Name: Análise de células do sistema imunológico em único nervos ciático e gânglio da raiz Dorsal de um único rato usando citometria de fluxo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: Aprenda a analisar células imunes em nervos ciáticos e gânglios da raiz dorsal de ratos usando citometria de fluxo. Este método permite identificar múltiplos tipos celulares simultaneamente para estudar inflamação e imunopatologia em neuropatias.

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Este estudo foi suportado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; SFB1118). Os autores gostaria de agradecer a Axel Erhardt para execução da maioria da dissecação e prestativamente transmitindo esse conhecimento e Dr. Volker Eckstein para auxiliar no aspecto técnico do citômetro de fluxo.

Camundongos C57BL/6 de tipo selvagem (machos; 10-12 semanas) foram mantidos em ciclo claro/escuro de 12h padrão e foram fornecidos livre acesso à dieta padrão de comida e água. Todas as experiências com animais foram conduzidas de acordo com as orientações pertinentes pelo local Cuidado Animal e uso de Comissão e aprovadas pelo Comitê de uso e cuidado de Animal local na autoridade regional em Karlsruhe, Alemanha (G216/10).
1. perfusão do Mouse
<ol><li>Sacrificar o mouse (C57BL/6; Machos; 10-12weeks) usando o CO2 ou de acordo com os regulamentos locais. Nota: Retro-orbital de sangramento pode ser realizada para obter controle de leucócitos, usando tubos EDTA-revestido 1,5 mL. Este método de sangramento é apenas eficiente imediatamente após o sacrifício. Lavagem da cavidade peritoneal, mais (PCL) pode ser realizada para obter controle de macrófagos, com PBS pré-aquecido a 37 ° C para evitar o fria aglutinação do sangue, que pode dificultar a perfusão.</li>
	<li>Desinfecte o mouse pulverizando a pele sobre o abdômen liberalmente com etanol a 70% v/v e limpando várias vezes com um tecido com gaze de algodão. Com uma tesoura sem corte, cortada a pele abdominal por uma incisão longitudinal.</li>
	<li>Expor a cavidade pleural, primeiro fazer uma incisão no diafragma com uma tesoura curva, contundente e estendendo-se então a incisão ao longo de todo o comprimento da caixa torácica. Fazer um corte semelhante no lado contralateral até o esterno pode ser levantado com cuidado fora.</li>
	<li>Com uma visão clara do coração e os vasos sanguíneos, inserir uma borboleta 23¾ medidor de agulha, conectada a uma seringa de 50 mL cheio de PBS gelado, na câmara esquerda do coração.</li>
	<li>Fazer uma incisão para a aurícula direita do coração com uma tesoura de íris para criar tão grande de uma saída possível sem danificar a aorta descendente e então, pressione suavemente a seringa para empurrar através de aproximadamente 30 mL de PBS. O exsudato deve ser execução claro. A limpeza do fígado e rins / pode ser usada como um indicador de uma boa perfusão.</li>
</ol>2. dissecação do nervo ciático e DRG
Nota: Para a dissecação do nervo ciático, a pele acima do glúteo máximo é removido e o mouse é posicionado lado ventral para baixo enquanto se estenda para os membros inferiores.
<ol><li>Bilateralmente dissecar os nervos ciático todo separando o tecido muscular de coxa dorsal e acompanhar o nervo ao longo da coluna vertebral. Cortou o nervo onde sai da coluna vertebral e imediatamente acima do joelho na outra extremidade. Nota: Evite manipulação excessiva do nervo como esmagamento ou puxar com a pinça.</li>
	<li>Usando fórceps, transferi o nerve(s) extirpado, aproximadamente 2 cm por coragem, de um tubo de 1,5 mL contendo 1 mL de PBS gelado e loja no gelo. Nota: O nervo pode ser armazenado durante a noite no gelo. Nota: Para a dissecação de DRG, usando fórceps e um bisturi, separe a pele do tecido mole subjacente por delicadamente descascando a pele restante volta para expor as regiões da coluna vertebral cervicais, torácicas e lombares. Remova a cabeça cortando na base do crânio usando um brusco par de tesouras.</li>
	<li>Corte as costelas paralelo com e próximo da coluna vertebral de ambos os lados, antes de retirar as vísceras conectado à parte anterior da coluna vertebral. Corte os fêmures e remover a coluna vertebral através de um corte no nível dos fêmures transverso. Usando uma tesoura de íris, cortar qualquer músculo, gordura e outros tecidos moles da coluna vertebral.</li>
	<li>Coloque a coluna vertebral com o lado dorsal voltada para cima e abri-lo, começando pela extremidade caudal, deslizando uma ponta da tesoura dentro do canal vertebral na posição 03:00 e o osso à tesoura. Repita o procedimento na posição de 09:00. Nota: É importante cortar exatamente no centro para não danificar o DRG.</li>
	<li>Repita o corte de lado a lado até a extremidade rostral é atingida e a medula espinhal está completamente exposta. Usando um microscópio de dissecação, remova a medula espinhal para expor os nervos espinhais, que pode ser usados para localizar os DRGs dentro da espinha.</li>
	<li>Remova os DRGs lombares puxando suavemente da raiz dorsal para puxar o DRG até os canais vertebral, em seguida, recorte os nervos e tecido conjuntivo com uma tesoura de íris para remover os DRGs. Nota: É possível restringir a coleção para o DRG L4-L6, que estão contribuindo para o nervo ciático.</li>
	<li>Usando a pinça, transfira os DRGs para um tubo de 1,5 mL contendo aproximadamente 1 mL de PBS gelado e armazenar no gelo. Nota: O nervo pode ser armazenado durante a noite no gelo.</li>
