Name: Método baseado na precipitação de Formazan induzida pela exposição à luz azul de coloração de DNA (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Aprenda um método simples de coloração de DNA em géis usando SYBR Green I e NBT com luz azul. Esta técnica permite quantificação rápida sem equipamento complexo, ideal para aplicações em campo.

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Este trabalho foi apoiado pela Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (Fondecyt), Chile, projeto 11130263 (para CW), projeto CONICYT, NERC + Programa de Colaboración Internacional PCI-PII20150073 (para CW) e U-inicia a partir do Vicerrectoría de Investigación Universidad de Chile (CW).
Para Tatiana Naranjo-Palma, obrigado pela ajuda na fase inicial deste projecto, Dr. Jorge Babul e Diego Quiroga-Roger para discussão útil, Robert Lesch para revisar o manuscrito e Dirección de ramal de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacêuticas da Universidade do Chile. Graças também ao Marcelo Pérez para edição de vídeo e Neil Stevens para corrigir o texto e Errol Watson para fornecer a voz do narrador.

1. preparação e execução do Gel
<ol><li>Prepare o desnaturação não 12% gel de polyacrylamide gel usando a receita de sódio Dodecil sulfato de sódio-Polyacrylamide Gel eletroforese (SDS-PAGE) encontrados em Sapeka e Russell14 mas usando água em vez de SDS.<ol>
<li>Para preparar a 5 mL de solução de gel, use 1,7 mL de água destilada, 2 mL de acrilamida/bis acrilamida (30/0,8% p/v), 1,3 mL de 1,5 M Tris pH 8,8, 0,05 mL de persulfato de amónio de 10% e 0,002 mL de TEMED.</li>
		<li>Para preparar 2 mL de gel de empilhamento usar 1,5 mL de água, 0,33 mL de acrilamida/bis acrilamida (30/0,8% p/v), 0,25 mL de 1 M Tris pH 6,8, 0,02 mL de persulfato de amónio de 10% e 0,002 mL de TEMED. As dimensões do gel são 7,3 x 8,2 cm x 0,075 cm (l x w x d). Nota: Use um pente bem 15 de 0,75 mm de espessura para a melhor sensibilidade.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicione as quantidades adequadas de 6x carregando buffer e amostra de DNA para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL (por exemplo, uso 1 µ l de tampão de carregamento 6 x a 5 µ l de amostra de DNA).</li>
	<li>Coloca o gel na câmara de eletroforese vertical.<ol>
<li>Encha a câmara com 750 mL de 1 tampão de x TAE para executar 2 géis. Para preparar 1 L de 50 x TAE, usar 442 g da base Tris, 57,1 mL de ácido acético glacial e 100 mL de pH de EDTA 0,5 M 8. Adicionar água destilada até um volume final de 1 L.</li>
		<li>Carrega as amostras no gel. Funcione o gel a 100 V por 2 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Em alternativa, prepare um gel de agarose 1 x TAE usando a receita encontrada na Sapeka14.<ol>
<li>300 ml de 1 x TAE para a câmara de eletroforese horizontal. Funcione o gel por 45 min a 100 V.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. NBT-SG eu coloração (Figura 1).
<ol><li>
Gel do acrilamido coloração.
	<ol>
<li>Preparar as soluções: 0,1% w/v NBT e 1.2 x SG eu. Nota: É possível usar o brometo de etídio, GelRed e SYBR Gold em vez de SG eu, mas eu tive o melhor desempenho de SG.</li>
		<li>Despeje 16,75 mL de 1.2 x SYBR verde eu solução em um recipiente de tamanho apropriado. Nota: Usamos a tampa de uma caixa de ponta da pipeta como um recipiente, e esses volumes são calculados para cobrir o gel usando este recipiente; suas dimensões são 11,6 x 7,6 cm x 2.6 cm (l x w x d).</li>
		<li>Coloque o gel na solução. 3,25 ml de solução de 0,1% w/v NBT dar NBT de 0.2 mM e 1 x (equivalente a 2,0 µM) SG concentrações finais.</li>
		<li>Selar o recipiente com filme plástico e enrole completamente o recipiente com papel de alumínio para bloquear qualquer luz ambiente. Nota: O filme plástico é usado para evitar salpicos e evitar a reação da película de alumínio com a coloração da solução.</li>
		<li>Agitar durante 25 min em um agitador orbital em 60 rpm.</li>
