Name: Um protocolo para Decellularizing Cochleae Mouse para engenharia de tecidos do ouvido interno (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Aprenda a descelularizar e descalcificar cócleas de camundongo para engenharia de tecidos do ouvido interno. Este método permite estudar interações celulares com a matriz extracelular e formação do epitélio sensorial.

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O projeto atual foi financiado pela Universidade de Kansas prova de conceito de fundo. Gostaríamos de agradecer a equipe de enfermagem no KUMC (Kansas City, KS) para nos auxiliar na obtenção de humanos cordões umbilicais e David Jorgensen para ajudar com culturas cochleae.

Todos os procedimentos, incluindo a eutanásia de animais, foram conduzidos de acordo com o cuidado de Animal institucional e uso Comité (IACUC) protocolo aprovado (cálice #2014-2234) da Universidade de Kansas Medical Center (KUMC).
Nota: HWJCs foram isoladas de humanos cordões umbilicais que foram doados pelos pacientes que forneceram consentimento informado e as amostras foram utilizadas em conformidade com os protocolos aprovados pelo Comité de assuntos humanos da Universidade de Kansas (KU-IRB #15402).
1. osso Temporal colheita e isolamento da cóclea
<ol>
	<li>Decapitar um rato apropriadamente sacrificado, 15 semanas cortando entre o crânio e a primeira vértebra cervical com uma afiada tesoura cirúrgica e, em seguida, pulverizar a cabeça com etanol a 70% para desinfetar (figura 1A).</li>
	<li>Bissetriz do crânio em um médio sagital usando o mesmo par afiado de uma tesoura cirúrgica (figura 1B-C, linhas tracejadas).</li>
	<li>Remova o tecido cerebral do crânio utilizando um par de pinças (Figura 1, ponta de seta).</li>
	<li>Identifica o osso temporal através da presença do auditivo e o nervo vestibular raízes (Figura 1E-F, pontas de seta) no interior do crânio e do canal auditivo do exterior (Figura 1F, seta). Corte com cuidado através do crânio para isolar o osso temporal do resto do crânio (Figura 1). Nota: Em alguns casos, pode ser possível intrometer-se delicadamente os circundantes ossos do crânio longe do osso temporal sem a necessidade de corte.</li>
	<li>Insira a pinça bem a abertura do canal auditivo aproximadamente 5 mm (Figura 1 H), então as dicas não arrisque puncionando a cóclea. Suavemente quebrar o osso do bulla (Figura 1 H, top vermelha área sombreada) então ele fraturas (linhaFigura 1I, vermelha pontilhada). Nota: Se necessário, um microscópio de dissecação pode ajudar neste processo para garantir a colocação exata e manipulação de instrumentos.</li>
	<li>Usando a pinça fina, embora bisbilhotar o restante o bulla do osso temporal, expondo o labirinto ósseo da cóclea (Figura 1J, suportes de vermelhos).</li>
	<li>Coloque um prato de Petri grande o suficiente para segurar o osso temporal (por exemplo, 30 mm ou maior) por baixo da dissecação campo de visão do escopo e preenchê-lo com suficiente fosfato tamponado salino (PBS) para cobrir o osso temporal (por exemplo, 0,5 a 1 mL).</li>
	<li>Mergulhe no osso temporal com o bulla removido na PBS com as janelas ovais e redondas da cóclea virada para cima. Nota: A remoção do sistema vestibular da cóclea não é necessária, como o sistema vestibular serve bem como um identificador para a manipulação e orientando recursos da cóclea (Figura 1I e Figura 2B).</li>
	<li>Usando um par de microfuros de fórceps, remova a artéria estapédica, que atravessa o estribo.</li>
	<li>Inserir uma ponta da pinça ultra fina através do arco do estribo onde passou a artéria e delicadamente Levante o estribo para cima. O estribo desarticulado deve levantar fora a janela oval.</li>
	<li>Usando uma ponta da pinça ultra fina, fure o oval e redonda windows.</li>
	<li>Usar um 1X PBS preenchido 28,5 calibre seringa com tubo (diâmetro interno de 0,28 mm, diâmetro externo 0,61 mm) anexada, posicione o tubo sobre a janela oval (Figura 2A -B). Nota: A abertura do tubo pode ser manipulada usando fórceps ultra-fina, ajudando a garantir a colocação exata.<ol>
		<li>Use uma seringa fresca e tubulação para cada cóclea.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Perfundir 2ml de 10%-antibiótico antimicótico (anti-anti) e 10% penicilina-estreptomicina (pen-estreptococos) em PBS através da cóclea mais 5 min para remover a perilinfa. Perfusing muito rápido com muita pressão danificará as belas estruturas dentro da cóclea. Nota: Manualmente, dirigindo a seringa com a mão para perfundir o fluido através da cóclea é eficaz, embora uma bomba de perfusão pode ser usada como uma alternativa.<ol>
		<li>Se perfusing manualmente, use um par de bem, fecho automático fórceps para estabilizar a cóclea (Figura 2A) durante a perfusão, agarrando-se a porção vestibular do osso temporal. Nota: Embora não seja obrigatório, isto deixa ambas as mãos livres para lidar com instrumentos; uma mão pode conduzir a seringa (Figura 2A), enquanto o outro pode posicionar o tubo adequadamente (Figura 2B).</li>
		<li>Desta etapa da frente, tome cuidado para evitar expor a cóclea desnecessariamente ao ar. Introdução de bolhas de ar nos espaços fluidos irá bloquear a circulação do fluido, e mais a secar irá danificar as belas estruturas dentro da cóclea.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Remover e descartar qualquer restantes fragmentos de tecidos e ossos de músculo usando pinça fina.</li>
	<li>Se necessário, armazene cochleae isolado a 4 ° C em anti-anti 10% e 10% solução de caneta-estreptococos em PBS durante sete dias com mudanças regulares de solução antibiótica cada 48 h.</li>
</ol>
2. coclear processamento
<ol>
	<li>Decellularization
	<ol>
		<li>Para cada cóclea, encha um frasco de cintilação de vidro de 20 mL com um 1% de sódio Dodecil sulfato solução (SDS) em água deionizada (DI), que é usada para decellularize a cóclea.</li>
		<li>Corte a ponta de uma pipeta de transferência de 7 mL plástico usando uma lâmina de barbear, de modo que a abertura é grande o suficiente para uma cóclea a passagem.</li>
		<li>Com a pipeta de transferência suavemente elaborar a cóclea na pipeta então só passa por alguns milímetros da borda de corte.</li>
		<li>Expulse da cóclea para o frasco de solução cintilação SDS 1%.</li>
		<li>Circule de 2 mL de SDS 1% em água desionizada de (DI) através da cóclea no frasco de cintilação, com uma pipeta de transferência.</li>
		<li>Coloque o frasco de cintilação em rotacao e permitir que o frasco de cintilação girar a 10 rpm para 72 h à temperatura ambiente.<ol>
			<li>Altere a solução de SDS 1% cada 24 h ao longo de um período de 72 h. Tenha cuidado quando alterar SDS para Nunca exponha a cóclea ao ar.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Lave a cóclea três vezes por 30 min cada com água.</li></ol></li></ol>Executar as lavagens no frasco de cintilação mesma usado para as acusações de SDS; nesta fase, a cóclea é decellularized.
	
