidas através da remoção de CD4 + e CD8 + células18. Até agora, outras linhas de celular de células T e NK de pacientes EBV-NK/T LPD foram todos desenvolvidas com este método de19.
As desvantagens dos métodos existentes acima mencionados incluem o emprego de células do alimentador, a exigência de uma alta dose de IL-2, a utilização de sangue tanto quanto 10 mL ou a purificação de células NK/T, que é muito desafiador na clínica devido a a necessidade de verificar quais os tipos de célula que EBV Latentemente infecta antes de começar a cultura. Como CAEBV ocorre principalmente em crianças na Ásia, 10 mL sangue não é fácil de adquirir em todas as regiões. Neste estudo, nós desenvolvemos um novo método simples com uma elevada taxa de sucesso para estabelecer linhas NK e/ou células T pelo cultivo PBMC de pacientes CAEBV, usando uma dose baixa de rhIL2 e um volume de 2 mL de sangue total sem células de alimentador. Os resultados deste método provaram sua eficiência elevada e economia de tempo.

<table><tbody><tr><td>Hu HLA-DR FITC</td><td>BD</td><td></td><td>560944 anticorpo para FACS</td></tr><tr><td>Hu CD4 FITC</td><td>BD</td><td></td><td>555346 anticorpo para FACS</td></tr><tr><td>Hu / NHP CD8 PE</td><td>BD</td><td></td><td>557086 anticorpo para FACS</td></tr><tr><td>Hu CD3 PE</td><td>BD</td><td>555340</td><td>anticorpo para FACS</td></tr><tr><td>Hu CD16 FITC 3G8</td><td>BD</td><td>555406</td><td>anticorpo para FACS</td></tr><tr><td>Hu / NHP CD56 PE MY31</td><td>BD</td><td>556647</td><td>anticorpo para FACS</td></tr><tr><td>hu/CD19 PE-Cy7</td><td>BD</td><td>560728</td><td>anticorpo para FACS</td></tr><tr><td>IL-2 humano</td><td>Roche</td><td>11147528001</td><td></td></tr><tr><td>soro humano</td><td>MRC</td><td>CCC118-125</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de CO2</td><td>SANYO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Techcomp</td><td>CT6T</td><td>Microscópio de centrifugação</td></tr><tr><td></td><td>OLYMPUS CKX53</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>Contador de Células Automatizado</td><td>Countstar</td><td>IC 1000</td><td>Para contagem de células</td></tr><tr><td>24 poços cluster de cultura de células</td><td>Corning Incorporated</td><td>3524</td><td>Placas de poliestireno</td></tr><tr><td>25cm2 frasco de cultura de células</td><td>Nest</td><td>707001</td><td>Poliestireno</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>Componente do meio celular</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>life</td><td>22400089</td><td>Para meio celular</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Amresco</td><td>374</td><td>Componente do meio celular</td></tr><tr><td>100 x solução de estreptomicina penicilina BioRoYeeBRY-2309</td><td>BioRoYee</td><td>BRY-2309</td><td>Componente do meio celular</td></tr><tr><td>Ficoll paque plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>Para isolamento in vitro de linfócitos</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>Para congelamento de células</td></tr><tr><td>citômetro de fluxo</td><td>BD</td><td>BD FACSAria II</td><td></td></tr><tr><td>software</td><td>BD</td><td>BD FACSDiva software</td><td>FACS análise FACS</td></tr></tbody></table>

um método simples e eficiente para estabelecer linhas de células t de pacientes com infecção crônica ativa vírus epstein - barr e nk

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

Vários métodos têm sido descritos para estabelecer linhas de células NK/T de pacientes com síndrome de linfoma ou linfoproliferativa. Estes métodos empregados alimentador células, purificado de células NK ou T com tanto quanto 10 mL de sangue ou uma dose elevada de Il-2. Este estudo apresenta um novo método com uma estratégia simples e poderosa para estabelecer linhas NK e células T pelo cultivo do periférico sangue células mononucleares (PBMC) com a adição de Il-2 humana recombinante (rhIL-2) e usa tão pouco quanto 2 mL de sangue total. As células podem proliferar rapidamente em duas semanas e ser mantidas por mais de 3 meses. Com este método, 7 linhas de NK, ou células T se estabeleceram com uma elevada taxa de sucesso. Este método é simples, confiáveis e aplicáveis ao estabelecimento de linhagens celulares de mais casos de linfoma de células CAEBV ou NK/T.

