Um protocolo para Decellularizing Cochleae Mouse para engenharia de tecidos do ouvido interno

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar um método eficaz para descelularizar e descalcificar cócleas de camundongos para usar um andaime para aplicações de engenharia de tecidos do ouvido interno. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da engenharia auditiva e de tecidos, como, por exemplo, como a cóclea 3D e vários componentes da matriz extracelular influenciam a diferenciação das células-tronco? A principal vantagem dessa técnica é que ela permite ao pesquisador estudar como as células interagem diretamente com a matriz extracelular da cóclea para formar o epitélio sensorial.

A demonstração visual desse método é crítica, pois o isolamento do osso temporal e o aparato de profusão celular podem ser difíceis de visualizar corretamente com base apenas em descrições de texto. Para iniciar este procedimento, corte o crânio no plano sagital mediano usando uma tesoura cirúrgica afiada. Em seguida, remova o tecido cerebral do crânio.

Em seguida, identifique o osso temporal através da presença das raízes nervosas auditivas e vestibulares no interior do crânio e do canal auditivo do exterior. Corte cuidadosamente o crânio para isolar o osso temporal do restante do crânio. Em seguida, insira a pinça fina na abertura do canal auditivo aproximadamente cinco milímetros para que as pontas não corram o risco de perfurar a cóclea.

Abra suavemente o osso da bola para que ela se quebre. Usando uma pinça fina, retire o restante da bola do osso temporal, expondo o labirinto ósseo da cóclea. Posteriormente, submergir o osso temporal em PBS com as janelas ovais e redondas da cóclea voltadas para cima.

Usando uma pinça ultrafina, remova a artéria estapedial que passa pelo estribo. Em seguida, insira uma ponta da pinça ultrafina através do arco do estribo por onde a artéria passa e levante delicadamente o estribo para cima. Em seguida, perfure as janelas ovais e redondas.

Em seguida, posicione o tubo que está conectado a uma seringa de calibre 28.5 preenchida com PBS sobre a janela oval. Profuse dois milímetros de 10% de antibiótico-atimicótico e 10% de penicilina-estreptomicina em PBS através da cóclea durante cinco minutos para remover a perilinfa. Em seguida, remova e descarte qualquer tecido muscular restante e fragmentos ósseos.

Para descelularização, usando a pipeta de transferência, puxe suavemente a cóclea para dentro da pipeta para que ela passe pela borda cortada em alguns milímetros. Em seguida, expulse a cóclea para o frasco de cintilação cheio de solução de SDS a 1%. Circule dois mililitros de SDS a 1% em água desionizada através da cóclea no frasco de cintilação usando uma pipeta de transferência.

Coloque o frasco para injetáveis de cintilação em um rotador e deixe-o girar a 10 RPM por 72 horas em temperatura ambiente. Substitua por uma solução nova de SDS a 1% a cada 24 horas durante um período de 72 horas e tome cuidado para não expor a cóclea ao ar durante a substituição da solução. Em seguida, lave a cóclea três vezes no mesmo frasco de cintilação por 30 minutos cada em água DI.

Nesta fase, a cóclea deve ser descelularizada. Para descalcificação, remova a água DI restante do frasco de cintilação, deixando apenas o suficiente para manter a cóclea submersa. Para iniciar a descalcificação, adicione cinco mililitros de água 10% EDTA e DI ao frasco de cintilação contendo a cóclea.

Circule dois mililitros de EDTA a 10% em água desionizada através da cóclea no frasco de cintilação usando uma pipeta de transferência. Coloque o frasco de cintilação de volta no rotador e deixe o frasco de cintilação girar a 10 RPM por 72 horas em temperatura ambiente. Troque a solução de EDTA a 10% a cada 24 horas durante um período de 72 horas.

Tome cuidado ao trocar as soluções para que a cóclea não fique exposta ao ar. Em seguida, enxágue a cóclea três vezes por duas horas cada com PBS. Nesta fase, a cóclea deve ser descalcificada.

Antes de infundir células, comece incubando a cóclea descelularizada e descalcificada em uma incubadora de cultura de células a 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por no mínimo uma hora. Para profundir a cóclea, em seguida, adicione uma gota de MSCGM a cada cóclea para evitar que a cóclea seque. Transfira-os para uma nova placa de 24 poços usando uma pipeta de transferência.

Oriente delicadamente a cóclea usando uma pinça ultrafina para que as janelas ovais e redondas fiquem voltadas para cima. Em seguida, usando uma seringa de insulina estéril de calibre 28,5 com tubo conectado, retire 0,2 mililitros de células gelatinosas de Wharton humano ressuspensas. Em seguida, posicione o tubo sobre a janela oval usando uma pinça fina esterilizada.

Delicada e lentamente, profusa a cóclea com 0,2 mililitros de células gelatinosas de Wharton humano ressuspensas ao longo de cinco minutos. Esta etapa de profusão é importante. A profusão bem-sucedida de fluidos através da cóclea afeta muito o resultado deste protocolo.

Após a profusão, adicione 0,8 mililitros de MSCGM pré-aquecido a 37 graus Celsius ao poço contendo a cóclea para elevar o volume total a um mililitro. Repita o procedimento para cada cóclea. Usando uma seringa nova e tubo de cada vez.

Coloque a cóclea profusa em uma incubadora de cultura de células a 37 graus Celsius e troque o meio três vezes por semana. Aqui é mostrada a descelularização e descalcificação bem-sucedidas de uma cóclea de camundongo sem células injetadas. No geral, a anatomia da cóclea é preservada com vazios deixados sem manchas manchadas.

Aqui estão os resultados representativos de células gelatinosas de Wharton humanas cultivadas com sucesso em um andaime de cóclea. Coloração abundante é observada em toda a cóclea e na superfície óssea externa. Um exame mais detalhado das voltas individuais revela que as estruturas finas da cóclea são preservadas após a descelularização e descalcificação e que as células injetadas estão ligadas e/ou interagindo com a matriz extracelular nativa da cóclea.

A descelularização em cultura de células subsequente também foi investigada usando coloração H & E. A cóclea descelularizada não continha nenhuma das células da cóclea nativa, mas retém a maior parte da anatomia do órgão de Corti porque a matriz extracelular permanece. Injetadas em células cultivadas podem ser observadas através do órgão de Corti, interagindo com a matriz extracelular descelularizada.

Uma vez dominada, a profusão de células em uma cóclea descelularizada pode levar aproximadamente 10 a 15 minutos se a cóclea já estiver preparada e as ferramentas necessárias estiverem dispostas adequadamente. Ao tentar este procedimento, é importante manusear a cóclea com cuidado, pois ela é frágil. Também é importante evitar a introdução de ar na cóclea, pois as bolhas bloqueiam o fluxo de fluidos durante as profusões.

Este procedimento geral pode ser aplicado a cócleas de outras espécies e uma ampla gama de tipos de células também pode ser injetada. Os tempos específicos de descelularização e descalcificação provavelmente variarão, mas os conceitos subjacentes permanecerão os mesmos. O Dr. Peter Santi, da Universidade de Minnesota, desenvolveu inicialmente a técnica de descelularização que modificamos para este protocolo.

Esperamos disponibilizar nossa técnica e cultura de células em andaimes de cóclea para outros engenheiros de tecidos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar, descelularizar e descalcificar com sucesso os ossos temporais antes de injetar células para uso em experimentos de cultura.