Name: Ácidos graxos saturados induzir a morte celular de macrófagos associada a ceramida (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Aprenda a derivar macrófagos primários de murinos e preparar conjugados de ácido graxo-BSA para estudar a morte celular induzida por ácidos graxos saturados e sua associação com níveis de ceramida.

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Este trabalho foi financiado parcialmente pelos fundos de start-up de Universidade de Louisville e Instituto Nacional de câncer (Bethesda, MD) concede R01CA177679, R01CA180986.

o protocolo foi aprovado pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade de Louisville e institucional Cuidado Animal.
 1. macrófagos derivados do Mouse da medula óssea (BMDMs) <ol><li>Euthanize um mouse de 6 a 8 semanas de idade, saudável tipo selvagem usando CO 2. Fixá-lo até uma placa de espuma e pulverizá-la com 70% de etanol até que esteja encharcada. Remova os ossos fêmur/tíbia com pinças e tesouras. Colocá-los em um tubo de ensaio com 5 mL 1 x tampão fosfato salino (PBS). Executar todos os procedimentos sob condições estéreis.</li>
	<li>Abrir ambas as extremidades do osso fêmur/tíbia com uma tesoura numa vizinhança de cultura de tecido estéril. Limpar o osso com uma agulha 25g com PBS + 2% de soro fetal bovino (FBS) em um tubo de 15 mL.</li>
	<li>Centrifugar as células de medula óssea em 500 x g, 4 ° C por 5 min.</li>
	<li>Ressuspender as células em tampão de lise de células vermelhas do sangue de 1 mL para lisar os glóbulos vermelhos (RBC) para menos de 1 min. dilua imediatamente com 9 mL 1X PBS. Centrifugue novamente como na etapa 1.3. Decantar os sobrenadantes.</li>
	<li>Ressuspender as células em 10 mL 1X PBS, filtrar a suspensão de células através de uma malha de nylon estéril 40 μm em outro tubo de 15 mL para remover detritos/aglomerados de células. Centrifugue novamente como em 1.3. Decantar os sobrenadantes.</li>
	<li>Ressuspender as células em 15 mL de Roswell Park Memorial Institute médio (RPMI 1640) com 5% FBS e 10 gentamicina μg/mL, placa, que as células em um prato de cultura de tecidos de 100mm no 37 o C incubadora para 60 min. Agite suavemente o prato, retire o flutuante células e contá-los.</li>
	<li>Placa 6 x 10 6 células em um prato de 100 mm com macrófagos 12ml diferenciando mídia (RPMI 1640 com 5% FBS e gentamicina 10 μg/mL, misturado com 30% L929 condicionado media 10) com macrófagos de rato recombinante 10 ng/mL fator colônia-estimulando (M-CSF) por 2 dias.</li>
	<li>Após cultivo para 2 dias em uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO 2, alimentar cada prato com macrófagos fresco 6ml, diferenciando a mídia com M-CSF de 10 ng/mL.</li>
	<li>No dia 5, pegue 8 mL da velha mídia fora sem perturbar as células e adicione macrófago fresco 10ml, diferenciando a mídia com M-CSF de 10 ng/mL.</li>
	<li>No dia 7, colher os macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) usando um levantador de célula. 
	Nota: Os macrófagos anexados também podem ser dissociados com 5 mL, 1 mM EDTA em 1X PBS durante 5 a 10 min após a remoção das células de flutuador e lavar a placa duas vezes com 5 mL 1X PBS. Centrifugar as células como na etapa 1.3. ressuspendê-los no macrófago fresco diferenciando mídia e contá-las com um hemocytometer.