		<li>Remova o alumínio e tampa de plástico. Exponha à luz solar por 90 min máximo. Verificar a cada 5 min até que apareça a banda de interesse.</li>
		<li>Para usar a luz azul, preparar uma protoboard com 3 diodos emissores de luz (LED) e colocar os LEDs 5 mm da superfície do gel (verifique a coloração continuamente, como o tempo necessário dependerá da intensidade da fonte de luz LED).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
A coloração do Gel do agarose.
	<ol>
<li>Depois de preparar e executar um agarose 1% gel conforme descrito nas seções 1.4 (as dimensões são 1 x 6,2 cm x 7 cm; l x w x d), siga os mesmos passos como em 2.1 com essas modificações:</li>
		<li>Despeje 41,9 mL de 1.2 x SG eu solução na tampa de uma caixa de ponta da pipeta; suas dimensões são 11,6 x 7,6 cm x 2.6 cm (l x w x d). Adicione 8,1 mL da solução NBT de 0,1%.</li>
		<li>Selar o recipiente com filme plástico e em seguida, enrole completamente o recipiente com papel de alumínio para bloquear qualquer luz ambiente.</li>
		<li>Agitar durante 1 h em um agitador orbital em 60 rpm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. os dados análise.
<ol><li>
NBT-SG que as curvas de calibração.
	<ol>
<li>Obter imagens de gel de digitalização de 1200 dpi.</li>
		<li>Software aberto para análise de imagem. Endireite as imagens usando um editor de imagem. Execute uma densitometria de imagem.</li>
		<li>Calcule a área sob a curva. Prepare um gráfico do sinal/sinalMax versus concentração de DNA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. o DNA recuperação.
<ol><li>Preparar um gel de agarose 1% em 1 x TAE usando a receita encontrada na Sapeka14.</li>
	<li>300 ml de 1 x TAE para a câmara de eletroforese horizontal. Carrega 4 µ l de 100 plasmídeo de15 pDJ100 ng / µ l e escada de DNA, seguindo o esquema na Figura 2. Funcione o gel durante 1 h a 100 V.</li>
	<li>Marcar e pesar dois tubos de microcentrifuga de 2 mL.</li>
	<li>Corte o gel no meio para ter duas metades idênticas. Cada um deve conter a escada e o plasmídeo de amostra para comparar as diferentes técnicas de coloração. Uma representação esquemática é na Figura 2.</li>
	<li>Manchar uma metade com NBT-SG eu como na etapa 2.<ol>
<li>Corte a banda do plasmídeo usando um bisturi limpo. Guarde o pedaço de gel em um tubo e pesar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Manchar a outra parte do gel com SG eu com 50 mL de 1 x SG eu solução e agitar lentamente (60 rpm) o gel por 1h na escuridão.<ol>
<li>Coloque o gel em um transiluminador e expor por 2 min. corte a banda do plasmídeo usando um bisturi limpo.</li>
		<li>Guarde o pedaço de gel no outro tubo e pesar. Nota: O protocolo pode ser pausado aqui, mantendo os tubos a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realize a extração do plasmídeo usando um kit de extração comercial de gel.</li>
</ol>5. plasmídeo normalização.
<ol><li>Em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL, adicione 10 µ l de plasmídeo extraído e 60 µ l do tipo que da água. Misturar e transferir para uma cubeta de quartzo de 60 µ l ou usar 2 µ l diretamente em um Nanodrop.</li>
	<li>Medir os espectros de absorção entre 230 a 320 nm. Calcule a concentração de plasmídeo da amostra usando a seguinte fórmula: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56528/56528eq1v3.jpg"> onde D é o factor de diluição aplicado (neste caso é 70/10), Ax é absorção x nm e 50 é o fator de conversão de µ g/mL para dsDNA.</li>
	<li>Dilua as amostras para 9,1 ng / µ l.</li>
	<li>Transformar células competentes de Escherichia coli (e. coli) (por exemplo, XL10 Gold) seguindo a transformação Inoue do procedimento16 usando 5 µ l de amostra diluída.</li>
	<li>Contar o número de colônias sobre os pratos de Petri e observe a diluição. Calcular a colônia formando unidades (CFU) com a seguinte fórmula17: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56528/56528eq2v2.jpg"> onde D é o factor de diluição, aplicado desde a cultura inicial.</li>
	<li>Execute um teste-t não pareado.</li>
</ol>

