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Advanced Biology

O Ensaio de Bioluminescência de ATP

The ATP Bioluminescence Assay

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Cell Biology

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JoVE Science Education Cell Biology

The ATP Bioluminescence Assay

4.10: An Introduction to Cell Metabolism

4.13: An Introduction to Cell Death

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08:32 min

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April 30, 2023

Overview

Em vagalumes, a enzima luciferase converte um composto chamado luciferina em oxiluciferina, e produz luz ou “luminescência” como resultado. Essa reação requer energia derivada da ATP para prosseguir, de modo que os pesquisadores têm explorado a interação luciferase-luciferina para medir os níveis de ATP nas células. Dado o papel da ATP como moeda de energia da célula, o ensaio de bioluminescência da ATP pode fornecer insights sobre o metabolismo celular e a saúde geral das células.

Neste vídeo, o JoVE discute a respiração celular, revisando especificamente como o metabolismo da glicose resulta na produção de ATP. Isso é seguido por princípios por trás do ensaio de bioluminescência da ATP e um protocolo generalizado para esta técnica. Finalmente, um levantamento de como os pesquisadores estão usando atualmente o ensaio de bioluminescência da ATP para avaliar a viabilidade celular em uma variedade de condições experimentais.

Procedure

O ensaio de bioluminescência ATP é uma técnica comum usada para quantificar os níveis de ATP e detectar células vivas e metabolicamente ativas. ATP ou triptosfato de adenosina é a principal fonte de energia para todos os organismos vivos, e por “todos” queremos dizer ALL. No nível celular, a ATP é gerada através de um conjunto de processos metabólicos chamados respiração celular.

Hoje, discutiremos brevemente os caminhos envolvidos na respiração celular. Em seguida, apresentaremos os princípios por trás do ensaio de bioluminescência da ATP, e passaremos por um protocolo passo-a-passo para a execução deste método. Finalmente, veremos como os cientistas estão aplicando essa técnica em suas pesquisas atuais.

Vamos começar introduzindo a respiração celular. Este fenômeno envolve vários processos metabólicos, mas vamos nos concentrar no que lida com o metabolismo da glicose.

No citoplasma, a via de glicolise converte glicose em piruvato, e no processo gera duas moléculas DE ATP. O piruvato é transportado para as mitocôndrias, onde é convertido em aconzyme A – um processo que também gera dióxido de carbono. Ainda nas mitocôndrias, acetil-coenzima A então entra no ácido tricarboxílico ou ciclo TCA, durante o qual o dióxido de carbono é novamente gerado, assim como as moléculas de alta energia de NADH e FADH2. Essas moléculas finalmente “transportam” elétrons para a cadeia de transporte de elétrons ou ETC.

Dentro do ETC, os elétrons são transferidos sequencialmente entre diferentes complexos proteicos na membrana mitocondrial interna, antes de converter oxigênio em água. Durante esse processo, os prótons são “bombeados” para o espaço intermembrano das mitocôndrias. A ATP é realmente produzida quando esses prótons entram de volta na matriz mitocondrial à medida que passam por uma proteína chamada atp synthase. Juntos, o ciclo TCA e etc resultam na síntese de 36 moléculas de ATP. A decomposição de outras moléculas de nutrientes, como gorduras e proteínas, também pode alimentar o ciclo TCA e etc, levando à produção de ATP.

Agora que sabemos como as células geram ATP, vamos aprender sobre os princípios por trás do ensaio de bioluminescência ATP, que é comumente usado para medir níveis intracelulares desta molécula.

Estruturalmente, a ATP tem uma base de adenina, um açúcar de costela e três grupos de fosfato — este último conectado por ligações de alta energia. Esses títulos liberam energia quando quebrados, e o ensaio de bioluminescência da ATP capitaliza essa energia.

Basicamente, este ensaio requer o composto de luciferina, que é obtido de organismos “brilhantes” como vagalumes, e sua enzima catalisador correspondente chamada luciferase. Na presença de oxigênio, a luciferase deriva energia da ATP e converte a luciferina em oxiluciferina. Os subprodutos dessa reação são pirofosfato, que são dois grupos de fosfato obtidos da ATP — convertendo-o em monofosfato de adenosina ou AMP — dióxido de carbono e luz ou luminescência. A luminescência é lida por um luminômetro, uma máquina que quantifica a emissão de luz. Uma vez que a quantidade de luminescência produzida é diretamente proporcional à quantidade de ATP, isso serve a um bom indicador de viabilidade celular e metabolismo.

Agora que você entende os princípios por trás do ensaio de bioluminescência da ATP, vamos delinear um protocolo geral.