Depois de 3 dias cultura durante o estabelecimento de linhas de células, as células polimórficas começam a aparecer (Figura 2). Após 7 dias, as células crescem rapidamente, como o número e a viabilidade das células aumentam em uma taxa elevada (Figura 3). Pequenos grupos de células são claramente visíveis após 10-14 dias de crescimento, quando a concentração de células pode exceder 3-6 × 106. Neste período, as células ...

Um método simples para a obtenção de clones NK e células T de pacientes CAEBV foi desenvolvido com alta eficiência, uma pequena quantidade de sangue periférico e uma baixa dose de Il-2.

Um método simples e eficiente para estabelecer linhas de células T de pacientes com infecção crônica ativa vírus Epstein - Barr e NK

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

O objetivo geral deste procedimento é obter linhagens de células NK ou T de pacientes com CAEBV, o que tem grande importância para a pesquisa sobre esta doença fatal. Este método ajuda a obter linhagens de células NK ou T para pesquisas sobre o mecanismo de CAEBV, como estudar o VBV bruto na proliferação celular, rastrear inibidores que interferem na proliferação de células NK/T. A principal vantagem desta técnica é que ela é muito simples e eficiente, que requer apenas uma pequena quantidade de sangue periférico e uma baixa dose de ferro dois para estabelecer linhagens de células NK ou T de pacientes com CAEBV.Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades, porque a sobrevivência celular na primeira das duas semanas da cultura é incerta e este método mostrará como determinar a proliferação celular da cultura inicial. Quando tivemos a ideia desse método, descobrimos que o ferro sérico humano dois pode incluir PBMC por até duas semanas. Mostramos que a demonstração desse método é crítica, pois mostra a forma das células e a causa da proliferação.E essa extensão de células e numeração das células Y-bar Para iniciar este procedimento, purifique o PBMC primário de dois mililitros de sangue total de pacientes com CAEBV por centrifugação gradiente. Como alternativa, descongele o PBMC criopreservado de nitrogênio líquido com meio RPMI-1640. Em seguida, adicione dois microlitros de azul de tripano a 18 microlitros de suspensão celular para corar as células por três minutos, depois transfira a suspensão para a placa do contador de células e meça a concentração e viabilidade das células com um contador de células automatizado.Preparar a suspensão celular a uma densidade de duas a três vezes 10 a sextas células por mililitro, suplementada com meio de cultura RPMI-1640 completo contendo 20% de soro humano, dois milimolares de L-glutamina e antibióticos. Em seguida, semeie um mililitro de suspensão de PBMC por poço nas placas de cultura de células de 24 poços. Em seguida, adicione 150 unidades por mililitro de rhIL-2 a cada poço.Coloque as placas de cultura em uma incubadora de 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius. No segundo dia, observe a morfologia celular ao microscópio com ampliação de 200 vezes. As células estão em boas condições quando são brilhantes e redondas.Nesta etapa, adicione dois microlitros de 0,4% de azul de tripano a 18 microlitros de suspensão celular e calcule a concentração das células. Em seguida, observe a morfologia celular e monitore a condição de crescimento celular numerando as células antes de mudar de meio. É importante monitorar a morfologia celular e a condição.Podemos julgar se as células sobrevivem pelas células polimórficas e pela condição das células no estágio inicial de uma cultura. Depois, remova 500 microlitros do meio de cada poço da placa de 24 poços e adicione 500 microlitros de meio de cultura completo fresco a ele. Em seguida, adicione 150 unidades por mililitro de rhIL-2 a cada poço.Troque o meio duas vezes por semana. Trace a curva de crescimento celular. Quando a concentração de células viáveis exceder cinco vezes 10 para a sexta células por mililitro, divida as células em novos poços a uma concentração de uma a duas vezes 10 para a sexta células por mililitro em cada poço.Esse processo leva de duas a quatro semanas. Quando as células se expandirem, colete uma vez 10 a sexta células para determinar os fenótipos das linhagens celulares. Centrifugue-os a 240 vezes g por cinco minutos à temperatura ambiente para precipitar as células NKNT.Depois disso, descarte o sobrenadante, lave a precipitação adicionando sete mililitros de PBS. Centrifugue durante cinco minutos a 240 vezes g à temperatura ambiente. Repita o procedimento mais uma vez, adicione 200 microlitros de soro humano a cada tubo, misture bem e incube por 10 minutos em temperatura ambiente Centrifugue as células a 240 vezes g por cinco minutos em temperatura ambiente.Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células de uma vez 10 a sexta células por mililitro com PBSA frio. Posteriormente, divida as células em cinco tubos, cada um contendo duas vezes 10 elevado a cinco células. Depois disso, centrifugue as células a 240 vezes g por cinco minutos a quatro graus Celsius Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células com tampão PBSA ou PBSA contendo 10 microlitros de PE e 10 microlitros de anticorpos marcados com FITC para corar os receptores celulares de células T ou NK no gelo.As células suspensas com tampão PBSA são usadas como controle negativo. Em seguida, incube as células com anticorpos por 20 a 30 minutos no gelo no escuro. Lave as células duas vezes com PBSA frio e ressuspenda as células com 300 microlitros de PBSA frio antes da análise com o citômetro de fluxo.Quando a análise do fenótipo celular estiver concluída, remova cuidadosamente metade do sobrenadante e evite tocar nas células na parte inferior da placa. Adicione o mesmo volume de meio de cultura fresco contendo rhIL-2 a 300 unidades por mililitro às placas e, em seguida, troque metade do meio a cada três dias até que os aglomerados de células sejam claramente visíveis ao microscópio. Depois disso, transfira as células das placas de 24 poços para frascos de cultura T-25 após misturar diferentes poços da mesma linhagem.Dobre o volume do meio de cultura à medida que ele fica amarelo até que o volume do meio se expanda para 10 a 15 mililitros. Em seguida, adicione rhIL-2 com uma concentração de 150 unidades por mililitro. Troque o meio 24 horas antes do congelamento após duas a três semanas de crescimento, quando a massa celular pode ser observada a olho nu.Meça a concentração de células com o contador de células. Em seguida, centrifugue a suspensão celular por cinco minutos a 240 vezes g e ressuspenda o pellet celular a uma densidade de cinco a 10 vezes 10 a sextas células por mililitro com a solução de estoque congelada que contém 90% de soro fetal bovino e 10% de DMSO. Congele-o a uma taxa de um grau Celsius por minuto a menos 80 graus Celsius e, em seguida, transfira diretamente para nitrogênio líquido.Após três dias de cultura durante o estabelecimento das linhagens celulares, as células polimórficas começam a aparecer. Após sete dias, as células crescem rapidamente à medida que o número e a viabilidade das células aumentam a uma taxa alta. Pequenos aglomerados de células são claramente visíveis após 10 a 14 dias de crescimento, quando a concentração celular excede três a seis vezes 10 elevado a sexto.Nesse período, as células devem ser expandidas por divisão em dois ou três poços da placa de cultura. Cerca de um mês depois, quando o número de células atinge de três a cinco vezes 10 elevado a sétimo, a contagem é alta o suficiente para preservação. Outra questão importante é determinar os fenótipos após as células terem sido cultivadas com sucesso.Nossos resultados indicam que as células T e NK podem ser cultivadas pelo método descrito acima e as linhagens celulares podem ser estabelecidas com essa técnica, pois as células cresceram mais de três meses em boas condições. Esse método, essa técnica, pode ser feito ainda mais. É fácil de executar corretamente.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter a variabilidade do PBMC. Para este procedimento, qualquer método, como o kit de ensaio MTT 8, pode ser realizado para responder a perguntas adicionais, como a toxicidade das linhagens de células NK ou T que podem ser usadas para imunoterapia adotiva. Após cada desenvolvimento, esta técnica abre caminho para que pesquisadores da área de CAEBV explorem mecanismos de NK/T associados ao EBV que envolvem doenças operatórias no sistema de modelo celular.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como estabelecer e expandir as linhas de células NK e T seguindo este protocolo. Não se esqueça de que trabalhar com um patógeno pode ser extremamente perigoso e sempre devem ser tomadas precauções ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Um protocolo rápido, simples e de baixo custo para a geração de doador-derivado multivirus específico CTLs (rctl) para infusão de células-tronco hematopoéticas alogênico transplante (TCTH) destinatários em risco de desenvolver infecções CMV, EBV ou Adv. Este processo de fabricação é compatível com GMP e deve garantir a mais ampla implementação de T-cell imunoterapia além de centros especializados.

