Síntese e avaliação de um inibidor de absorção de cálcio mitocondrial rutênio-baseado

O objetivo geral da síntese e purificação é produzir com relativa facilidade um análogo de rutênio 360 usado em ensaios de captação de cálcio mitocondrial que seja 10 vezes mais eficaz do que o rutênio 360 disponível comercialmente. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia mitocondrial do cálcio, fornecendo um inibidor puro da absorção de cálcio mitocondrial. A principal vantagem dessa técnica é que o produto final é muito potente e puro.

Indivíduos novos neste método podem ter dificuldades porque a purificação requer tempo e paciência. Demonstrando o produtor estará Sarah Nathan, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório. Comece este procedimento com a síntese de dicloreto de pentaamina cloro rutênio conforme descrito no protocolo de texto.

Dissolver 100 ml de dicloreto de clororutênio pentaammina em 50 mililitros de uma solução molar de hidróxido de amônio em um balão de fundo redondo de 200 ml. Fechar frouxamente o balão com uma rolha de vidro e aquecer a mistura de reacção a 75 graus Celsius durante seis horas. O aquecimento de um recipiente selado resulta em um aumento de pressão.

Certifique-se de que a rolha de vidro esteja solta para permitir a liberação do excesso de pressão. Após seis horas, retire a mistura de reação do fogo. E mexa em temperatura ambiente por quatro dias para obter uma solução verde escura.

Para purificar o pentacloreto de dirutenio mu-oxo dirutênio trans-diaqua resultante por cromatografia de troca catiônica, primeiro suspenda cinco gramas de resina de troca catiônica mesh em 10 mililitros de HCL 0,1 molar em um béquer de 25 mililitros. Carregue esta pasta em uma coluna de 10 mililitros afixada com um reservatório de solvente de 50 mililitros. Lave a resina com aproximadamente 20 a 30 mililitros de HCL 0,1 molar até que o eluimento fique incolor.

Em seguida, adicione HCL concentrado à solução de reação verde previamente isolada para ajustar o PH para dois, ponto em que a cor da solução muda para marrom. Carregue esta solução acidificada na coluna de resina de troca catiônica, pipetando-a suavemente sobre a resina. Deixe o eluidor drenar completamente e continue carregando a solução.

Repita esse processo até que toda a solução tenha sido adicionada. A parte superior da resina será marrom escuro ou preto. A resina diminuirá ligeiramente de volume.

Em seguida, cubra a parte superior da resina com contas de vidro para evitar que a resina seja perturbada quando novas soluções forem adicionadas. Eluir a coluna com 20 mililitros de um molar HCL. Em seguida, eluir a coluna com 50 mililitros de uma concentração aumentada de HCL de 1,5 molar.

Uma solução amarela começará a sair da coluna. Em seguida, aumente a concentração de HCL para dois molares e continue eluindo com 150 a 200 mililitros. O eluente começará como um amarelo muito pálido e passará para um amarelo brilhante.

Espere até que o eluente vindo da coluna esteja novamente muito pálido. A paciência é fundamental nesta etapa. O eluente deve ser muito pálido.

Aumente a concentração de HCL ainda mais para 2,5 molar. Recolher o eluente em fracções em tubos de ensaio. Finalmente, aumente a concentração para três molares HCL.

O produto será eluído da coluna como uma solução marrom-esverdeada. Uma fração marrom-avermelhada também pode começar a sair da coluna. Essas frações são impurezas marrom-rutênio e não devem ser agrupadas com as frações marrom-esverdeadas.

Para testar todas as frações por espectroscopia UV-Vis, adicione 100 microlitros de uma determinada fração em dois mililitros de amônia de três molares. Em seguida, analise a mistura por espectroscopia UV-Vis. As frações contendo produto puro terão uma grande banda de absorbância em 360 nanômetros e uma absorbância menos intensa em 600 nanômetros.

A absorbância a 480 nanômetros é indicativa de marrom rutênio e a absorbância a 533 nanômetros representa impurezas vermelhas de rutênio. Outras impurezas são vistas em absorbância inferior a 300 nanômetros. Fracções de piscina contendo produto puro e evaporam a solução até à secura por evaporação rotativa antes da análise da amostra no estado sólido por espectroscopia de infravermelho.

Prossiga para avaliar a inibição da captação de cálcio mitocondrial por espectroscopia fluorescente, conforme detalhado no protocolo de texto. Os espectros UV-Vis do pentacloreto de trans-diaqua octoamina mu-oxo dirutênio purificado são caracterizados pelas absorções maiores e menores em 360 nanômetros e 600 nanômetros, respectivamente. Por outro lado, uma mistura impura mostra bandas de absorção a 533 nanômetros de impurezas vermelhas de rutênio e a 275 a 300 nanômetros de material de partida.

A caracterização do estado sólido usando espectroscopia de infravermelho tem os trechos esperados das aminas. Bem como o rutênio oxigênio rutênio esticar a 850 centímetros inversos. Células HeLa permeabalizadas tratadas com um corante fluorescente sensível ao cálcio e pentacloreto de trans-diaqua octoamina mu-oxo dirutênio mostram inibição da captação de cálcio nas mitocôndrias.

Ao tentar o procedimento, é importante lembrar de permitir que as frações eluam completamente. A paciência produzirá um produto puro. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como sintetizar, purificar e caracterizar este potente análogo de rutênio 360.

Os níveis de cálcio mitocondrial regulam uma ampla gama de processos intercelulares, incluindo bioenergética e morte celular controlada. O inibidor produzido a partir deste método pode ser aplicado em estudos para entender o papel da biologia mitocondrial do cálcio na mediação de outros processos biológicos. Não se esqueça de que trabalhar com ácidos e bases concentrados é corrosivo e precauções como usar EPI adequado devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.