	
	<li>Descalcificação
	<ol>
		<li>Remova a água restante do DI o frasco de cintilação, deixando apenas o suficiente para manter a cóclea submergida.</li>
		<li>Para começar a descalcificação, adicione 5 mL de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (0,02 M) a 10% em água para o frasco de cintilação que contém a cóclea.</li>
		<li>Circule de 2 mL de EDTA 10% em água DI através da cóclea no frasco de cintilação, com uma pipeta de transferência.</li>
		<li>Coloque o frasco de cintilação no rotador e permitir que o frasco de cintilação girar a 10 rpm para 72 h à temperatura ambiente. Altere a solução de EDTA 10% cada 24 h ao longo de um período de 72 h. Tenha cuidado quando alterar soluções para que a cóclea não é exposta ao ar.</li>
		<li>Enxágue a cóclea 3 vezes durante 2 h com PBS 1x; nesta fase, a cóclea é descalcificada.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Armazenamento
	<ol>
		<li>Armazenar os cochleae por até 72 h em uma solução 10% anti-anti, 10% caneta-estreptococos em PBS a 4 ° C. Nota: Os períodos de armazenamento podem ser possíveis com mudanças regulares de solução antibiótica; no entanto, armazenagem prolongada de cochleae transformados não foi validada neste protocolo.</li>
	</ol>
	</li>