<ol><li>LePecq, J. B., Paoletti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescent+complex+between+ethidium+bromide+and+nucleic+acids%3A+physical-chemical+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A fluorescent complex between ethidium bromide and nucleic acids: physical-chemical characterization.</a> J. Mol. Biol. 27 (1), 87-106 (1967).</li>
<li>Singer, V. L., Lawlor, T. E., Yue, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+SYBR+Green+I+nucleic+acid+gel+stain+mutagenicity+and+ethidium+bromide+mutagenicity+in+the+Salmonella%2Fmammalian+microsome+reverse+mutation+assay+%28Ames+test%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test).</a> Mutat Res. 439 (1), 37-47 (1999).</li>
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<li>Yang, Y. I., Jung, D. W., Bai, D. G., Yoo, G. S., Choi, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counterion-dye+staining+method+for+DNA+in+agarose+gels+using+crystal+violet+and+methyl+orange%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Counterion-dye staining method for DNA in agarose gels using crystal violet and methyl orange.</a> Electrophoresis. 22 (5), 855-859 (2001).</li>
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<li>Cong, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+visible+dye-based+staining+method+for+DNA+in+polyacrylamide+gels+by+ethyl+violet%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A visible dye-based staining method for DNA in polyacrylamide gels by ethyl violet.</a> Anal. Biochem. 402 (1), 99-101 (2010).</li>
<li>Altman, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazolium+salts+and+formazans%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Tetrazolium salts and formazans.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 9 (3), 1-56 (1976).</li>
<li>Nineham, A. W. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/cr50002a004">The chemistry of formazans and tetrazolium salts.</a> Chem. Rev. 55 (2), 355-483 (1955).</li>
<li>Crandall, I. E., Zhao, B., Vlahakis, J. Z., Szarek, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+of+imidazole-%2C+imidazolium%2C+and+tetrazolium-containing+compounds+with+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem.+Lett%22%5BJournal%5D)">The interaction of imidazole-, imidazolium, and tetrazolium-containing compounds with DNA.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 23 (5), 1522-1528 (2013).</li>
<li>Paredes, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+visible+and+selective+DNA+staining+method+in+gels+with+tetrazolium+salts%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">New visible and selective DNA staining method in gels with tetrazolium salts.</a> Anal. Biochem. 517, 31-35 (2017).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+Cloning%3A+a+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: a Laboratory Manual</a>. , fourth, Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2012).</li>
<li>Hansen, W., Garcia, P. D., Walter, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3009026">In vitro protein translocation across the yeast endoplasmic reticulum: ATP-dependent post-translational translocation of the prepro-α-factor.</a> Cell. 45 (3), 397-406 (1986).</li>
<li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Gene. 96 (1), 23-28 (1990).</li>
<li>Madigan, M., Martinko, J., Parker, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMadigan%2C+M+%22Brock+biology+of+microorganisms%22">Brock biology of microorganisms</a>. , 10th, Prentice Hall/Pearson Education. Upper Saddle River (NJ). (2003).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Um sensível e romance método de coloração de DNA com base na redução do NBT e o uso do SG, que foi apresentado neste artigo. O passo crítico neste protocolo é o tempo de incubação do gel em NBT-SG eu solução e a concentração de NBT. O tempo de coloração para gel de agarose é maior que para géis de acrilamida por causa da maior espessura de gel de agarose. Esse método não funciona bem na presença de SDS como NBT precipita-se em contacto com ele. Se o gel Obtém um fundo roxo, recomendamos que o gel de outro ser preparado e...

