Análise de células do sistema imunológico em único nervos ciático e gânglio da raiz Dorsal de um único rato usando citometria de fluxo

O objetivo geral deste procedimento é obter células suficientes dos gânglios da raiz dorsal e dos nervos ciáticos de um camundongo individual para poder realizar a análise de citometria de fluxo das células. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque o material neuronal periférico gera grandes quantidades de detritos quando digerido. A principal vantagem desse método é que vários marcadores podem ser usados simultaneamente para identificar vários tipos de células.

As implicações dessa técnica se estendem ao diagnóstico de inflamação e imunopatologia durante a neuropatia. Embora esse método possa fornecer informações sobre modelos murinos, ele também pode ser aplicado a outros organismos, como nervos humanos e de porcos, com pequenas modificações. Geralmente, os indivíduos novos no método terão dificuldades devido às grandes quantidades de detritos gerados pelas digestões.

A demonstração visual deste método é crítica, pois as etapas de dissecção e dissociação celular são difíceis de realizar porque o material neuronal por camundongo é limitante. Tivemos a ideia para esse método pela primeira vez quando vimos um protocolo isolando o cisne Para começar, prepare o mouse conforme descrito no protocolo de texto que acompanha e posicione-o com o lado ventral voltado para baixo enquanto estica os membros inferiores.

Em seguida, use um par de pinças para dissecar bilateralmente todos os nervos ciáticos. Comece separando o tecido muscular da parte superior dorsal da coxa e siga o nervo ao longo da coluna vertebral. Corte o nervo onde ele sai da coluna vertebral e imediatamente acima do joelho na outra extremidade.

Em seguida, transfira os nervos excisados para um tubo de 1,5 mililitro contendo 1 mililitro de PBS gelado. Armazene os nervos no gelo. Em seguida, isole o gânglio da raiz dorsal.

Comece cortando as costelas paralelas e próximas à coluna vertebral em ambos os lados. Em seguida, corte transversalmente a coluna vertebral ao nível dos fêmures na parte posterior e próximo ao crânio na parte anterior. Remova a coluna vertebral e use uma tesoura de íris para cortar todos os músculos, gorduras e outros tecidos moles da coluna.

Em seguida, coloque a coluna vertebral com o lado ventral voltado para cima e abra-a começando com a extremidade caudal, deslizando uma ponta da tesoura no canal vertebral na posição de 12 horas e cortando o osso. Prosseguindo até que toda a lombada seja cortada, repita este procedimento na posição das seis horas até que a lombada seja cortada pela metade. Separe as duas metades da coluna vertebral e coloque a amostra sob um microscópio de dissecação.

Remova a medula espinhal para expor os nervos espinhais e, em seguida, localize e remova os gânglios da raiz dorsal lombar puxando suavemente a raiz dorsal para puxá-la para os canais vertebrais. Em seguida, use uma tesoura de íris para cortar os nervos e o tecido conjuntivo ao redor do gânglio da raiz dorsal. Usando uma pinça, transfira os gânglios da raiz dorsal para um tubo de 1,5 mililitro e armazene-os no gelo.

Localizar os gânglios da raiz dorsal, extraí-los sem danificá-los e libertá-los do nervo espinhal requer exercício e habilidade. Prepare um meio de digestão, complemente-o com cem microgramas por mililitro de desoxirribonuclease e armazene-o no gelo. Em seguida, adicione 500 microlitros de meio de digestão em cada um dos tubos com os nervos ciáticos e os gânglios da raiz dorsal.

Para os nervos ciáticos, pique o material de 15 a 20 vezes usando uma tesoura de mola e, em seguida, incube as suspensões de tecido em uma incubadora agitada a 37 graus Celsius por 20 minutos com agitação suave. Após a incubação, triturar repetidamente a suspensão de células através de uma ponta de pipeta de 1.000 microlitros para dissociar mecanicamente qualquer tecido incompletamente digerido. Repita a trituração através de uma ponta de pipeta de 1.000 microlitros.

Em seguida, incube a amostra por mais 10 minutos a 37 graus Celsius com agitação suave. Prepare o tampão FACS gelado e use-o para enxaguar e embeber uma tela de aço inoxidável com malha de 140 mícrons em uma placa de Petri de 60 milímetros no gelo. Em seguida, use uma pinça romba para segurar o filtro de tela de 140 mícrons sobre a placa de Petri e passe repetidamente as suspensões de tecido pelo filtro.

