Método baseado na precipitação de Formazan induzida pela exposição à luz azul de coloração de DNA
28 de janeiro de 2018
Este método permite coloração seletiva e quantificação de DNA em géis embebendo o gel em um SYBR Green eu / Nitro azul tetrazólio solução e então exposto à luz solar ou uma fonte de luz azul. Isto produz um precipitado visível e não requer quase nenhum equipamento, tornando-a ideal para uso em campo.
O protocolo de coloração de DNA tem três etapas gerais. A primeira é colocar o gel em uma solução de SYBR Green I e nitro blue tetrazólio, também conhecido como NBT. O gel é então agitado por 25 minutos se for um gel de poliacrilamida e uma hora se for um gel de agarose.
A última etapa é expor o gel a uma fonte de luz azul, como LEDs azuis ou luz solar. Durante esta etapa, algumas bandas precipitadas aparecem. Essas bandas têm uma correlação direta com a concentração de DNA e o gel pode ser digitalizado em um scanner de escritório para quantificar o DNA.
Para o gel de poliacrilamida, é preparado um gel de poliacrilamida não desnaturante. O gel é então carregado com as amostras e o processo de eletroforese é iniciado. SYBR Green I sendo diluído para 1,2X e as soluções milimolares NBT 20 estão agora preparadas.
O gel é colocado em um recipiente de plástico e 16,75 mils do SYBR Green I diluído e 325 mils do NBT a 20 milimolares são adicionados. Em seguida, o recipiente é coberto com Parafilm e papel alumínio e agitado a 60 rpm por 25 minutos. Finalmente, a folha de alumínio e um Parafilm são removidos e o gel é exposto à luz solar ou a uma fonte de luz azul.
Para quantificação de banda e curvas de calibração, o gel é colocado em um scanner de escritório e, em seguida, a imagem é analisada usando um software de análise de imagem. Finalmente, é feito um enxerto de sinal normalizado versus concentração. Um gel de agarose é feito.
Os poços são carregados com um plasmídeo que tem resistência à ampicilina e o gel é cortado em dois pedaços, cada um dos quais é corado com uma coloração diferente. Em seguida, a banda plasmidial é extraída e transformada por transformação química em células competentes com meios que contêm ampicilina. Um gel de agarose a 1% é preparado em tampão TAE 1X e carregado com quatro microlitros de plasmídeo a cerca de 100 nanogramas por microlitro.
O gel na câmara de eletroforese é então executado a 100 volts por uma hora. Metade do gel é corada com o método SYBR Green I e NBT e a outra metade com o método SYBR Green I UV. Para gel de agarose, o método SYBR Green I NBT é realizado usando SBYR Green I em uma concentração de 1,2X e NBT em 2 milimolares.
O gel é colocado em um recipiente de plástico e o volume da solução é dimensionado para cobrir o gel e o tempo de agitação é estendido para uma hora. Para géis de agarose, o método SYBR Green I comumente usado é realizado cobrindo o gel com a solução 1X SYBR Green I e mexendo por uma hora. Em seguida, o gel é exposto a um transiluminador UV para visualização da banda por dois minutos.
Uma vez que o gel é corado, a banda de plasmídeo é cortada com um bisturi e o plasmídeo extraído com um kit de extração comercial. O DNA é normalizado para 9,1 nanogramas por microlitro para transformar bactérias Escherichia coli XL 10 competentes em produtos químicos. Finalmente, as colônias são contadas.
As unidades formadoras de colônias são calculadas. O resultado é enxertado e os resultados obtidos do SYBR Green I NBT e do SYBR Green I UV são comparados. Um precipitado de formazan roxo aparece onde o DNA está localizado.
No experimento, uma escada de DNA foi carregada para fazer uma curva de calibração com um limite de detecção de 192 picogramas a 1.500 pares de bases. O uso de géis de agarose permite a recuperação da amostra utilizando kit disponível comercialmente e não interfere na extração. Alguma recuperação usando este método com LED azul resulta em melhor qualidade em comparação com o SYBR Green I usando transiluminador.
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Visão Geral
Este método permite a coloração seletiva e a quantificação de DNA em géis utilizando uma solução de SYBR Green I/Nitro Blue Tetrazólio. O processo requer equipamento mínimo, tornando-o adequado para aplicações de campo.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Bioquímica
- Biologia Molecular
- Aplicações de Campo
Contexto
- A quantificação de DNA é essencial para diversos estudos biológicos.
- Os métodos tradicionais frequentemente exigem equipamentos complexos.
- Este método simplifica significativamente o processo.
- Utiliza reagentes comuns para obter resultados eficazes.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método simples para coloração de DNA.
- Permitir a quantificação de DNA em diferentes tipos de gel.
- Facilitar trabalhos de campo com requisitos mínimos de equipamento.
Métodos Utilizados
- Imersão do gel em uma solução de SYBR Green I e NBT.
- Agitação do gel por 25 minutos (poliacrilamida) ou 1 hora (agarose).
- Exposição do gel a uma fonte de luz azul ou à luz solar.
- Digitalização do gel para quantificação do DNA.