Primeiro, as células são semeadas em uma placa de 96 poços contendo mídia cultural. As células são banhadas em várias densidades em triplicado, para explicar a variação dependente da densidade. Uma vez que os poços externos não são cercados por outros poços nos quatro lados, a temperatura e a taxa de evaporação nesses poços podem ser variáveis. Portanto, as células não são banhadas nos poços externos e, em vez disso, são preenchidas com água para evitar a evaporação em toda a placa e a variação de temperatura que podem afetar a reação. As placas são então incubadas durante a noite a 37°C para permitir que as células aderam às placas de cultura.

Em seguida, a mídia é removida, luciferase e luciferina são adicionadas a cada poço, e a placa é colocada em um shaker por 5-15 minutos para facilitar a reação. Em seguida, uma parte da mistura de cada poço é transferida para uma placa branca de 96 poços; placas brancas são frequentemente usadas à medida que refletem a luz para cima, permitindo leituras de luminescência mais precisas. Além disso, as bolhas devem ser evitadas, pois podem interferir com análises subsequentes. Como o sinal de luminescência pode diminuir com o tempo, a placa é lida dentro de 10-12 minutos em um luminômetro.

Para analisar os resultados do luminômetro, um valor médio de luminescência é calculado a partir de poços com a mesma densidade celular. Comparando dados de luminescência coletados dessa forma tanto de amostras de controle saudável quanto de células tratadas, os pesquisadores podem avaliar os efeitos de um tratamento específico sobre viabilidade e metabolismo — especificamente procurando a diminuição da luminescência no grupo experimental.

Agora que você já viu como realizar um ensaio de bioluminescência ATP, vamos discutir suas aplicações de pesquisa.

Os cientistas estão sempre tentando desenvolver novos antivirais que não prejudicam ou matam células hospedeiras. Neste estudo, as células mamíferas foram semeadas em uma placa multiwell e infectadas com um vírus específico. Vários compostos antivirais foram adicionados a essas amostras, e curvas de concentração-resposta de tronco foram geradas para calcular a concentração efetiva de cinquenta ou 50. EC50 é a concentração de composto em que a viabilidade celular é de 50%. Este é um parâmetro comumente usado para avaliar a citotoxicidade de um composto.

Os níveis de ATP também podem dar pistas sobre a atividade mitocondrial em várias condições. Aqui, o ensaio de bioluminescência da ATP foi realizado em preparações de mitocôndrias derivadas de fígado de roedores e células musculares, o que ajudou os pesquisadores a avaliar a extensão da função mitocondrial em tecidos normais. É importante ressaltar que este protocolo poderia ser estendido para fornecer uma maneira de examinar a função mitocondrial em estados de doença.

Os cientistas também estão usando este ensaio para investigar possíveis tratamentos contra o câncer em sistemas in vivo. Neste exemplo, as células tumorais humanas foram modificadas para expressar a luciferase e injetadas no cérebro de camundongos vivos. Depois que as células tumorais se estabeleceram nesses animais, elas foram tratadas com uma droga anticâncular. Um ensaio subsequente de bioluminescência in vivo ATP revelou que as células tumorais em camundongos expostos a medicamentos tinham níveis de ATP mais baixos.

Você acabou de assistir a introdução de JoVE ao ensaio de bioluminescência da ATP. Agora você deve estar familiarizado com as vias de respiração celular e o protocolo usado para medir ATP, que é o produto final dessas vias. O ensaio de bioluminescência da ATP serve como uma excelente ferramenta de triagem para biólogos celulares interessados em estudar o efeito de fatores fisiológicos e patológicos no metabolismo celular e na viabilidade. Como sempre, obrigado por assistir!

Transcript

The ATP bioluminescence assay is a common technique used to quantify ATP levels and detect living, metabolically active cells. ATP or adenosine triphosphate is the primary source of energy for all living organisms, and by “all” we mean ALL. At the cellular level, ATP is generated through a set of metabolic processes called cellular respiration.

Today, we’ll briefly discuss the pathways involved in cellular respiration. Next, we’ll introduce the principles behind the ATP bioluminescence assay, and go through a step-by-step protocol for performing this method. Finally, we’ll see how scientists are applying this technique in their current research.

Lets begin by introducing cellular respiration. This phenomenon involves several metabolic processes, but we’ll focus on the one dealing with glucose metabolism.