Com os avanços em bioquímica e biologia molecular, os estudos envolvendo DNA exigiram melhores técnicas para analisar o DNA. O primeiro método para coloração de DNA foi prata coloração, que é muito sensível, mas carece de seletividade e não permite a recuperação de amostra. Mais tarde, o desenvolvimento de coloração fluorescente de DNA permitiu a seletiva quantificação de DNA com a possibilidade de recuperação da amostra. Dentre os corantes fluorescentes primeiros usados para quantificação de DNA foi de brometo de etídio1, que é mutagênico2. No entanto, agora existem corantes fluorescentes melhorados mais seguros e mais sensíveis, tais como GelRed e SYBR Green eu (SG eu)3; Mas todos estes corantes fluorescentes exigem o uso de um transiluminador de (UV) ultravioleta ou fluorímetro.
Existem outras técnicas para coloração visivelmente o DNA, como o azul de metileno4 e violeta cristal5,6,7,8,9, mas todos estes sofrem de sensibilidade reduzida e seletividade. Os sais de tetrazólio são suscetíveis a redução de compostos orgânicos e quando isso acontece eles formam um insolúvel e colorida formazan precipitar10,11. Recentemente, foram mostrados para ligar ao DNA devido seus anéis de tetrazólio positivo12sais de tetrazólio bivalente.
Em uma recente publicação13, foi proposta uma nova técnica visível para manchar e quantificação de DNA em gel de poliacrilamida, usando a redução de um sal de tetrazólio bivalente chamado nitro azul tetrazólio (NBT) e corantes fluorescentes como brometo de etídio, GelRed, SYBR Green I e SYBR Gold. Esta reação funcionou na presença de luz azul ou luz solar e permitiu a recuperação da amostra com qualidade melhorada em comparação com o uso de SG eu com um transiluminador UV. O objetivo deste trabalho é fornecer um protocolo detalhado da técnica de coloração usando tetrazólio sais.

<table><tbody><tr><td>Reagente azul nitro da</td> biotecnologia <td>298-83-9</td><td>do ouro</td> do tetrazólio <td>usado na mancha</td></tr><tr><td>Reagente verde I 10000X de SYBR</td><td>Thermo-Fisher</td><td>S7563</td><td>usado na coloração</td></tr><tr><td>Kit de extração de gel</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td>usado para extrair o plasmídeo do gel na escada de DNA do ensaio de integridade</td></tr><tr><td></td><td>Thermo-Fisher</td><td>SM 1331</td><td>usado para fazer curvas de calibração e como referência para cortar banda em ensaio de integridade</td></tr><tr><td>Ágar Ágar</td><td>Merck</td><td></td><td>usado para fazer placas de cultura de LB-ampicilina&nbsp;</td></tr><tr><td>cloreto de sódio</td><td>Merck</td><td>1064045000</td><td>usado para fazer placas de cultura LB-ampicilina&nbsp;</td></tr><tr><td>extrato de levedura</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>212750</td><td>usado para fazer placas de cultura LB-ampicilina&nbsp;</td></tr><tr><td>peptona</td><td>Merck</td><td>72161000</td><td>usada para fazer placas de cultura LB-ampicilina&nbsp;</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>AMRESCO</td><td>761</td><td>usado para fazer géis de poliacrilamida</td></tr><tr><td>persulfato de amônio</td><td>Calbiochem</td><td>2310</td><td>usado para fazer géis de poliacrilamida</td></tr><tr><td>acrilamida</td><td>invitrogen</td><td>15512-023</td><td>usado para fazer géis de poliacrilamida</td></tr><tr><td>bisacrilamida</td><td>SIGMA</td><td>146072</td><td>usado para fazer géis de poliacrilamida</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Merck</td><td>1083821000</td><td>usado para fazer tampão TAE e tampão tris-HCl gel de poliacrilamida não desnaturante</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>J.T. Baker</td><td>8993-01</td><td>usado para fazer tampão TAE</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Merck</td><td>1.000.632.500</td><td>usado para fazer tampão TAE</td></tr><tr><td>agarose</td><td>Merck</td><td>16802</td><td>usado para fazer</td></tr><tr><td>espectrofotômetro</td> tampão TAE <td>Tecan</td><td>infinite 200 pro</td><td>usado para quantificar o plasmídeo</td></tr> <tr><td>de DNAunidade de purificação de água</td><td>Merck</td><td>Elix 100</td><td>usado para fazer água tipo 1 (ASTM) usado em espectrofotometria e diluições de DNA \</td></tr><tr><td></td> água <td></td><td>destilada</td> <td>usada em géis, meio de cultura, colorações e soluções gerais</td></tr><tr><td>HCl</td><td>J.T. Baker</td><td>9535-03</td><td>usado para fazer gel de poliacrilamida não desnaturante tris-HCl tampão</td></tr><tr><td>6X corante de carregamento de DNA</td><td>Thermo-Fisher</td><td>R0610</td><td></td></tr><tr>Fonte de luz <td>LED azul de 5 mm</td><td>Jinyuan electronics</td><td>SP-021</td><td>usada no teste de integridade</td></tr><tr><td>protoboard</td><td>KANDH</td><td>KH102</td><td>suporte de fonte de luz e circuito&nbsp;</td></tr><tr><td>Bateria de 9 V</td><td>Duracell-usada</td><td></td> <td>para alimentar a</td></tr><tr><td>câmara de eletroforese horizontal</td> do LED <td>Biorad</td><td>1704486EDU</td><td>usado para fazer e executar gel de agarose em ensaio</td></tr><tr><td>de integridade kit de eletroforese vertical</td><td>Biorad</td><td>1658002EDU</td><td>usado para executar géis de poliacrilamida em curvas de calibração</td></tr><tr><td>fonte de alimentação</td><td>Biorad</td><td>1645050&nbsp;</td><td>usado para alimentar a eletroforese</td></tr></tbody></table>