3. a colheita e a expansão de hWJCs
<ol>
	<li>Isole o hWJCs de acordo com protocolos previamente publicados22. Brevemente, segmento cordões umbilicais em seções de 3 cm.</li>
	<li>Com cuidado faça uma incisão superficial com um bisturi longitudinalmente em cada segmento de cordão umbilical para desenrolar e expor a geleia de Wharton, do cordão umbilical. Use a pinça para remover os vasos sanguíneos.</li>
	<li>Lave o cordão umbilical segmentos duas vezes com suficiente PBS (por exemplo, 40 mL em uma placa de Petri de 60 mm) para submergir o tecido. Picar finamente segmentos de tecido com um bisturi. Digerir o tecido em uma placa de Petri com 50 mL de meio de digestão de 100mm (colagenase tipo 2 de 0,2%, 1% penicilina-estreptomicina, em baixo-glicose médio (DMEM modificado águia de Dulbecco)).</li>
	<li>Coloque o tecido em digerir médio em um agitador orbital a 50 rpm durante a noite em um 5% CO2, incubadora 37 ° C. No dia seguinte, diluir meio digestão na proporção de 01:16 em 2% antibiótico antimicótico em PBS, pelota e células por centrifugação a 500 x g à temperatura ambiente (~ 27 ° C) por 10 min. Discard sobrenadante.</li>
	<li>Resuspenda pelotas em Mesenchymal Stem Cell crescimento médio (MSCGM) e recombinar as células. Células de placa em uma densidade de 7 x 103 células/cm2 em cultura de tecidos trataram frascos de T-75. Cultura HWJCs em MSCGM e expandir a passagem 5 para experimentos. Nota: HWJCs pode ser sub cultivadas em T-frascos maiores (p. ex., T-150, T-300) quando a passagem para aumentar o rendimento de hWJCs para experimentos.</li>
</ol>
4. infusão de hWJCs em Decellularized Cochleae
<ol>
	<li>Preparar cochleae decellularized
	<ol>
		<li>Utilizando técnica asséptica, lave cochleae armazenado em 1X PBS três vezes para 30 min cada.</li>
		<li>Transferir cochleae em separado poços de uma placa de 24 e adicionar 1 mL de 37 ° C pré aquecido MSCGM.</li>
		<li>Incube cochleae em um 5% CO2, incubadora de cultura de célula de 37 ° C por um período mínimo de 1 h antes da infusão de células.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dissociar a hWJCs e ressuspender
	<ol>
		<li>HWJCs de lavagem com 37 ° C pré aquecido 1X PBS duas vezes.</li>
		<li>Adicionar suficiente 37 ° C pré aquecido tripsina com 0,5% de EDTA para cobrir a superfície do vaso de célula.</li>
		<li>Incube a hWJCs para até 5 min em um 5% CO2, incubadora de cultura de células de 37 ° C.<ol>
			<li>Verifique-se que 90% das células ter retirado a superfície de cultura de células exibindo células sob um microscópio invertido. Nota: As células que se movem quando o navio de cultura suavemente é aproveitado, tem destacado. As células que permanecem estacionárias, não ter destacado.</li>
			<li>Bata levemente os lados do balão para desalojar mais células anexadas.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>HWJCs transferência do navio cultura para um tubo cônico de 50 mL, contendo uma quantidade equivalente de MSCGM para o volume de tripsina utilizando técnica asséptica, usado para dissociar as células.</li>
		<li>O hWJCs de pelotas por centrifugação a 500 x g, à temperatura ambiente (~ 27 ° C) por 5 min.</li>
		<li>Aspire o sobrenadante e ressuspender o hWJCs em MSCGM em uma concentração de 500.000 células/mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Perfundir cochleae
	<ol>
		<li>Transferência cochleae para uma nova placa de 24 usando uma pipeta de transferência.</li>
		<li>Adicione uma gota de MSCGM para cada cóclea para impedir qualquer cóclea desseque.</li>
		<li>Delicadamente, Oriente a cóclea usando fórceps ultra fino, de modo que as janelas ovais e redondas estão virada para cima. Nota: Tenha muito cuidado ao manusear diretamente cada cóclea cóclea é facilmente marcado.</li>
		<li>Utilizando uma seringa de insulina estéril de 28,5 mm com tubos conectados, elaborar 0,2 mL resuspended hWJCs (100.000 células).</li>
		<li>Usando a pinça bem esterilizada, posicione tubulação sobre a janela oval.</li>
		<li>Delicada e lentamente perfundir a cóclea com 0,2 mL de ressuspensão hWJCs utilizando uma seringa de insulina 28,5 mm conectada à tubulação de polietileno (diâmetro exterior: 0,61 mm, diâmetro interno: 0,28 mm) ao longo de cerca de 5 min.</li>
		<li>Após a perfusão, adicionar 0,8 mL de 37 ° C pré aquecido MSCGM para o bem que contém a cóclea para trazer o volume total no poço de 1 mL.</li>
		<li>Repita as etapas 4.3.3-4.3.7 para cada cóclea, utilizando uma seringa de fresca e tubos cada vez.</li>
		<li>Lugar perfundidos cochleae em um 5% CO2, incubadora de cultura de células de 37 ° C e mudança mídia três vezes por semana.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. preservação e colheita de cóclea
Nota: Cochleae podem ser cultivadas e colhidas em qualquer ponto do tempo de post-perfusão de até 30 dias.
<ol>
	<li>Para preservar os cochleae, corrigir em paraformaldeído 4% em 1X PBS durante a noite a 4 ° C, em uma plataforma de balanço.</li>
	<li>Após a fixação, lave cochleae com PBS 1x, três vezes por 5 min cada.</li>
	<li>Gradualmente, desidratar a cóclea com etanol e limpar com um solvente Hidrocarboneto alifático antes de incorporação em parafina.</li>
	<li>Secção de amostras a uma espessura de 10 µm usando um micrótomo e montar em vidro corrediças do microscópio. Nota: As amostras agora estão prontas para histológica ou imuno-histoquímica de processamento usando protocolos padrão.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Temos com sucesso demonstrado que células cocleares nativas podem ser removidas da cóclea através de um processo de decellularization, que permite a utilização da cóclea como um andaime de tecido tridimensional, intrincado. Santi et al. 15 desenvolveu o método inicial para decellularizing cochleae e estimaram com precisão os volumes de muitas estruturas cocleares através com o auxílio de microscopia de luz folha23. Tal trabalho inicial serviu como uma base forte pa...