	<ol><li>Confirmar os BMDMs &#39; fenótipo por citometria de fluxo como descrito 5. Preparar o mouse derivado de macrófagos em uma certa concentração para os estudos seguintes.</li>
	</ol></li></ol> 2. BSA-graxos ácido conjugado preparação <ol><li>preparar 2mm BSA em PBS estéril. Por exemplo, pesar g 6,65 BSA, adicionar 30 mL 1X PBS para dissolver, em seguida, adicione mais PBS até 50 mL, dimensionamento de componentes para fazer 2 mM BSA em 1X PBS.</li>
	<li>Prepare sal de sódio individuais 5mm de ácidos graxos em 2mm BSA. Aqueça a 37 ° C ou superior, se necessário e proceda à sonicação a mistura de 2 mM BSA e sal de sódio de ácidos graxos, até à obtenção de uma solução clara. 
	Nota: Em comparação com ácidos graxos insaturados, ácidos graxos saturados precisa de uma temperatura mais elevada e mais uma vez sonication para dissolver-se.</li>
	<li>Filtrar a solução graxos-ácido-BSA através um 0,22 μm filtro, alíquota em 1,5 mL estéril microcentrifuga tubos e armazená-los em 4 ° C, para uso de curto prazo ou a-20 ° C para armazenamento a longo prazo. Nenhuma precipitação deve ser observada após armazenagem a 4 ° C, na geladeira.</li>
</ol> 3. Saturado de ácidos graxos induzir célula morte do Mouse medula óssea derivada macrófagos <ol><li>os BMDMs em uma placa de cultura de tecido de 24-poço da placa com 0.4 x 10 6 /mL no macrófago diferenciando mídia.</li>
	<li>Tratar as células com a 0,4 mM o ácido palmítico e ácido esteárico para 16 a 24 h em uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO 2. Use o BSA como controlo negativo.</li>
	<li>Colher as células com um tirante de célula após o tratamento e spin para baixo as células a 500 x g, 4 ° C por 5 min.</li>
	<li>Mancha as células com anexina V-Alexa 488 e D aminoactinomycin-7 (7-AAD) em 100 μL anexina tampão de ligação V durante 15 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Diluir a amostra com 200 µ l de tampão de ligação anexina, misture delicadamente e, em seguida, manter as amostras no gelo após o período de incubação.</li>
	<li>Analisar as células coradas logo que possível por citometria de fluxo 5. Anexina V-Alexa 488 é detectado no canal FITC e 7-AAD é detectado no canal PerCP/PerCP-Cy5.5.</li>
</ol> 4. Coloracao intracelular de ceramida <ol><li>após o tratamento de ácido graxo, colhem as células como na etapa 3.3. Em seguida, corrigir as células em paraformaldeído 4% durante 30 min.</li>
	<li>Lavar a amostra com 1 mL 1X PBS, spin para baixo como passo em 3.3 e decante o sobrenadante.</li>
	<li>Manchar as células com anticorpo primário anticeramida (diluição de 1: 200) em 100 buffer de permeabilização de 1x μL de 30 min.</li>
	<li>Lavagem e a centrifugação para baixo as células novamente como na etapa 4.2.</li>
	<li>Manchar as células com anticorpo secundário de anti-rato IgM (diluição 1: 500) em 100 buffer de permeabilização de 1x μL de 30 min.</li>
	<li>Lavagem e a centrifugação para baixo as células novamente como na etapa 4.2. Adicionar 250 μL 1X PBS e analisar as células manchadas por citometria de fluxo 5. 
	Nota: Consulte a lista de reagente detalhadas na tabela de equipamentos e reagentes.</li>
</ol>

