Um método simples e eficiente para estabelecer linhas de células T de pacientes com infecção crônica ativa vírus Epstein - Barr e NK

O objetivo geral deste procedimento é obter linhagens de células NK ou T de pacientes com CAEBV, o que tem grande importância para a pesquisa sobre esta doença fatal. Este método ajuda a obter linhagens de células NK ou T para pesquisas sobre o mecanismo de CAEBV, como estudar o VBV bruto na proliferação celular, rastrear inibidores que interferem na proliferação de células NK/T. A principal vantagem desta técnica é que ela é muito simples e eficiente, que requer apenas uma pequena quantidade de sangue periférico e uma baixa dose de ferro dois para estabelecer linhagens de células NK ou T de pacientes com CAEBV.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades, porque a sobrevivência celular na primeira das duas semanas da cultura é incerta e este método mostrará como determinar a proliferação celular da cultura inicial. Quando tivemos a ideia desse método, descobrimos que o ferro sérico humano dois pode incluir PBMC por até duas semanas. Mostramos que a demonstração desse método é crítica, pois mostra a forma das células e a causa da proliferação.

E essa extensão de células e numeração das células Y-bar Para iniciar este procedimento, purifique o PBMC primário de dois mililitros de sangue total de pacientes com CAEBV por centrifugação gradiente. Como alternativa, descongele o PBMC criopreservado de nitrogênio líquido com meio RPMI-1640. Em seguida, adicione dois microlitros de azul de tripano a 18 microlitros de suspensão celular para corar as células por três minutos, depois transfira a suspensão para a placa do contador de células e meça a concentração e viabilidade das células com um contador de células automatizado.

Preparar a suspensão celular a uma densidade de duas a três vezes 10 a sextas células por mililitro, suplementada com meio de cultura RPMI-1640 completo contendo 20% de soro humano, dois milimolares de L-glutamina e antibióticos. Em seguida, semeie um mililitro de suspensão de PBMC por poço nas placas de cultura de células de 24 poços. Em seguida, adicione 150 unidades por mililitro de rhIL-2 a cada poço.

Coloque as placas de cultura em uma incubadora de 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius. No segundo dia, observe a morfologia celular ao microscópio com ampliação de 200 vezes. As células estão em boas condições quando são brilhantes e redondas.

Nesta etapa, adicione dois microlitros de 0,4% de azul de tripano a 18 microlitros de suspensão celular e calcule a concentração das células. Em seguida, observe a morfologia celular e monitore a condição de crescimento celular numerando as células antes de mudar de meio. É importante monitorar a morfologia celular e a condição.

Podemos julgar se as células sobrevivem pelas células polimórficas e pela condição das células no estágio inicial de uma cultura. Depois, remova 500 microlitros do meio de cada poço da placa de 24 poços e adicione 500 microlitros de meio de cultura completo fresco a ele. Em seguida, adicione 150 unidades por mililitro de rhIL-2 a cada poço.

Troque o meio duas vezes por semana. Trace a curva de crescimento celular. Quando a concentração de células viáveis exceder cinco vezes 10 para a sexta células por mililitro, divida as células em novos poços a uma concentração de uma a duas vezes 10 para a sexta células por mililitro em cada poço.

Esse processo leva de duas a quatro semanas. Quando as células se expandirem, colete uma vez 10 a sexta células para determinar os fenótipos das linhagens celulares. Centrifugue-os a 240 vezes g por cinco minutos à temperatura ambiente para precipitar as células NKNT.

Depois disso, descarte o sobrenadante, lave a precipitação adicionando sete mililitros de PBS. Centrifugue durante cinco minutos a 240 vezes g à temperatura ambiente. Repita o procedimento mais uma vez, adicione 200 microlitros de soro humano a cada tubo, misture bem e incube por 10 minutos em temperatura ambiente Centrifugue as células a 240 vezes g por cinco minutos em temperatura ambiente.

Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células de uma vez 10 a sexta células por mililitro com PBSA frio. Posteriormente, divida as células em cinco tubos, cada um contendo duas vezes 10 elevado a cinco células. Depois disso, centrifugue as células a 240 vezes g por cinco minutos a quatro graus Celsius Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células com tampão PBSA ou PBSA contendo 10 microlitros de PE e 10 microlitros de anticorpos marcados com FITC para corar os receptores celulares de células T ou NK no gelo.

As células suspensas com tampão PBSA são usadas como controle negativo. Em seguida, incube as células com anticorpos por 20 a 30 minutos no gelo no escuro. Lave as células duas vezes com PBSA frio e ressuspenda as células com 300 microlitros de PBSA frio antes da análise com o citômetro de fluxo.

Quando a análise do fenótipo celular estiver concluída, remova cuidadosamente metade do sobrenadante e evite tocar nas células na parte inferior da placa. Adicione o mesmo volume de meio de cultura fresco contendo rhIL-2 a 300 unidades por mililitro às placas e, em seguida, troque metade do meio a cada três dias até que os aglomerados de células sejam claramente visíveis ao microscópio. Depois disso, transfira as células das placas de 24 poços para frascos de cultura T-25 após misturar diferentes poços da mesma linhagem.

Dobre o volume do meio de cultura à medida que ele fica amarelo até que o volume do meio se expanda para 10 a 15 mililitros. Em seguida, adicione rhIL-2 com uma concentração de 150 unidades por mililitro. Troque o meio 24 horas antes do congelamento após duas a três semanas de crescimento, quando a massa celular pode ser observada a olho nu.

Meça a concentração de células com o contador de células. Em seguida, centrifugue a suspensão celular por cinco minutos a 240 vezes g e ressuspenda o pellet celular a uma densidade de cinco a 10 vezes 10 a sextas células por mililitro com a solução de estoque congelada que contém 90% de soro fetal bovino e 10% de DMSO. Congele-o a uma taxa de um grau Celsius por minuto a menos 80 graus Celsius e, em seguida, transfira diretamente para nitrogênio líquido.

Após três dias de cultura durante o estabelecimento das linhagens celulares, as células polimórficas começam a aparecer. Após sete dias, as células crescem rapidamente à medida que o número e a viabilidade das células aumentam a uma taxa alta. Pequenos aglomerados de células são claramente visíveis após 10 a 14 dias de crescimento, quando a concentração celular excede três a seis vezes 10 elevado a sexto.

Nesse período, as células devem ser expandidas por divisão em dois ou três poços da placa de cultura. Cerca de um mês depois, quando o número de células atinge de três a cinco vezes 10 elevado a sétimo, a contagem é alta o suficiente para preservação. Outra questão importante é determinar os fenótipos após as células terem sido cultivadas com sucesso.

Nossos resultados indicam que as células T e NK podem ser cultivadas pelo método descrito acima e as linhagens celulares podem ser estabelecidas com essa técnica, pois as células cresceram mais de três meses em boas condições. Esse método, essa técnica, pode ser feito ainda mais. É fácil de executar corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter a variabilidade do PBMC. Para este procedimento, qualquer método, como o kit de ensaio MTT 8, pode ser realizado para responder a perguntas adicionais, como a toxicidade das linhagens de células NK ou T que podem ser usadas para imunoterapia adotiva. Após cada desenvolvimento, esta técnica abre caminho para que pesquisadores da área de CAEBV explorem mecanismos de NK/T associados ao EBV que envolvem doenças operatórias no sistema de modelo celular.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como estabelecer e expandir as linhas de células NK e T seguindo este protocolo. Não se esqueça de que trabalhar com um patógeno pode ser extremamente perigoso e sempre devem ser tomadas precauções ao realizar este procedimento.