A cóclea é uma estrutura espiral intrincado encontrada no osso temporal. Ele é composto de um labirinto ósseo exterior e interior, concêntricos labirinto membranoso1. O labirinto membranoso é composto por três espaços fluidos: Scala vestibuli, Scala Scala tympani1e mídia. A mídia scala abriga o epitélio sensorial, que é composto de uma infinidade de tipos de células, mas as células sensoriais de cabelo (HC), que transduce energia mecânica em ondas sonoras para impulsos nervosos2, são de particular interesse. Exposição ao trauma acústico3,4,5, medicação6, doença7,8e envelhecimento9 tudo o que pode resultar em insuficiência auditiva através da morte HC. Perda de cabelo celular em mamíferos é permanente, ao contrário de HCs aviária, que podem se regenerar após lesão10.
Uma variedade de esforços de pesquisa contemporânea procuraram restaurar perdidos HCs, embora as abordagens experimentais específicas variam. Manipulação da expressão do gene no epitélio sensorial e implante de células-tronco diferenciadas fora do corpo são abordagens dominantes no campo, apesar de tem sido métodos de indução que buscam diferenciar as células-tronco em organoids coclear tentativa de11,12,13. Cada uma dessas abordagens é também dependente diretamente as células-tronco, ou as pistas do desenvolvimento, usadas por células-tronco; no entanto, um segundo compartilhados, e potencialmente crítico, o elemento é o ECM da cóclea em si14,15.
O ECM não só fornece suporte físico para as células e tecidos, que inclui uma superfície de adesão celular, sobrevivência, proliferação e migração, mas também tem um papel crítico no desenvolvimento de HCs e a espiral do gânglio15,16 ,17. Naturalmente ocorrendo ECM fornece sinais indutivos que podem orientar a determinação do fenótipo celular e/ou18, de adesão, proliferação e sobrevivência celular. Consequentemente, o uso da cóclea decellularized em combinação com hWJCs cultivadas oferecem uma oportunidade única de explorar o papel da regeneração ECM e HC. HWJCs são um tipo de célula prontamente disponível, sem controvérsias, isolado de humanos cordões umbilicais que se comportar como células-tronco mesenquimais19. HWJCs tem demonstrado a capacidade de diferenciar-se abaixo de20,de linhagens de célula marcante21. Assim, o atual protocolo detalha o isolamento, decellularization e perfusão de cochleae de carcaças de rato C57BL com hWJCs para engenharia de tecidos do ouvido interno.