</ol>3. digestão de nervo ciático e DRG
<ol><li>Prepare a mídia de digestão (DMEM, 10 mM HEPES, 5 mg/mL BSA, colagenase 1,6 mg/mL tipo 4) suplementada com 100 µ g/mL de desoxirribonuclease e loja no gelo. Nota: A quantidade de meio de digestão por rato (nervos ciático + DRGs) é de 1 mL. Uma vez preparados, alíquotas de mídia a digestão podem ser armazenadas a-20 ° C.</li>
	<li>Transferi os nervos ciático e DRGs de um rato em tubos separados 1,5 mL contendo 500 µ l de mídia de digestão. Para os nervos ciático, cortar o material em pedaços de 15-20, usando uma tesoura de mola e então incubar as suspensões de tecido em uma tremendo incubadora a 37 ° C por 20 min com agitação suave (≤ 450 rpm).</li>
	<li>Repetidamente, Triture a suspensão de eritrócitos através da ponta da pipeta de 1.000 µ l para dissociar mecanicamente qualquer tecido incompletamente digerido. Nota: Se a suspensão for difícil dosear, então corte a ponta da pipeta com uma tesoura para criar um fim brusco. Incube a 37 ° C por 20 min com agitação suave (≤ 450 rpm) a suspensão de tecido.</li>
	<li>Repita a trituração através de uma ponta da pipeta 1.000 µ l e incube por um mais 10 min a 37 ° C, com agitação suave (≤ 450 rpm).</li>
	<li>Preparar o buffer de FACS (PBS suplementado com 10% de FCS e 1 mM EDTA) e armazenar no gelo. Lave e mergulhe uma tela de aço inoxidável com uma malhagem de 140 µm com buffer de FACS em 60 x 15 mm placa de Petri no gelo. Nota: Filtros de tela de Nylon devem ser evitados, como leva a uma perda significativa do rendimento das células nucleadas.</li>
	<li>Várias vezes passe as suspensões de tecido do filtro de tela 140 µm, pois é realizada sobre o prato de Petri, com pinça de brusco, no gelo. Recolher a suspensão de célula da caixa de Petri e transferi-lo para um novo tubo de 1,5 mL armazenado no gelo.</li>
	<li>Empurre qualquer tecido incompletamente digerido que permanece no filtro através de trituração repetida com uma ponta de pipeta de 1.000 µ l. Lave o filtro de tela duas vezes com 500 µ l de tampão de FACS e coletar a suspensão resultante de célula na caixa de Petri para combinar com a suspensão de células da etapa 3.6. Nota: Se o citômetro de fluxo usado é sensível aos restos, a suspensão de células da etapa 3.7 pode ser passada através de um filtro de tela 70 µm; no entanto, isso pode levar a uma perda do rendimento das células nucleadas.</li>
	<li>Centrifugar as suspensões celulares a 300 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de tampão de FACS. Repita essa etapa de lavagem uma vez.</li>
	<li>Ressuspender as células em 150-350 µ l de tampão de FACS, dependendo do número de coloração que são (150 µ l FACS buffer necessário por painel de coloração).</li>
</ol>4. coloração do nervo ciático e DRG com anticorpos fluorescente etiquetados por citometria de fluxo
<ol><li>Transferi 100 µ l do nervo ciático ou suspensão de células DRG em V em forma de bem em uma placa de 96 poços no gelo. Nota: Células manchadas de Single são necessárias para todos os anticorpos utilizados como eles irão fornecer os controles necessários para configurar a citometria de fluxo em relação a photomultiplier tubo (PMT) ganhos de tensão e compensação, bem como como para ajudar a distinguir específicas de ligação não-específica. Devido o limitada material disponível a partir do nervo ciático e DRGs, sangue, leucócitos e macrófagos de PCL (passos 1.1-1.2) podem ser usados como os controles de single-manchada, a coloração para que deve ser executada em paralelo com a coloração do isquiático nervo e DRGs.</li>
	<li>Piscina as restantes células (aproximadamente 50 µ l por amostra) de suspensões de nervos ciático ou amostras DRG, para servir como um controle imaculado.</li>
	<li>Centrifugue a placa a 400 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante, invertendo a placa sobre o caixote e aplicando um forte movimento do pulso e bata levemente seco sobre papel-toalha.</li>
	<li>Para a coloração da superfície, cada um dos rolos célula Resuspenda em 20 µ l de tampão de FACS contendo os anticorpos de interesse (CD45-A647, CD11b-PerCP/Cy5.5 e MHC classe II-biotina) e incubar, protegido da luz, no gelo por 30 min. Nota: (1) a diluição de anticorpo otima deve ser determinado antes de usar, realizando uma série de diluições de acordo com informações do fabricante do produto; (2) colorações não-específicos podem ser reduzidas pela incubação com Fc-bloco a esta etapa, de acordo com as instruções do fabricante; e (3) do isotipo controle citológicas geralmente não são necessárias ao usar os anticorpos primários diretamente conjugados com um fluoróforo e/ou quando os ou os antigénios de interesse ou produzem populações distintas.</li>
	<li>Adicione 130 µ l de tampão de FACS a cada poço e centrifugar a placa a 400 x g por 5 min a 4 ° C. Como descrito anteriormente (passo 4.3) e lavar as pelotas de célula duas vezes com 150 µ l de tampão de FACS, desprezar o sobrenadante. Nota: Se usar um anticorpo primário unconjugated ou um anticorpo primário conjugado com biotina, então um reagente secundário apropriado, conjugado com um fluoróforo, pode ser adicionado neste ponto e etapas 4.4-4.5 são repetidas. No caso do presente protocolo, streptavidin-PE/Cy7 ou Streptavidin-PerCP foi usado para detectar MHC classe II em combinação com CD45-A647/CD11b-PerCP/Cy5.5, ou em combinação com CD68-APC e F4/80-PE/Cy7, respectivamente.</li>