<ol><li>Martins de Lima, T., Cury-Boaventura, M. F., Giannocco, G., Nunes, M. T., Curi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+toxicity+of+fatty+acids+on+a+macrophage+cell+line+%28J774%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Sci+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Comparative toxicity of fatty acids on a macrophage cell line (J774).</a> Clin Sci (Lond). 111 (5), 307-317 (2006).</li>
<li>Simard, J. R., Zunszain, P. A., Hamilton, J. A., Curry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Location+of+high+and+low+affinity+fatty+acid+binding+sites+on+human+serum+albumin+revealed+by+NMR+drug-competition+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Location of high and low affinity fatty acid binding sites on human serum albumin revealed by NMR drug-competition analysis.</a> J Mol Biol. 361 (2), 336-351 (2006).</li>
<li>Penn, A. H., Dubick, M. A., Torres Filho, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+Acid+Saturation+of+Albumin+Used+in+Resuscitation+Fluids+Modulates+Cell+Damage+in+Shock%3A+In+Vitro+Results+Using+a+Novel+Technique+to+Measure+Fatty+Acid+Binding+Capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Fatty Acid Saturation of Albumin Used in Resuscitation Fluids Modulates Cell Damage in Shock: In Vitro Results Using a Novel Technique to Measure Fatty Acid Binding Capacity.</a> Shock. , (2017).</li>
<li>Vusse, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Albumin+as+fatty+acid+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab+Pharmacokinet%22%5BJournal%5D)">Albumin as fatty acid transporter.</a> Drug Metab Pharmacokinet. 24 (4), 300-307 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+Fatty+Acid+Binding+Protein+Promotes+Saturated+Fatty+Acid-Induced+Macrophage+Cell+Death+through+Enhancing+Ceramide+Production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adipose Fatty Acid Binding Protein Promotes Saturated Fatty Acid-Induced Macrophage Cell Death through Enhancing Ceramide Production.</a> J Immunol. 198 (2), 798-807 (2017).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+Fatty+Acid+binding+protein+promotes+skin+inflammation+induced+by+high-fat+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Epidermal Fatty Acid binding protein promotes skin inflammation induced by high-fat diet.</a> Immunity. 42 (5), 953-964 (2015).</li>
<li>Wen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid-induced+NLRP3-ASC+inflammasome+activation+interferes+with+insulin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fatty acid-induced NLRP3-ASC inflammasome activation interferes with insulin signaling.</a> Nat Immunol. 12 (5), 408-415 (2011).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid-binding+protein+E-FABP+restricts+tumor+growth+by+promoting+IFN-beta+responses+in+tumor-associated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Fatty acid-binding protein E-FABP restricts tumor growth by promoting IFN-beta responses in tumor-associated macrophages.</a> Cancer Res. 74 (11), 2986-2998 (2014).</li>
<li>Ulloth, J. E., Casiano, C. A., De Leon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitic+and+stearic+fatty+acids+induce+caspase-dependent+and+-independent+cell+death+in+nerve+growth+factor+differentiated+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Palmitic and stearic fatty acids induce caspase-dependent and -independent cell death in nerve growth factor differentiated PC12 cells.</a> J Neurochem. 84 (4), 655-668 (2003).</li>
<li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+Marrow-Derived+Macrophages+%28BMM%29%3A+Isolation+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH Protoc. , (2008).</li>
<li>Dansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-affinity+binding+of+very-long-chain+fatty+acyl-CoA+esters+to+the+peroxisomal+non-specific+lipid-transfer+protein+%28sterol+carrier+protein-2%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">High-affinity binding of very-long-chain fatty acyl-CoA esters to the peroxisomal non-specific lipid-transfer protein (sterol carrier protein-2).</a> Biochem J. 339 (Pt 1), 193-199 (1999).</li>
<li>Ulloth, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+methyl-beta-cyclodextrin+toxicity+in+NGF-differentiated+PC12+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Characterization of methyl-beta-cyclodextrin toxicity in NGF-differentiated PC12 cell death.</a> Neurotoxicology. 28 (3), 613-621 (2007).</li>
</ol>

