O Ensaio de Bioluminescência de ATP

O ensaio de bioluminescência ATP é uma técnica comum usada para quantificar os níveis de ATP e detectar células vivas e metabolicamente ativas. ATP ou triptosfato de adenosina é a principal fonte de energia para todos os organismos vivos, e por "todos" queremos dizer ALL. No nível celular, a ATP é gerada através de um conjunto de processos metabólicos chamados respiração celular.

Hoje, discutiremos brevemente os caminhos envolvidos na respiração celular. Em seguida, apresentaremos os princípios por trás do ensaio de bioluminescência da ATP, e passaremos por um protocolo passo-a-passo para a execução deste método. Finalmente, veremos como os cientistas estão aplicando essa técnica em suas pesquisas atuais.

Vamos começar introduzindo a respiração celular. Este fenômeno envolve vários processos metabólicos, mas vamos nos concentrar no que lida com o metabolismo da glicose.

No citoplasma, a via de glicolise converte glicose em piruvato, e no processo gera duas moléculas DE ATP. O piruvato é transportado para as mitocôndrias, onde é convertido em aconzyme A - um processo que também gera dióxido de carbono. Ainda nas mitocôndrias, acetil-coenzima A então entra no ácido tricarboxílico ou ciclo TCA, durante o qual o dióxido de carbono é novamente gerado, assim como as moléculas de alta energia de NADH e FADH2. Essas moléculas finalmente "transportam" elétrons para a cadeia de transporte de elétrons ou ETC.

Dentro do ETC, os elétrons são transferidos sequencialmente entre diferentes complexos proteicos na membrana mitocondrial interna, antes de converter oxigênio em água. Durante esse processo, os prótons são "bombeados" para o espaço intermembrano das mitocôndrias. A ATP é realmente produzida quando esses prótons entram de volta na matriz mitocondrial à medida que passam por uma proteína chamada atp synthase. Juntos, o ciclo TCA e etc resultam na síntese de 36 moléculas de ATP. A decomposição de outras moléculas de nutrientes, como gorduras e proteínas, também pode alimentar o ciclo TCA e etc, levando à produção de ATP.

Agora que sabemos como as células geram ATP, vamos aprender sobre os princípios por trás do ensaio de bioluminescência ATP, que é comumente usado para medir níveis intracelulares desta molécula.

Estruturalmente, a ATP tem uma base de adenina, um açúcar de costela e três grupos de fosfato — este último conectado por ligações de alta energia. Esses títulos liberam energia quando quebrados, e o ensaio de bioluminescência da ATP capitaliza essa energia.

Basicamente, este ensaio requer o composto de luciferina, que é obtido de organismos "brilhantes" como vagalumes, e sua enzima catalisador correspondente chamada luciferase. Na presença de oxigênio, a luciferase deriva energia da ATP e converte a luciferina em oxiluciferina. Os subprodutos dessa reação são pirofosfato, que são dois grupos de fosfato obtidos da ATP — convertendo-o em monofosfato de adenosina ou AMP — dióxido de carbono e luz ou luminescência. A luminescência é lida por um luminômetro, uma máquina que quantifica a emissão de luz. Uma vez que a quantidade de luminescência produzida é diretamente proporcional à quantidade de ATP, isso serve a um bom indicador de viabilidade celular e metabolismo.

Agora que você entende os princípios por trás do ensaio de bioluminescência da ATP, vamos delinear um protocolo geral.

Primeiro, as células são semeadas em uma placa de 96 poços contendo mídia cultural. As células são banhadas em várias densidades em triplicado, para explicar a variação dependente da densidade. Uma vez que os poços externos não são cercados por outros poços nos quatro lados, a temperatura e a taxa de evaporação nesses poços podem ser variáveis. Portanto, as células não são banhadas nos poços externos e, em vez disso, são preenchidas com água para evitar a evaporação em toda a placa e a variação de temperatura que podem afetar a reação. As placas são então incubadas durante a noite a 37°C para permitir que as células aderam às placas de cultura.

Em seguida, a mídia é removida, luciferase e luciferina são adicionadas a cada poço, e a placa é colocada em um shaker por 5-15 minutos para facilitar a reação. Em seguida, uma parte da mistura de cada poço é transferida para uma placa branca de 96 poços; placas brancas são frequentemente usadas à medida que refletem a luz para cima, permitindo leituras de luminescência mais precisas. Além disso, as bolhas devem ser evitadas, pois podem interferir com análises subsequentes. Como o sinal de luminescência pode diminuir com o tempo, a placa é lida dentro de 10-12 minutos em um luminômetro.

Para analisar os resultados do luminômetro, um valor médio de luminescência é calculado a partir de poços com a mesma densidade celular. Comparando dados de luminescência coletados dessa forma tanto de amostras de controle saudável quanto de células tratadas, os pesquisadores podem avaliar os efeitos de um tratamento específico sobre viabilidade e metabolismo — especificamente procurando a diminuição da luminescência no grupo experimental.

Agora que você já viu como realizar um ensaio de bioluminescência ATP, vamos discutir suas aplicações de pesquisa.

Os cientistas estão sempre tentando desenvolver novos antivirais que não prejudicam ou matam células hospedeiras. Neste estudo, as células mamíferas foram semeadas em uma placa multiwell e infectadas com um vírus específico. Vários compostos antivirais foram adicionados a essas amostras, e curvas de concentração-resposta de tronco foram geradas para calcular a concentração efetiva de cinquenta ou 50. EC50 é a concentração de composto em que a viabilidade celular é de 50%. Este é um parâmetro comumente usado para avaliar a citotoxicidade de um composto.

Os níveis de ATP também podem dar pistas sobre a atividade mitocondrial em várias condições. Aqui, o ensaio de bioluminescência da ATP foi realizado em preparações de mitocôndrias derivadas de fígado de roedores e células musculares, o que ajudou os pesquisadores a avaliar a extensão da função mitocondrial em tecidos normais. É importante ressaltar que este protocolo poderia ser estendido para fornecer uma maneira de examinar a função mitocondrial em estados de doença.

Os cientistas também estão usando este ensaio para investigar possíveis tratamentos contra o câncer em sistemas in vivo. Neste exemplo, as células tumorais humanas foram modificadas para expressar a luciferase e injetadas no cérebro de camundongos vivos. Depois que as células tumorais se estabeleceram nesses animais, elas foram tratadas com uma droga anticâncular. Um ensaio subsequente de bioluminescência in vivo ATP revelou que as células tumorais em camundongos expostos a medicamentos tinham níveis de ATP mais baixos.

Você acabou de assistir a introdução de JoVE ao ensaio de bioluminescência da ATP. Agora você deve estar familiarizado com as vias de respiração celular e o protocolo usado para medir ATP, que é o produto final dessas vias. O ensaio de bioluminescência da ATP serve como uma excelente ferramenta de triagem para biólogos celulares interessados em estudar o efeito de fatores fisiológicos e patológicos no metabolismo celular e na viabilidade. Como sempre, obrigado por assistir!