	<li>Para a fixação, após a última etapa de lavagem, resuspenda as pelotas de célula em 100 µ l de paraformaldeído 4% em PBS (pH 7,4). Incubar a placa no gelo por 10 minutos e em seguida centrifugar a 400 x g por 5 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante como descrito anteriormente (passo 4.3) e lavar as pelotas de célula uma vez com 150 µ l de tampão de FACS. Cuidado: Paraformaldehyde é tóxico; Use proteção adequada como luvas e óculos, etc. Nota: Resuspenda as pelotas de célula em 150 µ l de tampão de FACS e armazenar protegido da luz, a 4° C por até dois dias. Se nenhum coloracao intracelular é necessária, então vá para a etapa 4.11 após centrifugação a placa a 400 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Para coloracao intracelular, resuspenda as pelotas de célula em 150 µ l de detergente buffer+0.5% de FACS e incubar a temperatura ambiente, protegida da luz por 15 min. centrifugar a placa a 400 x g por 5 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante como descrito anteriormente (passo 4.3) e lavar o centrifugado uma vez com 150 µ l de tampão de FACS + 0,5% de detergente. Ressuspender as células em 20 µ l de detergente de FACS buffer+0.5% que contém os anticorpos de interesse (CD68-APC, CD206-PE) e incube, protegido da luz, em temperatura ambiente por 30 min.</li>
	<li>Adicione 130 µ l de detergente de FACS buffer+0.5% a cada poço e centrifugar a placa a 400 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante, como descrito anteriormente (passo 4.3) e lavar as pelotas de célula duas vezes com 150 µ l de tampão de FACS + 0,5% de detergente. Nota: Se usar um anticorpo primário unconjugated ou um anticorpo primário conjugado com biotina, então um reagente secundário apropriado, conjugado com um fluoróforo, pode ser adicionado neste ponto e medidas 4.9-4.10 repetido.</li>
	<li>Resuspenda as pelotas de célula em 150 µ l de tampão de FACS + 0,5% de detergente e loja, protegido da luz, a 4 ° C por até dois dias.</li>
	<li>Resuspenda as pelotas de célula com 150 buffer de FACS µ l + 0,5% de detergente suplementado com 5 µ g/mL DAPI e incubar durante 5 min à temperatura ambiente, protegida da luz. Centrifugue a placa a 400 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante conforme descrito anteriormente (passo 4.3).</li>
	<li>Resuspenda as pelotas de célula em 150 µ l de PBS e transferir para um tubo de FACs devidamente rotulado. Armazenar em temperatura ambiente, protegida da luz, até que esteja pronto para análise. Nota: Após ressuspensão em PBS, as células devem ser analisadas dentro de horas, desde que a DAPI lentamente irá dissociar-se do DNA, levando a uma perda de sinal.</li>
</ol>5. instalação de citometria de fluxo e execução de amostras
<ol><li>Certifique-se que o citômetro de fluxo é equipado com os apropriado lasers e/ou filtro define para medir o fluorophores usado para manchar as células. Isso pode ser determinado sob a configuração de citômetro de padrão no sistema. No caso do presente protocolo, as células foram analisadas usando um citômetro de fluxo, equipado com três lasers (405 nm, 488 nm e 633 nm) permitindo a detecção de ≤ 5 fluorophores.</li>
	<li>Selecione os canais apropriados para a deteção do fluorophores de interesse. Todos os sinais fluorescentes são melhor detectados com amplificação logarítmica.</li>
	<li>Selecione uma taxa de fluxo adequado para as amostras. Este parâmetro pode variar dependendo do sistema utilizado e deve ser determinado empiricamente. No caso do presente protocolo, utilizou-se um caudal de MED-para-HI (35-60 µ l/min) para evitar o entupimento da agulha.</li>
	<li>Selecione o número total de eventos/células a serem coletados por amostra. O número mínimo de eventos deve ser 1.000.000.</li>
	<li>Criar gráficos de dispersão sob uma planilha global do SSC-A contra o FSC-A, bem como para cada fluoróforo de interesse versus FCS-A. Crie uma vista estatístico que exibirá o número de eventos e a média intensidade fluorescente (IFM) para o fluorophores selecionado.</li>
	<li>Defina a tensão dos canais FSC-A e SSC-A, tal que as células menores se encaixam o inferior esquerdo 10% do gráfico de dispersão. Determine a fluorescência de fundo e fluorescência da amostra mínima de controles imaculados de nervos ciático ou DRGs. Determine o portão do pai (P1) baseado o scatter plotagem de DAPI somente controles de coloração. Nota: Este não é um portal de coleção, devido em parte, para a heterogeneidade da população DAPI + o PNS.</li>
	<li>Usar o scatter FSC parcelas para cada um dos fluorophores turísticos, ajustar as tensões para que as células do controle unstained cair dentro do trimestre inferior de sua respectiva dispersão. Portões são então criados acima desta região para definir as células que são positivas para cada uma os respectivos marcadores/fluorophores. A colocação de um portão é confirmada pela execução do controle single-manchado (passo 4.1). Nota: Compensação a sobreposição de espectros de emissão pode ser realizada neste momento ou aplicada retrospectivamente com o software de análise adequada.</li>
	<li>Uma vez que o citômetro de fluxo tem sido configurado, conforme descrito, as amostras podem ser executadas.</li>
	<li>Após a execução, o material restante da amostra pode ser descartado e os arquivos de FCS podem ser exportados para uma análise mais aprofundada.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores têm sem conflitos de interesses no que se refere este estudo.