Os autores declaram não há conflitos de interesses financeiros.

A adequada preparação da solução de ácido graxo é de importância crítica para estudar a função biológica dos ácidos graxos. A neutralização do ácido graxo aumenta sua solubilidade em solução aquosa. Entretanto, sais de sódio de ácidos graxos, especialmente ácidos graxos saturados, são ainda de baixa solubilidade em água ou em PBS, como observamos. Um método é usar etanol 95 a 100% para ajudar a dissolver o ácido graxo1. Usando esse método, maior toxicidade às células pode ser observada mesmo em co...

Ácidos gordos desempenham um papel fundamental no metabolismo energético e na síntese de fosfolipídios da membrana em diferentes tipos de células. Ácidos graxos tem uma baixa solubilidade na água. Preparação adequada dos ácidos graxos é de importância crítica para estudar as funções biológicas de ácidos graxos em células de mamíferos. Quando os ácidos graxos são preparados com etanol, muitos ácidos graxos podem mostrar seu efeito tóxico sabão (detergente) na membrana celular, mesmo em concentrações relativamente baixas1. Como um transportador de ácidos graxos livres no soro natural, major, albumina de soro é considerada uma boa operadora para ácidos graxos entrega em vitro para ácidos graxos função ensaios2,3,4. No entanto, os detalhes da preparação do conjugado de ácido graxo e albumina geralmente não estão disponíveis mesmo que muitos trabalhos de pesquisa usando ácidos graxos têm sido publicados.
Os macrófagos altamente expressam epidérmica proteína ligadora de ácidos graxos e adiposa ácido graxo-ligação proteína5,6,7,8. Eles ativamente captação saturados e ácidos graxos insaturados que podem regular suas funções imunológicas. Para estudar o impacto dos ácidos graxos em macrófagos e outras células, diferentes métodos de preparação de ácidos graxos foram aplicadas1,7,9. Usar o ácido graxo adequadamente preparados/soro albumina conjugados para investigar o impacto dos ácidos graxos na função de macrófagos é de fundamental importância na obtenção de dados biologicamente significativos. Estudos sobre o impacto dos ácidos graxos na função do macrófago podem fornecer conhecimentos básicos e alvos terapêuticos relacionados com o metabolismo de ácidos graxos em macrófago envolvendo doenças.

<table><tbody><tr><td>Banho Ultrassônico CPX&nbsp;</td><td>Bransonic</td><td>Modelo 2800</td><td></td></tr><tr><td>Palmitato de sódio (PA)</td><td>Nu-Chek Prep, Inc.</td><td>S-1109</td><td>M.W. 278</td></tr><tr><td>Estearato de sódio (SA)</td><td>Nu-Chek Prep, Inc.</td><td>S-1111</td><td>M.W. 306</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA), livre de ácidos graxos</td><td>Fisher Scientific</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Fator estimulador de colônias de macrófagos de camundongo (mM-CSF)&nbsp;</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular,&nbsp; Inc.</td><td>5228</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>VWR International</td><td>71002-878</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V, Alexa Fluor 488 conjugado</td><td>Fisher Scientific</td><td>A13201</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal anti-ceramida (IgM de camundongo)</td><td>Sigma</td><td>C8104-50TST</td><td>Clone: MID 15B4</td></tr><tr><td>Anticorpo IgM de cabra anti-rato, &micro; cadeia, FITC conjugado</td><td>Sigma</td><td>AP128F</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de fixação</td><td>Biolegend</td><td>420801</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de permeabilização</td><td>Ebioscience</td><td>4307693</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de lise de glóbulos vermelhos&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>11814389001</td><td></td></tr><tr><td>Anexina V Binding Buffer</td><td>BD Biosciences</td><td>556454</td><td></td></tr><tr><td>células L929</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Elevador de Células&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-364</td><td></td></tr><tr><td>Nota: M.W. é para peso molecular.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Ácidos graxos saturados induzir a morte celular de macrófagos associada a ceramida

Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death

Os macrófagos altamente expressam epidérmica proteína ligadora de ácidos graxos e adiposa proteína ligadora de ácidos graxos. Eles ativamente captação saturados e ácidos graxos insaturados, o que pode desempenhar um papel crítico na regulação de suas funções imunológicas. Numerosos estudos têm demonstrado que vários ácidos graxos saturados ou insaturado, podem possuir diferentes impactos sobre o crescimento celular e função. No entanto, variam as abordagens utilizadas para preparação de ácidos graxos, que pode conduzir a resultados não-fisiológica. Albumina de soro, um portador natural de ácidos graxos no sangue periférico dos mamíferos, é recomendada para formando um conjugado complexo com o sal de sódio de ácidos graxos para estudar a função do ácido graxo em células de mamíferos, minimizando assim a toxicidade do sabão de ácidos graxos. Assim, um simples, relativamente rápido aquecimento e sonicating método é desenvolvido e apresentado aqui para formação de conjugado ácida graxos BSA. Descreveremos um protocolo utilizando ácidos graxos saturados, especialmente os ácidos esteárico para induzir a morte celular grave em macrófagos derivado de medula óssea de rato. Mais demonstramos que a morte celular induzida por ácido graxo saturado é positivamente associada com níveis de ceramida celular acumulada. Esse método pode ser estendido para estudos do impacto do ácido graxo em outras células de mamíferos.