Geração de células T específicas Multivirus para Prevenir / tratar infecções virais após transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico

Nós descrevemos um método para gerar linhas B transformada célula usando vírus Epstein-Barr. Nós também ilustrar um ensaio de romance que pode identificar as células B destinados a sofrer transformações logo aos três dias após a infecção.

Estabelecimento de Epstein-Barr Virus Crescimento transformada linhagens de células linfoblastóides

Aqui descrevemos a prática de fabricação primeiro (BPF) compatível com método de produção de vírus específicos linfócitos T citotóxicos (CTL) de sangue de cordão umbilical, fonte de células T predominantemente ingênua.

Expandindo linfócitos T citotóxicos do sangue do cordão umbilical que citomegalovírus Target, vírus de Epstein-Barr, e Adenovirus

Source: Xu, C., et al. An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection. J. Vis. Exp. (2018).This video demonstrates the phenotyping of EBV-infected T and NK cell lines using flow cytometry, highlighting the preparation, antibody staining, and analysis steps to identify lineage-specific surface markers. It shows how marker profiles confirm distinct T-cell and NK-cell populations.

Phenotyping EBV-Infected Cell Lines Using Flow Cytometry

Sarcoma de Kaposi (KS) é um tumor induzido por infecção pelo herpesvírus oncogênicos vírus humano herpesvírus-8/KS (HHV-8/KSHV). O modelo de cultura de células endoteliais descrito aqui é especialmente adequado para estudar os mecanismos pelos quais KSHV transforma células hospedeiras.

Um modelo In Vitro para o estudo transformação celular por Herpesvirus Sarcoma de Kaposi

Um método simples de lise de glóbulos vermelhos para o estabelecimento de B-LCLS foi desenvolvido com alta eficiência de imortalização, requerendo uma pequena quantidade de sangue e de economia de tempo desde a iniciação à criopreservação.

Um glóbulo vermelho simples método de lise para o estabelecimento de linhas celulares linfoblastóides B

Aqui são descritos métodos usados para estudar o efeito funcional das mutações RYR1 expressas endógenamente no Vírus Epstein Barr, linfócitos B humanos e células de satélite derivadas da biópsia muscular diferenciadas em miótubos.

Caracterização funcional de variantes ryr1 humanas expressas e endógenas

Aqui, apresentamos um método para expandir o natural killer do sangue periférico (PBNK), células NK de tecidos hepáticos e células do receptor de antígeno quimérico (CAR)-NK derivadas de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) ou sangue do cordão umbilical (CB). Este protocolo demonstra a expansão das células NK e CAR-NK usando células alimentadoras de 221-mIL-21, além da pureza otimizada das células NK expandidas.

Natural Killer (NK) e Método de Expansão Celular CAR-NK usando a Linha Celular B Modificada por IL-21 Ligada à Membrana

Descrevemos um método que combina contas imunomagnéticas e classificação de células ativadas por fluorescência para isolar e analisar subpopulações de células imunes definidas de células mononucleares do sangue periférico (monócitos, células T CD4 + , células T CD8 + , células B e células natural killer). Usando este método, as células magnéticas e fluorescentemente marcadas podem ser purificadas e analisadas.

Separação de subpopulações de células imunes em amostras de sangue periférico de crianças com mononucleose infecciosa

Este protocolo permite o isolamento de partículas do vírus Epstein-Barr da linhagem celular humana P3HR1 ao induzir o ciclo lítico viral com 12-miristato de forbol 13-acetato. O DNA é subsequentemente extraído da preparação viral e submetido a PCR em tempo real para quantificar a concentração de partículas virais.

Isolamento e quantificação do vírus Epstein-Barr a partir da linhagem celular P3HR1

Aprenda a estabelecer linhas de células NK e T de pacientes com infecção crônica ativa pelo vírus Epstein-Barr usando sangue periférico e baixa dose de IL-2. Este método simples e eficiente facilita pesquisas sobre mecanismos da doença.

Um método simples e eficiente para estabelecer linhas de células T de pacientes com infecção crônica ativa vírus Epstein - Barr e NK (Vídeo) | JoVE Journal

Um método simples e eficiente para estabelecer linhas de células T de pacientes com infecção crônica ativa vírus Epstein - Barr e NK

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