Os nervos ciático contêm uma grande proporção de lipídios, como colesterol, devido ao teor de mielina em torno dos axônios. Desde que as propriedades de lipídios mudam com a temperatura, diferentes resultados podem ser obtidos em temperaturas diferentes. Para garantir a preservação de células, todas as etapas neste protocolo após a digestão foram realizadas no gelo. Enquanto a consistência é recomendada por razões de reprodutibilidade dos resultados, pode ser possível aumentar o rendimento executando as etapas 3.6 e 3.7 ...

Células do sistema imunológico que entra o PNS da circulação, conforme definido pela expressão de CD45 e CD11b, ajudam a manter a integridade do nervo e desempenhar um papel tanto na regeneração e degeneração1. Macrófagos (definidos pela sua expressão de CD68 no mouse) podem ser desviados para um fenótipo inflamatório, expressando mais MHC classe II e CD86 em sua superfície (M1), ou para um fenótipo de anti-inflamatórios, expressando mais CD206 intracelular (M2)2 . Inclinação do fenótipo macrófago é um processo dinâmico, regulado através de Akt sinalização3, refletindo as diferentes tarefas de macrófagos na defesa contra patógenos (M1) e o papel na regeneração de tecidos (M2). Regeneração de um nervo lesionado requer primeiro fagocitose dos restos de mielina por macrófagos no nervo4,5e anti-inflamatório (CD68+CD206+) M2 macrófagos têm sido mostrados para promover a consequência natural do axônio na PNS6. Reduzido de recrutamento ou macrófagos para o PNS, ou capacidade prejudicada para a fagocitose pode resultar em regeneração prejudicada e manutenção da integridade do nervo. Inflamatórios macrófagos M1, expressar o MHC-classe II, são menos capazes de fagocitose de macrófagos M2, e inflamação neuronal está implicada na patogênese de doenças neurodegenerativas várias7.
As mudanças que ocorrem para o sistema imunológico residente de nervo em consequência de danos podem ser quantitativas, manifestando-se na perda de CD45+ leucócitos (ou aumento da infiltração de CD45+ leucócitos no caso inflamação), ou qualitativa, tais como mudança do fenótipo de macrófagos de M2 para M1 fenótipo. As células do sistema imunológico do PNS tradicionalmente foram analisadas por meio da se, usando seções congeladas ou parafina material8. Se é necessário para determinar a localização das células de interesse. No entanto, quantificação usando se muitas vezes baseia-se em contagem de um número relativamente pequeno de células em uma seção estreita do tecido, tornando a quantificação confiável e vulnerável a viés de seleção. Para identificação dos subconjuntos específicos de células do sistema imunológico, a detecção simultânea de marcadores extracelulares ou intracelulares é necessária, enquanto a determinação do fenótipo macrófago requer pelo menos pelo menos dois marcadores, especificamente CD206 e MHC classe II. Como mais comumente microscópios disponíveis limitam-se a canais de pelo menos duas cores, tais como o isotiocianato de fluoresceína (FITC) e ficoeritrina (PE), a caracterização dos subconjuntos específicos de células do sistema imunológico por IF pode ser restritiva e incompleta, exigindo a necessidade de ter vários slides, derivado da mesma área de interesse, que são coradas e analisadas em paralelo. Este aspecto demorado, portanto, não é necessário se presta à análise de amostra grande moda. Além disso, como a maioria dos marcadores de interesse são extracelulares, a deteção em tecido, que também tem sido incorporado em parafina ou cryoconserved, pode ser problemática devido o rompimento da integridade da membrana e o mascaramento de resumos, bem como a perda de os antígenos do interesse da utilização de solventes, tais como acetona e metanol9.
Em contraste, fluxo cytometry, que mede óptico e características de fluorescência das células únicas em suspensão como passam através de um feixe de luz, fornece um meio mais prático e abrangente para a análise das populações de células. Citometria de fluxo, ao invés de produzir uma imagem digital do tecido, fornece uma quantificação automatizada de parâmetros definidos, que incluem de uma célula tamanho relativo e índice reflexivo, referido como o scatter para frente (FSC), complexidade granularidade/interna ou lado-scatter (SSC) e a intensidade de fluorescência relativo, proporcionando que a célula tem sido rotulada com um fluoróforo adequado, tais como um anticorpo conjugado. Um citômetro de fluxo típico consiste de dois, lasers refrigerado a ar; um laser de argônio produz luz azul em 488 nm e um laser de hélio-neon produz luz em 633 nm. Esta combinação permite a detecção e medição, simultaneamente, pelo menos cinco alvos na superfície ou no interior do compartimento intracelular. Citômetros mais avançados podem consistir de vários lasers, que permitem a detecção de até oito diferentes fluorochromes ao mesmo tempo, proporcionando que o pico de emissão comprimentos de onda de fluorochromes os selecionado não se sobrepõem significativamente.
Para a análise por citometria de fluxo, o tecido de interesse deve primeiro ser enzimaticamente digerido, geralmente com colagenase, para gerar uma suspensão de célula única. Anteriormente, a análise de murino nervos ciático tem sido difícil devido à pequena quantidade de tecido obtido de cada rato. Além disso, o alto teor de gordura da mielina em torno dos axônios dificulta a recuperação da célula e produz grandes quantidades de detritos. O método aqui descrito para a preparação de nervo ciático e digestão foi adaptado a partir do protocolo de isolamento de célula de Schwann de Barrette et al 7e tem como objetivo isolar células suficientes de nervos de ratos individuais para análise de citometria de fluxo, a fim de reduzir a variação entre ratos. Usar o DAPI para a identificação de células únicas na digest cru tecido contorna a necessidade de remover os resíduos do axônio, que geralmente leva a perda de células. Lavar várias vezes com um aids reserva rica em detergente na liberação de células preso dentro os detritos gordurosos, aumentando assim o rendimento. Digestão de ambos os nervos ciático completos de um único rato de acordo com este protocolo gera ≥ 30, 000 eventos nucleados único e pelo menos 3 vezes esse número foi obtido o DRG. A proporção de CD45+ leucócitos foi de aproximadamente 5% do conteúdo da célula total em digerir o nervo ciático e aproximadamente 5-10% na digest DRG. A maioria da CD45+ células no nervo ciático expressaram os marcadores do macrófago, CD68 e CD206.