Obesidade aumenta as concentrações de ácidos graxos livres no soro. Como fagócitos profissionais, macrófagos ativamente ocupam ácidos graxos para manter a homeostase do anfitrião. Durante estes processos, lipídios sobrecarregados podem induzir a morte celular de macrófagos. Para este fim, nós cultivadas BMDMs em vitro com obesos níveis de dietética de ácidos graxos e a morte celular de macrófagos medido usando fluxo cytometric coloração. Comparado com o controle de BSA, ácidos go...

Ilustramos um método direto para derivar murino macrófagos primários de células da medula óssea e um método simples para preparar o ácido graxo-BSA conjuga. Em seguida, demonstraremos que ácidos graxos saturados pode induzir a morte celular de macrófagos, e essa morte celular é positivamente associado com o acúmulo celular de ceramida níveis.

Macrophages highly express epidermal fatty acid-binding protein and adipose fatty acid-binding protein. They actively uptake saturated and unsaturated ...

O objetivo geral deste experimento, no qual os macrófagos são tratados com ácidos graxos saturados, é demonstrar que a morte celular de macrófagos induzida por ácidos graxos saturados está associada aos níveis celulares acumulados de ceramidas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da inflamação metabólica. Tais como: morte celular induzida por ácidos graxos saturados e inflamação.A principal vantagem desta técnica é fornecer uma abordagem simples, mas detalhada, para impulsionar conjugados de ácidos graxos BSA. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque é um desafio preparar uma solução conjugada de ácidos graxos BSA estável e precisa com resultados consistentes. Comece este procedimento com a remoção dos ossos da tíbia e do fêmur de um camundongo saudável do tipo selvagem sacrificado de seis a oito semanas, conforme descrito no protocolo de texto.Corte as duas extremidades dos ossos da tíbia e do fêmur com uma tesoura e um capuz de cultura de tecidos estéril. Lave os ossos com uma agulha de calibre 25 com PBS mais dois por cento de soro bovino fetal em um tubo de 15 mililitros. Centrifugue as células da medula óssea a 500 g, quatro graus Celsius por cinco minutos.Em seguida, ressuspenda o pellet celular em um mililitro de tampão de lise de glóbulos vermelhos para lisar os glóbulos vermelhos por menos de um minuto. Dilua as células imediatamente com nove mililitros de 1x PBS. Centrifugue novamente, como antes, e decanta o sobrenadante.Ressuspenda o pellet celular em 10 mililitros de 1x PBS. Em seguida, filtre a suspensão celular através de malha de nylon estéril de 40 mícrons em outro tubo de 15 mililitros para remover detritos e aglomerados celulares. Após a centrifugação como antes, ressuspenda o pellet celular em 15 mililitros de Roswell Park Memorial Institute medium 1640 com cinco por cento de FBS e 10 microgramas por mililitro de gentamicina.Em seguida, coloque as células em uma placa de cultura de tecidos de 100 milímetros e coloque-a em uma incubadora de 37 graus Celsius por 60 minutos. Gire suavemente o prato, retire as células flutuantes e conte-as. Em seguida, coloque 6.000.000 células em um prato de 100 milímetros com 12 mililitros de meios de diferenciação de macrófagos e 10 nanogramas por mililitro de fator estimulador de colônias de macrófagos de camundongo recombinante, ou MCSF, por dois dias.Depois de cultivar por dois dias em uma incubadora de 37 graus Celsius com cinco por cento de CO2, alimente cada prato com seis mililitros de meios de diferenciação de macrófagos frescos contendo 10 nanogramas por mililitro de MCSF. No quinto dia, retire oito mililitros do meio antigo sem perturbar as células e adicione 10 mililitros de meios diferenciadores de macrófagos frescos com 10 nanogramas por mililitro de MCSF. No sétimo dia, colha os macrófagos derivados