método baseado na precipitação de formazan induzida pela exposição à luz azul de coloração de dna

DNA Staining Method Based on Formazan Precipitation Induced by Blue Light Exposure

Métodos de coloração de DNA são muito importantes para a investigação biomédica. Nós projetamos um método simples que permite a visualização de DNA a olho nu, a formação de um precipitado colorido. Ele funciona através da imersão a acrilamida ou gel de agarose DNA em uma solução de 1 x (equivalente a 2,0 µM) SYBR Green eu (SG eu) e 0,20 mM nitro azul tetrazólio que produz um roxo precipitado de formazan quando expostos à luz solar ou especificamente a luz azul. Também, testes de recuperação de DNA foram realizados utilizando um plasmídeo resistente à ampicilina em um gel de agarose corado com nosso método. Obteve-se um maior número de colônias com nosso método do que com a tradicional mancha usando SG eu com iluminação ultravioleta. O método descrito é rápido, específico e não-tóxico para a deteção de DNA, permitindo a visualização de biomoléculas a "olho nu", sem um transiluminador e é barato e apropriado para uso em campo. Por estas razões, o nosso DNA novo método de coloração tem potenciais benefícios para a investigação e a indústria.

Um precipitado de formazan roxo aparece onde se encontra o DNA (verificado por espectrometria de massa13). No experimento, uma escada de DNA foi carregada para fazer uma curva de calibração (Figura 3). O protocolo funciona para gel de agarose e acrilamida, mas tem uma menor intensidade e leva mais tempo em agarose. No entanto, o uso de géis de agarose permite a recuperação da amostra usando um kit disponível comercialmente, e não inter...

Este método permite coloração seletiva e quantificação de DNA em géis embebendo o gel em um SYBR Green eu / Nitro azul tetrazólio solução e então exposto à luz solar ou uma fonte de luz azul. Isto produz um precipitado visível e não requer quase nenhum equipamento, tornando-a ideal para uso em campo.

Método baseado na precipitação de Formazan induzida pela exposição à luz azul de coloração de DNA

DNA staining methods are very important for biomedical research. We designed a simple method that allows DNA visualization to the naked eye by the ...