<table><tbody><tr><td>C57BL / 6 Mouse</td><td>Charles River</td><td>C57BL / 6NCrl</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (+1g / L de glicose, glutamina, piruvato)</td> <td>Thermo</td><td>31885023</td><td>A fonte deste material não é importante</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase tipo 4</td><td>Worthington Biochemical Corp., EUA</td><td></td><td></td>LS004188</tr><tr><td>Desoxirribonuclease (DNase) I do pâncreas bovino I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25-1g</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal de bezerro (FCS), anticorpo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td>inativado pelo calor</tr><tr><td>contra CD11b-PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>101228</td><td>Clone M1/70</td></tr><tr><td>Anticorpo contra MHC classe II, biotinilado</td><td>Biolegend</td><td>107603</td><td>Clone M5/114.15.2</td></tr><tr><td>Anticorpo contra CD45-A647</td><td>Biolegend</td><td>107603</td><td>Clone 30-F11</td></tr><tr><td>Anticorpo contra CD68-APC</td><td>Biolegend</td><td>137007</td><td>Clone FA/11</td></tr><tr><td>Anticorpo contra CD206-PE</td><td>Biolegend</td><td>141706</td><td>Clone C068C2</td></tr><tr><td>Anticorpo contra F4/80-PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>123113</td><td>Clone BM8</td></tr><tr><td>Streptavidin-PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>405206</td><td>Usado para detectar MHCII-biotina com CD45-A647 e CDllb-PerCP/Cy5.5</td></tr><tr><td>Streptavidin-PerCP</td><td>Biolegend</td><td>405213</td><td>Usado para detectar MHCII-biotina com CD68-APC e F4/80-PE/Cy7</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-1MG</td><td>Dilua em PBS a 50x e armazene a 4 graus; C no escuro</td></tr><tr><td>Peneira de dissociação celular - kit de triturador de tecidos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CD1</td><td></td></tr> em <tr><td>forma de V, placas de 96 poços</td><td>Greiner/Sigma</td><td>M8185</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 ml, 12x75mm</td><td>BD Biosciences</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>placa de Petri de 60x15mm</td><td>Greiner/Sigma</td><td>Z643084</td><td></td></tr><tr><td>BD LSR II Citômetro de Fluxo</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

análise de células do sistema imunológico em único nervos ciático e gânglio da raiz dorsal de um único rato usando citometria de fluxo