da medula óssea, ou BMDMs, usando um levantador de células.Confirmar o fenótipo dos BMDMs por citometria de fluxo, conforme referenciado no protocolo de texto. Para preparar o conjugado de ácidos graxos BSA, prepare cinco milimolares individuais de sal de sódio de ácidos graxos em dois milimolares BSA. Aqueça a mistura a 37 graus Celsius ou mais, se necessário.Em seguida, aqueça a mistura de dois milimolares BSA e sal de sódio de ácidos graxos até obter uma solução límpida. Após a sonicação, filtrar a solução de ácidos gordos BSA, através de um filtro de 0,22 mícrons. Em seguida, alíquota da solução filtrada em tubos de microcentrífuga estéreis de 1,5 mililitro.Armazene os tubos a quatro graus Celsius para uso de curto prazo ou a menos 20 graus Celsius para armazenamento de longo prazo. Nenhuma precipitação deve ser observada após o armazenamento a quatro graus Celsius na geladeira. Coloque os BMDMs em uma placa de cultura de tecidos de 24 poços com 0,4 milhão de células por mililitro em meios de diferenciação de macrófagos.Trate as células com ácido palmítico 0,4 milimolar e ácido esteárico por 16 a 24 horas em uma incubadora de 37 graus Celsius com cinco por cento de CO2. Use BSA como controle negativo. Colha as células com um levantador de células após o tratamento.Em seguida, gire as células a 500 g, quatro graus Celsius por cinco minutos. Pinte as células com Anexina V-Alexa 488 e 7-AAD em 100 microlitros de tampão de ligação Anexina-V por 15 minutos em temperatura ambiente. Dilua a amostra com 200 microlitros de tampão de ligação de anexina e misture suavemente.Manter as amostras no gelo após o período de incubação. Analise as células coradas o mais rápido possível por citometria de fluxo. A anexina V-Alexa 488 é detectada no canal FITC e a 7-ADD é detectada no canal PerCP PerCP-Cy5.5.Após o tratamento com ácidos graxos, colha as células como antes. Em seguida, fixe as células em quatro por cento de paraformaldeído por 30 minutos. Lave a amostra com um militro de 1x PBS antes de girar a amostra como antes.Após a decantação do sobrenadante, corar as células com Anticorpo Primário Anti-Ceramida em 100 microlitros de 1x Tampão de Permeabilização por 30 minutos. Depois de lavar e centrifugar as células como antes, core as células com anticorpo secundário Anti-IgM de camundongo em 100 microlitros de 1x tampão de permeabilização por 30 minutos. Lave e gire as células novamente como antes.Em seguida, adicione 250 microlitros de 1x PBS e analise as células coradas por citometria de fluxo. Os BMDMs foram cultivados in vitro com níveis obesos de ácidos graxos dietéticos e a morte celular de macrófagos foi medida usando coloração por citometria de fluxo. Em comparação com o controle BSA, os ácidos graxos saturados, em particular os ácidos estéricos, induziram morte celular significativa dos BMDMs.As células mortas foram mostradas como população duplamente positiva corada por Anexina V e 7-AAD. Além disso, a morte celular induzida por ácidos graxos saturados está positivamente associada aos níveis celulares acumulados de ceramida em macrófagos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar conjugações de ácidos graxos BSA e tratar macrófagos com conjugados de ácidos graxos BSA para estudar a morte celular e a inflamação.Em seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da inflamação metabólica explorarem a morte celular induzida por ácidos graxos saturados e a inflamação na obesidade.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Para testar a interação de uma proteína com o seu alvo de lipídios foi utilizado MACS e anexina V conjugada esferas magnéticas e vesículas de lipídios sintetizados a partir de lipídios alvo e fosfatidilserina anexina V vinculativo. Proteínas vinculado à lipídica alvo são co-purificados e analisados ​​após eluição dos grânulos.