Resultados Principais
- As bandas de precipitado visíveis correlacionam-se com a concentração de DNA.
- A coloração eficaz é obtida com equipamento mínimo.
- Os resultados podem ser quantificados utilizando scanners de escritório comuns.
- O método demonstra confiabilidade em condições de campo.
Conclusões
- O método fornece uma abordagem prática para a quantificação de DNA.
- É adequado para diversos tipos de géis e aplicações de campo.
- Amplia o acesso para pesquisadores em locais remotos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método de coloração de DNA permite a visualização direta e a quantificação de ácidos nucleicos sem equipamento especializado, apoiando a validação rápida de alvos em ambientes com recursos limitados. Ao eliminar a dependência de transiluminadores de UV, reduz os riscos de segurança e a complexidade operacional em fluxos de trabalho de descoberta inicial. A abordagem aumenta a confiança preditiva por meio da correlação reprodutível do sinal baseado em corante com a concentração de DNA, facilitando decisões de avanço ou interrupção em processos de identificação de compostos líderes.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a verificação de hipóteses por meio da correlação direta entre a intensidade do precipitado de formazano e a concentração de DNA, apoiando a avaliação do engajamento do alvo.
- Valor Operacional: Utiliza agitação à temperatura ambiente e exposição à luz azul, evitando protocolos com radiação UV perigosa e equipamentos especializados de imagem.
- Valor Preditivo: Fornece uma saída quantitativa compatível com scanners de escritório, permitindo uma comparação rápida dos rendimentos de ácidos nucleicos entre diferentes condições experimentais.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Prontidão do ensaio: Gera bandas de precipitado estáveis e visíveis que servem como leituras padronizadas para formatos de triagem de ácidos nucleicos de alto rendimento.
- Reprodutibilidade: Tempos definidos de agitação (25 min para poliacrilamida, 60 min para agarose) e concentrações escalonáveis de reagentes garantem geração consistente de sinal entre diferentes lotes.
- Compatibilidade com plataformas: Funciona com géis de agarose e poliacrilamida, permitindo integração perfeita nos fluxos de trabalho existentes de eletroforese para análise de variantes ou plasmídeos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Permite a recuperação de plasmídeos funcionais após a coloração, como demonstrado por um número maior de unidades formadoras de colônias em comparação com métodos baseados em UV, possibilitando a validação funcional subsequente.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Evita danos ao DNA induzidos por UV, preservando a integridade da amostra para uma correlação precisa entre genótipo e fenótipo em ensaios de triagem fenotípica.
- Utilidade Pré-clínica: Permite a quantificação de uso imediato no campo de construtos de expressão gênica ou títulos virais em modelos pré-clínicos, sem necessidade de infraestrutura laboratorial.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a extração de ácidos nucleicos até a validação de ensaios funcionais, especialmente em situações onde o acesso a equipamentos é limitado ou é necessária uma iteração rápida.
- Biologia da Descoberta: Apoia a validação de alvos ao fornecer leituras quantificáveis de DNA que se correlacionam com a eficiência transcricional ou de edição em estudos de modulação de vias.
- Triagem: Permite a quantificação padronizada de ácidos nucleicos para confirmação de acertos em bibliotecas CRISPR ou de superexpressão, melhorando a reprodutibilidade do ensaio.
- Análises: Gera curvas lineares de sinal-concentração por meio de imagem obtida com escâner de escritório, apoiando a normalização de dados em formatos baseados em placas de múltiplas poças ou em géis.
- Pesquisa Translacional: Facilita a recuperação de ácidos nucleicos intactos para ensaios funcionais in vitro, conectando a descoberta ao teste de eficácia pré-clínica.
- Reutilização Corporativa: Requer apenas SYBR Green I, NBT e fonte de luz azul, tornando-se um módulo de baixo custo e reutilizável entre diversas equipes de projeto.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao evitar artefatos induzidos por UV, melhorando a confiabilidade dos dados em ensaios de validação de alvos.
- Valor Operacional: Elimina a necessidade de câmaras escuras ou transiluminadores, aumentando a produtividade e reduzindo gargalos em instalações centrais compartilhadas.
- Valor Estratégico: Diminui os gastos de capital com a quantificação de ácidos nucleicos, permitindo testes descentralizados em laboratórios satélites ou locais colaborativos.
- Impacto no Portfólio: Apoia o avanço ajustado ao risco ao fornecer confirmação precoce e independente de equipamentos do rendimento do construto antes de investir na purificação subsequente.
Considerações sobre a Implementação
- Exige treinamento básico em biologia molecular para preparação de géis e eletroforese.
- Requer acesso a fonte de luz azul (por exemplo, LEDs de 470 nm) ou luz solar e equipamentos de agitação laboratorial padrão.
- Exige tempos de coloração e concentrações de reagentes padronizados para garantir reprodutibilidade entre laboratórios.
- Pode exigir otimização para formatos de alto rendimento devido a etapas manuais de manipulação de géis.
- Limita-se à detecção de ácidos nucleicos; não é aplicável a ensaios de proteínas ou moléculas pequenas sem adaptação.