In the cytoplasm, the glycolysis pathway converts glucose to pyruvate, and in the process generates two ATP molecules. Pyruvate is transported into the mitochondria, where it is converted to acetyl-coenzyme A—a process that also generates carbon dioxide. While still in the mitochondria, acetyl-coenzyme A then enters the tricarboxylic acid or TCA cycle, during which carbon dioxide is again generated, as are the high-energy molecules of NADH and FADH2. These molecules ultimately “carry” electrons into the electron transport chain or ETC.

Within the ETC, electrons are sequentially transferred between different protein complexes in the inner mitochondrial membrane, before converting oxygen to water. During this process, protons are “pumped” into the intermembrane space of mitochondria. ATP is actually produced when these protons enter back into the mitochondrial matrix as they pass through a protein called ATP synthase. Together, the TCA cycle and ETC result in the synthesis of 36 ATP molecules. Breakdown of other nutrient molecules, such as fats and proteins, can also feed into the TCA cycle and ETC, leading to ATP production.

Now that we know how cells generate ATP, let’s learn about the principles behind the ATP bioluminescence assay, which is commonly used to measure intracellular levels of this molecule.

Structurally, ATP has an adenine base, a ribose sugar, and three phosphate groups—the latter of which are connected by high-energy bonds. These bonds release energy when broken, and the ATP bioluminescence assay capitalizes on this energy.

Basically, this assay requires the luciferin compound, which is obtained from “glowing” organisms like fireflies, and its corresponding catalyst enzyme called luciferase. In the presence of oxygen, luciferase derives energy from ATP and converts luciferin into oxyluciferin. Byproducts of this reaction are pyrophosphate, which is two phosphate groups obtained from ATP—converting it to adenosine monophosphate or AMP—carbon dioxide, and light or luminescence. Luminescence is read by a luminometer, a machine that quantifies light emission. Since the amount of luminescence produced is directly proportional to the amount of ATP, this serves a good indicator of cell viability and metabolism.

Now that you understand the principles behind the ATP bioluminescence assay, let’s outline a general protocol.

First, cells are seeded in a 96-well plate containing culture media. Cells are plated at various densities in triplicate, to account for density-dependent variation. Since the outer-most wells are not surrounded by other wells on all four sides, the temperature and evaporation rate in these wells may be variable. Therefore, cells are not plated in the outer wells, and instead they are filled with water to avoid plate-wide evaporation and temperature variation that may affect the reaction. Plates are then incubated overnight at 37°C to allow the cells to adhere to the culture plates.

Then, the media is removed, luciferase and luciferin are added to each well, and the plate is placed on a shaker for 5–15 minutes to facilitate the reaction. Next, a portion of the mixture from each well is transferred to a white 96-well plate; white plates are often used as they reflect light upwards, allowing for more accurate luminescence readings. In addition, bubbles should be avoided, as they could interfere with subsequent analyses. As the luminescence signal can decrease over time, the plate is read within 10–12 minutes on a luminometer.

To analyze the luminometer results, an average luminescence value is calculated from wells with the same cell density. By comparing luminescence data collected in this manner from both healthy control samples and treated cells, researchers can evaluate the effects of a specific treatment on viability and metabolism—specifically by looking for decreased luminescence in the experimental group.

Now that you’ve seen how to perform an ATP bioluminescence assay, let’s discuss its research applications.

Scientists are always trying to develop new antivirals that don’t harm or kill host cells. In this study, mammalian cells were seeded in a multiwell plate and infected with a specific virus. Various antiviral compounds were added to these samples, and log concentration-response curves were generated to calculate the effective concentration fifty or EC50. EC50 is the concentration of compound at which cell viability is 50 percent. This is a commonly used parameter to assess a compound’s cytotoxicity.

ATP levels can also yield clues about mitochondrial activity under various conditions. Here, the ATP bioluminescence assay was performed on preparations of mitochondria derived from rodent liver and muscle cells, which helped researchers assess the extent of mitochondrial function in normal tissues. Importantly, this protocol could be extended to provide a way to examine mitochondrial function in disease states.

Scientists are also using this assay to investigate potential cancer treatments in in vivo systems. In this example, human tumor cells were modified to express luciferase and injected into the brains of living mice. After the tumor cells became established in these animals, they were treated with an anti-cancer drug. A subsequent in vivo ATP bioluminescence assay revealed that tumor cells in drug-exposed mice had lower ATP levels.

You’ve just watched JoVE’s introduction to the ATP bioluminescence assay. You should now be familiar with the cellular respiration pathways and the protocol used to measure ATP, which is the end product of these pathways. The ATP bioluminescence assay serves as an excellent screening tool for cell biologists interested in studying the effect of physiological and pathological factors on cell metabolism and viability. As always, thanks for watching!

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