Cromatografia de afinidade lipídica mediada por vesículas com separação de células Magnetic Ativado (LIMACS): um novo método para analisar proteínas lipídios Interação

Este vídeo demonstra a ativação de proteínas caspase em macrófagos humanos usando proteínas repórter de complementação de fluorescência bimolecular. Os pró-domínios da caspase-1 são fundidos com fragmentos não fluorescentes de proteínas de Vênus, que são recrutados para complexos inflamassomas. A proximidade dos inflamassomas induz o redobramento e fluorescência dos fragmentos de Vênus, confirmando a ativação da caspase nos macrófagos.

Visualização da ativação de caspase em macrófagos derivados de monócitos humanos

Este vídeo demonstra a avaliação de múltiplas ativações de caspase em macrófagos derivados da medula óssea por meio da estimulação com o vírus influenza. Após a lise dos macrófagos, inativação do lisado pelo calor e centrifugação, as caspases intracelulares são coletadas para análise imunológica subsequente.

Avaliação da ativação de múltiplas caspases em macrófagos

Aqui, apresentamos um protocolo para a determinação de eventos de sinalização intracelular induzidos em células viáveis por interação física com células mortas ou moribundas adjacentes. O protocolo se concentra em eventos de sinalização induzidos pelo reconhecimento mediado por receptor das células mortas, em oposição à sua captação fagocítica ou liberação de mediadores solúveis.

Identificação de sinalização intracelular Eventos induzida em células viáveis ​​pela interação com as células vizinhas Submetidos a apoptose celular Morte

Este protocolo permite que um pesquisador isolar e caracterizar residente em tecido marca de macrófagos em vários tecidos inflamados, extraídos de modelos induzida por dieta de distúrbios metabólicos.

Isolamento, caracterização e purificação dos macrófagos dos tecidos afetados pela inflamação obesidade

Descrevemos a detecção de ativação de inflammasome NLRP3 em bases celulares usando microscopia de fluorescência e mancha para ativa a caspase-1 e o adaptador, ASC. Um ensaio de liberação de lactato desidrogenase é apresentado para detectar pyroptotic lise em uma base de população. Estas técnicas podem ser adaptadas para estudar muitos aspectos da biologia de inflammasome.

Deteção de ativação de Inflammasome e morte celular de Pyroptotic nos macrófagos da medula óssea-derivado murino

Este protocolo descreve o fluxo de trabalho para obter macrófagos derivados de monócitos (MDM) a partir de amostras de sangue humano, um método simples para introduzir eficientemente os repórteres de complementação de fluorescência bimolecular inflamatória (BiFC) em MDM humano sem comprometer a viabilidade e o comportamento celular, e uma abordagem baseada em imagens para medir a ativação inflamatória de caspase em células vivas.

Visualização de Caspases Inflamatórias Induzidas proximidade em macrófagos derivados de monócitos humanos

Este protocolo descreve um método abrangente para avaliar a ativação da caspase (caspase-1, caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9 e caspase-11) em resposta a modelos in vitro e in vivo (em camundongos) de infecção, insultos estéreis e câncer para determinar o início de vias de morte celular, como piroptose, apoptose, necroptose e PANoptose.

Avaliação da ativação da caspase para avaliar a morte de células imunes inatas

Este protocolo é baseado na morte induzida por LPS e ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA. Usamos citometria de fluxo para analisar a coloração dupla de Anexina V e 7-AAD para detectar morte celular, usando a célula inteira e empregando microscopia eletrônica de varredura para observar a morfologia da membrana celular.

Morte induzida por LPS e ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA e sua validação

Mediada por células-linfocitotoxicidade (CML) os ensaios podem ser usados ​​para testar as respostas auto-reativos e mecanismos de estudo de morte celular in vitro. No entanto, usando live-célula confocal técnicas de imagem microscópica com corantes fluorescentes, do tipo e da cinética de morte celular, bem como as vias utilizadas podem ser estudados em maior detalhe.

Métodos para avaliar Mediated Beta Morte celular por linfócitos T citotóxicos

Aprenda a derivar macrófagos primários de murinos e preparar conjugados de ácido graxo-BSA para estudar a morte celular induzida por ácidos graxos saturados e sua associação com níveis de ceramida.

Ácidos graxos saturados induzir a morte celular de macrófagos associada a ceramida

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