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

Nervo-residente células imunes no sistema nervoso periférico (SNP) são essenciais para a manutenção da integridade neuronal em um nervo saudável. As células do sistema imunológico do PNS são afetadas pela lesão e a doença, que afeta a função nervosa e a capacidade de regeneração. Células do sistema imunológico neuronais comumente são analisadas por imunofluorescência (IF). Enquanto se é essencial para determinar a localização das células imunes no nervo, se só é semi quantitativa e o método é limitado ao número de marcadores que podem ser analisados simultaneamente e o grau de expressão de superfície. Neste estudo, citometria de fluxo foi usada para análise quantitativa de infiltração de leucócitos em nervos ciático ou gânglios da raiz dorsal (DRGs) de ratos individuais. Única célula análise foi realizada utilizando DAPI e várias proteínas foram analisadas simultaneamente para a expressão de superfície ou intracelular. Ambos os nervos ciático de um rato que foram tratados de acordo com este protocolo gerado eventos nucleada único de ≥ 30.000. A proporção de leucócitos no nervo ciático, determinado pela expressão de CD45, foi aproximadamente 5% do teor total de célula no nervo ciático e aproximadamente 5-10% em DRG. Embora este protocolo enfoca principalmente a população de células imunes dentro o PNS, a flexibilidade de citometria de fluxo para medir uma série de marcadores simultaneamente significa que as outras populações de células presentes dentro do nervo, como células de Schwann, pericitos , fibroblastos e células endoteliais, podem também ser analisadas usando esse método. Esse método, portanto, fornece um meio novo para estudar os efeitos sistêmicos sobre o PNS, tais como biblioteca e modelos genéticos de neuropatia ou doenças crônicas, como diabetes.

Suspensões celulares de ambos completos nervos ciático e todos os principais DRG foram elaboradas, de acordo com o protocolo, de seis saudável C57BL/6 ratos e divididas em três alíquotas iguais para a coloração. Contador de coloração com DAPI, que manchas de DNA, permite a detecção de uma população única célula (figura 1A–B, painel superior). Lavando o DAPI, antes da análise por citometria de fluxo, diminuiu de forma a intens...

Análise quantitativa do conteúdo da célula dentro do nervo ciático murino é difícil devido à escassez do tecido. Este protocolo descreve um método para a digestão do tecido e preparação que fornece células suficientes para análise de citometria de fluxo de populações de células imunes dos nervos de ratos individuais.

Análise de células do sistema imunológico em único nervos ciático e gânglio da raiz Dorsal de um único rato usando citometria de fluxo