<table><tbody><tr><td>Centrífuga Allegra X-14R</td><td>Beckman-Coulter</td><td>B08861</td><td></td></tr><tr><td>Tubulação Semi-Rígida Intramédica</td><td>Becton Dickinson</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Innova 2000 Orbital Shaler</td><td>Eppendorf</td><td>M1190-0002</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Cirúrgica</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Fina</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>11370-40</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Ultra-Fina</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>18155-13</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Cônicos de 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565271</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB087579B</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de Insulina U-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-1B</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de Cintilação Fisher</td><td>Scientific</td><td>03-341-73</td><td></td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Fisher Scientific</td><td>88-861-049</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de Transferência</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-170-404</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de Barbear</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-240-062</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>Placa</td> <td>de 24 PoçosLâminas</td> de Microscópio de Vidro SuperFrost PLUS da Fisher Scientific <td>07-200-84</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Pipeta de Transferência Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>22-170-404</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant com DAPI</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Clear-Rite 3</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-046341</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de CO2 Thermo Scientific Forma Series II 3110</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-998-078</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Crescimento de Células-Tronco Mesenquimais</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Lonza</td><td>CC-3232</td><td></td></tr><tr><td>TPP T-75 Frasco de Cultura</td><td>MidSci</td><td>TP90076</td><td></td></tr><tr><td>TPP T-150 Frasco de Cultura</td><td>MidSci</td><td>TP90151</td><td></td></tr><tr><td>TPP T-300 Frasco de Cultura MidSci</td><td></td><td>TP90301</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de Dissecção</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ts2R-FL Microscópio Invertido</td><td>Nikon Instruments</td><td>MFA51010</td><td></td></tr><tr><td>NuAire Classe II, Tipo A2 Gabinete de Biossegurança</td><td>NuAire</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Solução SDS 1%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>436143-100G</td><td></td></tr><tr><td>10% EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

um protocolo para decellularizing cochleae mouse para engenharia de tecidos do ouvido interno