O protocolo de coloração de DNA tem três etapas gerais. A primeira é colocar o gel em uma solução de SYBR Green I e nitro blue tetrazólio, também conhecido como NBT. O gel é então agitado por 25 minutos se for um gel de poliacrilamida e uma hora se for um gel de agarose.A última etapa é expor o gel a uma fonte de luz azul, como LEDs azuis ou luz solar. Durante esta etapa, algumas bandas precipitadas aparecem. Essas bandas têm uma correlação direta com a concentração de DNA e o gel pode ser digitalizado em um scanner de escritório para quantificar o DNA.Para o gel de poliacrilamida, é preparado um gel de poliacrilamida não desnaturante. O gel é então carregado com as amostras e o processo de eletroforese é iniciado. SYBR Green I sendo diluído para 1,2X e as soluções milimolares NBT 20 estão agora preparadas.O gel é colocado em um recipiente de plástico e 16,75 mils do SYBR Green I diluído e 325 mils do NBT a 20 milimolares são adicionados. Em seguida, o recipiente é coberto com Parafilm e papel alumínio e agitado a 60 rpm por 25 minutos. Finalmente, a folha de alumínio e um Parafilm são removidos e o gel é exposto à luz solar ou a uma fonte de luz azul.Para quantificação de banda e curvas de calibração, o gel é colocado em um scanner de escritório e, em seguida, a imagem é analisada usando um software de análise de imagem. Finalmente, é feito um enxerto de sinal normalizado versus concentração. Um gel de agarose é feito.Os poços são carregados com um plasmídeo que tem resistência à ampicilina e o gel é cortado em dois pedaços, cada um dos quais é corado com uma coloração diferente. Em seguida, a banda plasmidial é extraída e transformada por transformação química em células competentes com meios que contêm ampicilina. Um gel de agarose a 1% é preparado em tampão TAE 1X e carregado com quatro microlitros de plasmídeo a cerca de 100 nanogramas por microlitro.O gel na câmara de eletroforese é então executado a 100 volts por uma hora. Metade do gel é corada com o método SYBR Green I e NBT e a outra metade com o método SYBR Green I UV. Para gel de agarose, o método SYBR Green I NBT é realizado usando SBYR Green I em uma concentração de 1,2X e NBT em 2 milimolares.O gel é colocado em um recipiente de plástico e o volume da solução é dimensionado para cobrir o gel e o tempo de agitação é estendido para uma hora. Para géis de agarose, o método SYBR Green I comumente usado é realizado cobrindo o gel com a solução 1X SYBR Green I e mexendo por uma hora. Em seguida, o gel é exposto a um transiluminador UV para visualização da banda por dois minutos.Uma vez que o gel é corado, a banda de plasmídeo é cortada com um bisturi e o plasmídeo extraído com um kit de extração comercial. O DNA é normalizado para 9,1 nanogramas por microlitro para transformar bactérias Escherichia coli XL 10 competentes em produtos químicos. Finalmente, as colônias são contadas.As unidades formadoras de colônias são calculadas. O resultado é enxertado e os resultados obtidos do SYBR Green I NBT e do SYBR Green I UV são comparados. Um precipitado de formazan roxo aparece onde o DNA está localizado.No experimento, uma escada de DNA foi carregada para fazer uma curva de calibração com um limite de detecção de 192 picogramas a 1.500 pares de bases. O uso de géis de agarose permite a recuperação da amostra utilizando kit disponível comercialmente e não interfere na extração. Alguma recuperação usando este método com LED azul resulta em melhor qualidade em comparação com o SYBR Green I usando transiluminador.

dna-staining-method-based-on-formazan-precipitation-induced-blue

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Corantes FM tem sido de inestimável ajuda na compreensão da dinâmica sináptica. FMs são normalmente seguidos sob o microscópio de fluorescência em condições de estimulação diferente. No entanto, fotoconversão de corantes FM combinado com microscopia eletrônica permite a visualização de distintas piscinas das vesículas sinápticas, entre outros componentes ultra-estrutura, em boutons sináptica.

Estudando Pools vesículas Synaptic usando fotoconversão de Corantes Styryl

Técnicas de visualização da retina citoarquitetura diretamente adjacente a eletrodos individuais dentro de um estimulador da retina.