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

O objetivo geral deste procedimento é obter células suficientes dos gânglios da raiz dorsal e dos nervos ciáticos de um camundongo individual para poder realizar a análise de citometria de fluxo das células. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque o material neuronal periférico gera grandes quantidades de detritos quando digerido. A principal vantagem desse método é que vários marcadores podem ser usados simultaneamente para identificar vários tipos de células.As implicações dessa técnica se estendem ao diagnóstico de inflamação e imunopatologia durante a neuropatia. Embora esse método possa fornecer informações sobre modelos murinos, ele também pode ser aplicado a outros organismos, como nervos humanos e de porcos, com pequenas modificações. Geralmente, os indivíduos novos no método terão dificuldades devido às grandes quantidades de detritos gerados pelas digestões.A demonstração visual deste método é crítica, pois as etapas de dissecção e dissociação celular são difíceis de realizar porque o material neuronal por camundongo é limitante. Tivemos a ideia para esse método pela primeira vez quando vimos um protocolo isolando o cisne Para começar, prepare o mouse conforme descrito no protocolo de texto que acompanha e posicione-o com o lado ventral voltado para baixo enquanto estica os membros inferiores.Em seguida, use um par de pinças para dissecar bilateralmente todos os nervos ciáticos. Comece separando o tecido muscular da parte superior dorsal da coxa e siga o nervo ao longo da coluna vertebral. Corte o nervo onde ele sai da coluna vertebral e imediatamente acima do joelho na outra extremidade.Em seguida, transfira os nervos excisados para um tubo de 1,5 mililitro contendo 1 mililitro de PBS gelado. Armazene os nervos no gelo. Em seguida, isole o gânglio da raiz dorsal.Comece cortando as costelas paralelas e próximas à coluna vertebral em ambos os lados. Em seguida, corte transversalmente a coluna vertebral ao nível dos fêmures na parte posterior e próximo ao crânio na parte anterior. Remova a coluna vertebral e use uma tesoura de íris para cortar todos os músculos, gorduras e outros tecidos moles da coluna.Em seguida, coloque a coluna vertebral com o lado ventral voltado para cima e abra-a começando com a extremidade caudal, deslizando uma ponta da tesoura no canal vertebral na posição de 12 horas e cortando o osso. Prosseguindo até que toda a lombada seja cortada, repita este procedimento na posição das seis horas até que a lombada seja cortada pela metade. Separe as duas metades da coluna vertebral e coloque a amostra sob um microscópio de dissecação.Remova a medula espinhal para expor os nervos espinhais e, em seguida, localize e remova os gânglios da raiz dorsal lombar puxando suavemente a raiz dorsal para puxá-la para os canais vertebrais. Em seguida, use uma tesoura de íris para cortar os nervos e o tecido conjuntivo ao redor do gânglio da raiz dorsal. Usando uma pinça, transfira os gânglios da raiz dorsal para um tubo de 1,5 mililitro e armazene-os no gelo.Localizar os gânglios da raiz dorsal, extraí-los sem danificá-los e libertá-los do nervo espinhal requer exercício e habilidade. Prepare um meio de digestão, complemente-o com cem microgramas por mililitro de desoxirribonuclease e armazene-o no gelo. Em seguida, adicione 500 microlitros de meio de digestão em cada um dos tubos com os nervos ciáticos e os gânglios da raiz dorsal.Para os nervos ciáticos, pique o material de 15 a 20 vezes usando uma tesoura de mola e, em seguida, incube as suspensões de tecido em uma incubadora agitada a 37 graus Celsius por 20 minutos com agitação suave. Após a incubação, triturar repetidamente a suspensão de células através de uma ponta de pipeta de 1.000 microlitros para dissociar mecanicamente qualquer tecido incompletamente digerido. Repita a trituração através de uma ponta de pipeta de 1.000 microlitros.Em seguida, incube a amostra por mais 10 minutos a 37 graus Celsius com agitação suave. Prepare o tampão FACS gelado e use-o para enxaguar e embeber uma tela de aço inoxidável com malha de 140 mícrons em uma placa de Petri de 60 milímetros no gelo. Em seguida, use uma pinça romba para segurar o filtro de tela de 140 mícrons sobre a placa de Petri e passe repetidamente as suspensões de tecido pelo filtro.Recolha a suspensão celular da placa de Petri e transfira-a para o mesmo tubo de 1,5 mililitro armazenado no gelo. Empurre qualquer tecido incompletamente digerido que permaneça no filtro por trituração repetida com uma ponta de pipeta de 1.000 microlitros. Em seguida, enxágue o filtro de tela duas vezes com 500 microlitros de tampão FACS e combine-o com a suspensão celular no tubo de 1,5 mililitro.Se grande parte da amostra for digerida de forma incompleta e passada pela malha de metal, pode ocorrer perda de células e a análise por citometria de fluxo pode ser impossível. Centrifugar as suspensões celulares e rejeitar o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda o pellet celular em um mililitro de tampão FACS.Repita esta etapa de lavagem uma vez, ressuspendendo o pellet celular final em 150 a 350 microlitros de tampão FACS. As células agora estão prontas para coloração. No computador, selecione os canais apropriados para detecção dos fluoróforos de interesse, a taxa de fluxo apropriada das amostras e o número total de eventos a serem coletados por amostra.O número mínimo de eventos deve ser de um milhão. Em seguida, crie gráficos de dispersão em uma planilha global do espalhamento lateral A versus o Forward Scatter A, bem como para cada fluoróforo de interesse versus o Forward Scatter A. Além disso, crie uma visualização estatística que exibirá o número de eventos e a intensidade fluorescente média para os fluoróforos selecionados. Determine a porta pai, P1, com base no gráfico de dispersão dos controles de coloração somente DAPI.Anexe a amostra à citometria de fluxo e clique em adquirir. Observe o gráfico DAPI versus FSC e reduza a voltagem do canal azul pacífico do DNA até que a população DAPI+ se torne visível. Usando a ferramenta de passagem de retângulo, desenhe uma caixa ao redor da população DAPI+.Isso representa a porta P1. Selecione os gráficos de dispersão para cada um dos fluoróforos e exiba apenas os eventos DAPI+. Isso representa a fluorescência de fundo para cada um dos fluoróforos.Usando também o retângulo de gating, desenhe uma caixa nos gráficos de dispersão para cada um dos fluoróforos, começando em 103 no eixo y. Esta porta representa a região em que os eventos positivos para cada um dos marcadores declarados devem ser encontrados. Ajuste as tensões para cada um dos fluoróforos usando os controles de coloração somente DAPI.Anexe a amostra à citometria de fluxo e clique em adquirir. Observe a posição da população DAPI+ para cada um dos fluoróforos e ajuste as respectivas tensões de modo que as populações fiquem fora da porta retangular. Uma vez que o citômetro de fluxo tenha sido configurado, execute as amostras e exporte o Forward Scatter files para análise posterior.A lavagem da coloração DAPI antes da análise por citometria de fluxo diminuiu a intensidade fluorescente dos detritos não nucleados. Isso permitiu que o material na extremidade superior do eixo Forward Scatter, que contém tecido incompletamente digerido, fosse excluído na seleção da população singlete. No geral, mais de 30.000 singlets podem ser obtidos regularmente de dois nervos ciáticos completos e mais de 200.000 singlets podem ser obtidos dos gânglios da raiz dorsal.Dos nervos ciáticos, aproximadamente 5% dos singlets expressaram CD45 em sua superfície, enquanto aproximadamente 5% a 10% expressaram nos gânglios da raiz dorsal, definindo essas células como leucócitos de origem hematopoiética. A maioria dos singlets CD45 positivos também expressou MHC classe II de maneira gradual. Nos gânglios da raiz dorsal, o CD11b pode ser usado para detectar células semelhantes à microglia; Esta população de microglia está ausente dos nervos ciáticos.No nervo ciático e no gânglio da raiz dorsal, 2% a 5% dos singlets expressaram CD68. Nos nervos ciáticos, aproximadamente 60%80% dos macrófagos CD68 positivos expressaram CD206. Enquanto uma proporção menor do CD68 positivo co-expressou CD206 no gânglio da raiz dorsal.Ao realizar este procedimento, é importante manter uma temperatura consistente para garantir um resultado consistente. Após seu desenvolvimento, essa técnica permitiu que pesquisadores no campo do diabetes explorassem os efeitos tóxicos da estreptozotocina usada para induzir diabetes em camundongos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a citometria de fluxo no tecido neuronal periférico.Não se esqueça de que trabalhar com paraformaldeído pode ser perigoso e precauções devem sempre ser tomadas, como usar luvas e óculos de segurança.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