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

Nos mamíferos, mechanosensory células ciliadas que facilitam a falta de audiência a capacidade de regenerar, que limitou a tratamentos para perda auditiva. Estratégias atuais de medicina regenerativa concentraram-se no transplante de células-tronco ou manipulação genética de em torno de células de suporte na orelha interna para incentivar a substituição de células-tronco danificadas para corrigir a perda de audição. Ainda, a matriz extracelular (ECM) pode desempenhar um papel fundamental na indução e manutenção da função das células de cabelo e não tem sido suficientemente estudada. Usando o coclear ECM como um andaime para cultivar células-tronco adultas pode fornecer insights exclusivos sobre como a composição e arquitetura do ambiente extracelular aids células em sustentar a função auditiva. Aqui nós apresentamos um método para isolar e decellularizing cochleae de ratos para usar como andaimes aceitando perfundidas células-tronco adultas. O protocolo atual, cochleae são isolados da eutanásia de ratos, decellularized e descalcificadas. Depois, células de geleia humana da Wharton (hWJCs) que foram isoladas a partir do cordão umbilical foram cuidadosamente pintadas em cada cóclea. Os cochleae foram usados como biorreatores, e as células foram cultivadas por 30 dias antes de sofrer a transformação para análise. Decellularized cochleae mantidos identificáveis estruturas extracelulares, mas não revelou a presença de células ou fragmentos visíveis de DNA. Células perfundidas na cóclea invadiram a maior parte do interior e exterior da cóclea e cresceram sem incidentes em uma duração de 30 dias. Assim, o método atual pode ser usado para estudar como coclear ECM afeta células desenvolvimento e comportamento.

Usando os métodos apresentados aqui, sucesso decellularization de cochleae foi avaliado examinando-se a presença ou ausência de DNA através de 4', coloração 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Cochleae foram considerados totalmente decellularized, se o DNA não foi identificado dentro da cóclea decellularized. Uma cóclea nativa de uma experiência anterior que não passam por decellularization ou descalcificação foi usada como controle positivo para ilustrar as estruturas e células tradiciona...

O objetivo do presente protocolo é demonstrar um método eficaz para decellularize e descalcificar cochleae rato para utilização como andaimes para aplicações de engenharia de tecidos.

Um protocolo para Decellularizing Cochleae Mouse para engenharia de tecidos do ouvido interno

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar um método eficaz para descelularizar e descalcificar cócleas de camundongos para usar um andaime para aplicações de engenharia de tecidos do ouvido interno. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da engenharia auditiva e de tecidos, como, por exemplo, como a cóclea 3D e vários componentes da matriz extracelular influenciam a diferenciação das células-tronco? A principal vantagem dessa técnica é que ela permite ao pesquisador estudar como as células interagem diretamente com a matriz extracelular da cóclea para formar o epitélio sensorial.A demonstração visual desse método é crítica, pois o isolamento do osso temporal e o aparato de profusão celular podem ser difíceis de visualizar corretamente com base apenas em descrições de texto. Para iniciar este procedimento, corte o crânio no plano sagital mediano usando uma tesoura cirúrgica afiada. Em seguida, remova o tecido cerebral do crânio.Em seguida, identifique o osso temporal através da presença das raízes nervosas auditivas e vestibulares no interior do crânio e do canal auditivo do exterior. Corte cuidadosamente o crânio para isolar o osso temporal do restan

a-protocol-for-decellularizing-mouse-cochleae-for-inner-ear-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Imagens ao vivo da cóclea de mamíferos embrionária é um desafio porque os processos de desenvolvimento na mão operam em um gradiente temporal, ao longo de dez dias. Aqui é apresentado um método para a cultura e, em seguida, imagiologia embrionário tecido de explante da cóclea retirado de um rato repórter fluorescente ao longo de cinco dias.

Longo prazo Time Lapse Imagem do mouse cocleares explantes

Apresentamos um método que descreve o isolamento e a cultura de explantes cocleares da orelha interna embrionária de camundongos.  Também demonstramos um método para transferência de genes em explantes cocleares por meio de eletroporação de onda quadrada. A cultura de explantes in vitro, juntamente com a técnica de transferência de genes, permite que os pesquisadores estudem os efeitos da alteração da expressão gênica durante o desenvolvimento.