Recolha a suspensão celular da placa de Petri e transfira-a para o mesmo tubo de 1,5 mililitro armazenado no gelo. Empurre qualquer tecido incompletamente digerido que permaneça no filtro por trituração repetida com uma ponta de pipeta de 1.000 microlitros. Em seguida, enxágue o filtro de tela duas vezes com 500 microlitros de tampão FACS e combine-o com a suspensão celular no tubo de 1,5 mililitro.

Se grande parte da amostra for digerida de forma incompleta e passada pela malha de metal, pode ocorrer perda de células e a análise por citometria de fluxo pode ser impossível. Centrifugar as suspensões celulares e rejeitar o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda o pellet celular em um mililitro de tampão FACS.

Repita esta etapa de lavagem uma vez, ressuspendendo o pellet celular final em 150 a 350 microlitros de tampão FACS. As células agora estão prontas para coloração. No computador, selecione os canais apropriados para detecção dos fluoróforos de interesse, a taxa de fluxo apropriada das amostras e o número total de eventos a serem coletados por amostra.

O número mínimo de eventos deve ser de um milhão. Em seguida, crie gráficos de dispersão em uma planilha global do espalhamento lateral A versus o Forward Scatter A, bem como para cada fluoróforo de interesse versus o Forward Scatter A. Além disso, crie uma visualização estatística que exibirá o número de eventos e a intensidade fluorescente média para os fluoróforos selecionados. Determine a porta pai, P1, com base no gráfico de dispersão dos controles de coloração somente DAPI.

Anexe a amostra à citometria de fluxo e clique em adquirir. Observe o gráfico DAPI versus FSC e reduza a voltagem do canal azul pacífico do DNA até que a população DAPI+ se torne visível. Usando a ferramenta de passagem de retângulo, desenhe uma caixa ao redor da população DAPI+.

Isso representa a porta P1. Selecione os gráficos de dispersão para cada um dos fluoróforos e exiba apenas os eventos DAPI+. Isso representa a fluorescência de fundo para cada um dos fluoróforos.

Usando também o retângulo de gating, desenhe uma caixa nos gráficos de dispersão para cada um dos fluoróforos, começando em 103 no eixo y. Esta porta representa a região em que os eventos positivos para cada um dos marcadores declarados devem ser encontrados. Ajuste as tensões para cada um dos fluoróforos usando os controles de coloração somente DAPI.

Anexe a amostra à citometria de fluxo e clique em adquirir. Observe a posição da população DAPI+ para cada um dos fluoróforos e ajuste as respectivas tensões de modo que as populações fiquem fora da porta retangular. Uma vez que o citômetro de fluxo tenha sido configurado, execute as amostras e exporte o Forward Scatter files para análise posterior.

A lavagem da coloração DAPI antes da análise por citometria de fluxo diminuiu a intensidade fluorescente dos detritos não nucleados. Isso permitiu que o material na extremidade superior do eixo Forward Scatter, que contém tecido incompletamente digerido, fosse excluído na seleção da população singlete. No geral, mais de 30.000 singlets podem ser obtidos regularmente de dois nervos ciáticos completos e mais de 200.000 singlets podem ser obtidos dos gânglios da raiz dorsal.

Dos nervos ciáticos, aproximadamente 5% dos singlets expressaram CD45 em sua superfície, enquanto aproximadamente 5% a 10% expressaram nos gânglios da raiz dorsal, definindo essas células como leucócitos de origem hematopoiética. A maioria dos singlets CD45 positivos também expressou MHC classe II de maneira gradual. Nos gânglios da raiz dorsal, o CD11b pode ser usado para detectar células semelhantes à microglia; Esta população de microglia está ausente dos nervos ciáticos.

No nervo ciático e no gânglio da raiz dorsal, 2% a 5% dos singlets expressaram CD68. Nos nervos ciáticos, aproximadamente 60%80% dos macrófagos CD68 positivos expressaram CD206. Enquanto uma proporção menor do CD68 positivo co-expressou CD206 no gânglio da raiz dorsal.

Ao realizar este procedimento, é importante manter uma temperatura consistente para garantir um resultado consistente. Após seu desenvolvimento, essa técnica permitiu que pesquisadores no campo do diabetes explorassem os efeitos tóxicos da estreptozotocina usada para induzir diabetes em camundongos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a citometria de fluxo no tecido neuronal periférico

Não se esqueça de que trabalhar com paraformaldeído pode ser perigoso e precauções devem sempre ser tomadas, como usar luvas e óculos de segurança.