O presente artigo descreve um protocolo rápido de forma eficiente isolamento de células mononucleares a partir de tecidos do cérebro e da medula espinhal que pode ser efetivamente utilizado para análises de citometria de fluxo.

Isolamento do Cérebro e da Medula Espinhal Células Mononucleares Usando Percoll Gradients

O vídeo demonstra a preparação de uma suspensão unicelular de células imunes a partir de um tecido cerebral murino. Envolve digestão enzimática para liberar células do tecido cerebral, seguida de centrifugação com gradiente de densidade para isolar as células imunes com base em suas densidades para obter a suspensão unicelular.

Preparando uma suspensão unicelular de células imunes a partir de tecido cerebral murino

Fonte: Hidmark, A. S., et al. Análise de Células Imunes em Nervos Ciáticos Únicos e Gânglio da Raiz Dorsal de um Único Camundongo Usando Citometria de Fluxo. J. Vis. Exp.{{TAG_ 27}} (2017).  Este vídeo demonstra o uso da citometria de fluxo para analisar células imunes em nervos ciáticos de camundongos e gânglios da raiz dorsal (DRGs). O processo envolve a marcação de células imunes com anticorpos marcados com fluoróforo e biotina, estabilizando e permeabilizando as células e usando marcadores...

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Aqui, descrevemos um protocolo detalhado e reprodutível de citometria de fluxo para identificar subconjuntos de monócito/macrófago e células T usando ensaios de coloração extra e intracelular dentro do baço de murina, medula óssea, linfonodos e tecido sinovial, utilizando um modelo cirúrgico estabelecido de osteoartrite de murina.

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Este manuscrito apresenta um protocolo para induzir encefalomielite autoimune experimental ativa (EAE) em camundongos. Um método de isolamento e caracterização dos linfócitos infiltrados no sistema nervoso central (SNC) também é apresentado para mostrar como os linfócitos estão envolvidos no desenvolvimento da doença autoimune cns.

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Para investigar a resposta imune a distúrbios cerebrais, uma abordagem comum é analisar as mudanças nas células imunológicas. Aqui, dois protocolos simples e eficazes são fornecidos para isolar células imunes do tecido cerebral murino e da medula óssea do crânio.

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Identificar micróglia (MG) e macrófagos infiltrantes periféricos (Mø) na medula espinhal lesada é difícil. Neste protocolo, a citometria de fluxo (FCM) foi usada para identificar MG semelhante a M1, MG semelhante a M2, Mø semelhante a M1 e Mø semelhante a M2, respectivamente. Essa tecnologia também pode ser aplicada a outras doenças do sistema nervoso central para entender o papel da MG e da Mø.

Identificação de micróglia e macrófagos infiltrantes periféricos na medula espinhal lesada usando citometria de fluxo

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Citometria de fluxo e análise de célula única para caracterizar a ativação da micróglia no desenvolvimento cerebral de camundongos pós-natais precoces

Aprenda a analisar células imunes em nervos ciáticos e gânglios da raiz dorsal de ratos usando citometria de fluxo. Este método permite identificar múltiplos tipos celulares simultaneamente para estudar inflamação e imunopatologia em neuropatias.

Análise de células do sistema imunológico em único nervos ciático e gânglio da raiz Dorsal de um único rato usando citometria de fluxo (Vídeo) | JoVE Journal

Análise de células do sistema imunológico em único nervos ciático e gânglio da raiz Dorsal de um único rato usando citometria de fluxo

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