Técnicas de Processamento de Olhos implantados com uma prótese de retina para análise histopatológica localizada

Central ao campo da patogénese bacteriana é a capacidade de definir se e como os micróbios sobrevivem após exposição a células eucarióticas. Este artigo descreve protocolos para a utilização de corantes fluorescentes que revelam a viabilidade das bactérias individuais dentro e associados com as células hospedeiras.

Fluorescência métodos de microscopia para determinar a viabilidade de bactérias em associação com células de mamíferos

Aqui, apresentamos um método simples para realizar hibridização in situ de DNA de fluorescência (DNA ISH) para visualizar sequências heterocromáticas repetitivas em cromossomos montados em lâminas. O método requer reagentes mínimos e é versátil para uso com sondas curtas ou longas, tecidos diferentes e detecção com sinais baseados em fluorescência ou não fluorescência.

Método simples para DNA de Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação com Cromossomos Squashed

Nós descrevemos um monte de todo o processo de hibridação in situ multi-alvo cromogénico (MC-DESEJO) em embriões de Drosophila intactas permitindo a detecção simultânea e específica de três padrões de distribuição mRNA diferentes, contrastando precipitados de cor.

Multi-alvo Chromogenic Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização para Comparando Expressão Gênica em Domínios<em&gt; Drosophila</em&gt; Os embriões

As infecções por biofilme mostram alta tolerância à quimioterapia. Nenhum ensaio captura a complexidade dos biofilmes. Em vez disso, são necessários ensaios complementares. Apresentamos uma plataforma de triagem (desenvolvida para S. aureus) que combina ensaios de viabilidade, biomassa e matriz de biofilme. Permite a descoberta de medicamentos anti-biofilme, incluindo a avaliação dos efeitos quimioterápicos a longo prazo.

A Plataforma de Ensaios Anti-biofilme adequado para a Exploração de bibliotecas de compostos naturais

Compreender a função dos processos essenciais de bactérias é um desafio. Microscopia de fluorescência com corantes de destino específico pode fornecer insights-chave em progressão de crescimento e ciclo celular de células microbianas. Aqui, a Agrobacterium tumefaciens é usado como uma bactéria modelo para destacar métodos para geração de imagens de células vivas para a caracterização de processos essenciais.

Viver a microscopia de fluorescência da célula para observar os processos essenciais durante o crescimento de células microbianas

Aqui, apresentamos um protocolo para usar tiazol laranja para a detecção de DNA em experimentos de electroforese do gel. O uso de laranja tiazol permite a eliminação do brometo de etídio, e detecção de fluorescência pode ser obtida com UV ou luz azul.

Eletroforese de DNA usando tiazol laranja em vez de brometo de etídio ou corantes alternativos

Aqui, apresentamos uma implementação de MATLAB de detecção automatizada e descrição quantitativa de gotas lipídicas em imagens de microscopia de fluorescência de fissão e brotamento de células de levedura.

Análise de conteúdo de gotas lipídicas em leveduras de fissão e brotamento usando processamento automatizado de imagens

O protocolo descreve rotulagem específica de nucleóides mitocondriais com uma mancha de gel de DNA comercialmente disponível, aquisição de série de lapso de tempo de células rotuladas ao vivo por microscopia de iluminação estruturada de super resolução (SR-SIM) e rastreamento automático do movimento nucleóide.

Rotulagem específica de nucleóides mitocondriais para microscopia estruturada de iluminação com lapso de tempo

Esse protocolo introduz uma metodologia de triagem fluorométrica otimizada para identificar inibidores naturais de produtos e pequenas moléculas na síntese de proteínas. Sua praticidade o torna adequado tanto para o ensino de graduação em técnicas de descoberta de fármacos quanto para a implementação em campanhas de química medicinal.

Um Protocolo Baseado em Fluorescência para Triagem Preliminar de Inibidores de Síntese de Proteínas de Fontes Naturais

Aprenda um método simples de coloração de DNA em géis usando SYBR Green I e NBT com luz azul. Esta técnica permite quantificação rápida sem equipamento complexo, ideal para aplicações em campo.

Método baseado na precipitação de Formazan induzida pela exposição à luz azul de coloração de DNA

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