Cultura da embrionárias mouse cocleares explantes e Gene Transferência de Eletroporação

Existem vários métodos para a introdução de agentes ototóxicos na cóclea de modelos animais. Apresenta-se um protocolo cirúrgico para entrega de agentes ototóxicos no nicho da janela redonda. O procedimento é confiável, cria lesões intracocleares direcionadas e evita danos mecânicos à microarquitetura. O exame do autorreparo/regeneração coclear é possível.

A abordagem do rato Round-janela para ototóxicos Delivery Agent: A rápida e técnica confiável para induzir a degeneração das células da cóclea

Os cílios primários influenciam várias vias de sinalização. A cóclea de mamíferos é ideal para examinar a sinalização da polaridade das células planares (PCP). A disfunção dos cílios afeta o crescimento coclear, a padronização celular e a orientação das células ciliadas, as leituras de PCP. Nosso objetivo é analisar a sinalização de PCP na cóclea de camundongo por meio de análise fenotípica, imuno-histoquímica e microscopia eletrônica de varredura.

Avaliação da Planar-Cell-Polaridade fenótipos em Ciliopathy rato mutante cóclea

Duas abordagens de microcirurgia para administração local de medicamentos no ouvido interno são descritas aqui e comparadas em termos de impacto nos parâmetros auditivos, citoarquitetura coclear e expressão de marcadores inflamatórios.

Um Estudo Comparativo de drogas métodos de entrega direcionados à orelha de rato Inner: Bullostomy Versus Injeção transtimpânica

Este artigo apresenta um método de preparação da superfície coclear modificado que requer decaltificação e uso de um adesivo de células e tecidos para aderir aos pedaços de epélia coclear a 10 mm de cobertura redonda para imunohistoquímica em córquia de camundongo adulto.

Preparação da superfície coclear no mouse adulto

Aqui, apresentamos um método para visualizar a captação de 3 kDa Texas Red-labeled dextran em células ciliadas auditivas com canais funcionais de mecanotransdução. Além disso, a dextrans de 3 a 10 kDa pode ser usada para estudar endocitose em cabelos e células de apoio do órgão de Corti.

Etiquetagem Dextran e Captação em Células Capilares Murina Coclear

Neste estudo, apresentamos um método de imagem em tempo real utilizando microscopia confocal para observar células que se movem em direção ao tecido danificado pela incubação ex vivo com o epitélio coclear contendo o órgão de Corti.

Imagens de células vivas in vitro para explorar a migração celular em direção ao órgão de Corti

O protocolo atual atualiza protocolos anteriores e incorpora abordagens relativamente simples para a cultura de explantes cocleares de alta qualidade. Isso fornece aquisição de dados confiável e imagens de alta resolução em células vivas e fixas. Este protocolo apoia a tendência contínua de estudar as células da orelha interna.

Explantes Cocleares Neonatais Totais como Modelo In vitro

Neste trabalho, apresentamos um protocolo detalhado para isolamento e cultivo de células ciliadas primárias da cóclea de camundongos. Inicialmente, o órgão de Corti foi dissecado de cócleas murinas neonatais (idade 3-5 dias) sob um microscópio. Posteriormente, as células foram digeridas enzimaticamente em uma suspensão unicelular e identificadas por imunofluorescência após vários dias em cultura.

Isolamento e Cultura de Células Ciliadas Cocleares Primárias de Camundongos Neonatais

Este protocolo, destinado a usuários iniciantes de tecido do ouvido interno de camundongos, detalha de forma abrangente as etapas para o processamento de ouvidos internos de camundongos em diferentes estágios de desenvolvimento para imunocoloração de seção.

Crioseccionamento e imunocoloração do tecido do ouvido interno de camundongos: dos estágios embrionário ao adulto

Aprenda a descelularizar e descalcificar cócleas de camundongo para engenharia de tecidos do ouvido interno. Este método permite estudar interações celulares com a matriz extracelular e formação do epitélio sensorial.

Um protocolo para Decellularizing Cochleae Mouse para engenharia de tecidos do ouvido interno

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