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Advanced Biology

Detecção de espécies reativas de oxigênio

Detecting Reactive Oxygen Species

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Cell Biology

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JoVE Science Education Cell Biology

Detecting Reactive Oxygen Species

4.11: The ATP Bioluminescence Assay

4.13: An Introduction to Cell Death

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09:08 min

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April 30, 2023

Overview

Espécies reativas de oxigênio são moléculas quimicamente ativas, derivadas de oxigênio, capazes de oxidar outras moléculas. Devido à sua natureza reativa, há muitos efeitos deletérios associados à produção de ROS não controlada, incluindo danos estruturais ao DNA e outras moléculas biológicas. No entanto, ros também pode ser mediadores de sinalização fisiológica. Há evidências acumuladas de que a ROS desempenha papéis significativos em tudo, desde a ativação de fatores de transcrição até a mediação da toxicidade inflamatória que mata patógenos estranhos e defende o corpo.

Neste vídeo vamos mergulhar nas associações entre ROS, metabolismo e doenças. Após estabelecer sua significância, discutiremos os princípios e um protocolo de uma metodologia comumente utilizada para medir os níveis de ROS nas células: o uso de sondas não fluorescentes que se tornam fluorescentes após a oxidação. Por fim, vamos rever algumas aplicações atuais dessa técnica na pesquisa de biologia celular.

Procedure

Espécies reativas de oxigênio produzidas nas células foram implicadas em homeostase tecidual, envelhecimento celular e estados de doenças como o câncer. Como o nome deles indica, essas moléculas surgem do oxigênio, que naturalmente existe como uma molécula estável de dioxígeno, já que todos os seus elétrons são emparelhados. A adição de um elétron não remassado torna-o instável, e leva à formação do ânion de superóxido — uma forma de espécie de oxigênio reativo ou ROS. Além do ânion de superóxido, existem vários tipos de espécies reativas com elétrons não relacionados, cujos níveis a célula pretende controlar firmemente.

Neste vídeo, vamos aprender como espécies de oxigênio reativo estão relacionadas ao metabolismo celular e doenças, explorar os princípios por trás de um ensaio para sua detecção usando uma sonda fluorescente, e vamos passar por cima de um protocolo generalizado para este ensaio. Por último, investigaremos como os cientistas estão implementando este método em experimentos hoje.

Primeiro, vamos discutir como espécies reativas de oxigênio são produzidas, e considerar sua influência no metabolismo celular e doenças.

Uma fonte significativa de espécies de oxigênio reativa celular são as mitocôndrias. Normalmente, durante o metabolismo celular, os elétrons são transportados através de uma cadeia de complexos proteicos, culminando na redução do oxigênio molecular para a água e na geração simultânea de ATP. Apesar da extraordinária regulação desse processo, os elétrons vazam, resultando na formação de ânion de superóxido.

A presença de ânion de superóxido rapidamente dá origem a outras formas de espécies reativas de oxigênio, como peróxido de hidrogênio e radical hidráxil. Esses radicais, que possuem um elétron não reactivetivo não resseco, podem danificar oxidativamente membranas, DNA e proteínas. Para neutralizar, a célula mantém seu próprio estoque antioxidante de enzimas como o superóxido dismutase, ou moléculas como a vitamina C, que reduzem os radicais livres. Qualquer desequilíbrio neste sistema de defesa pode resultar em um ciclo de feedback positivo potencialmente fatal, resultando em uma condição de espécies de oxigênio reativas excessivas conhecidas como estresse oxidativo.

Espécies reativas de oxigênio foram implicadas na iniciação e progressão do câncer. Outro efeito nocivo dessas moléculas é a indução do envelhecimento celular, também conhecida como senescência. A “Teoria Radical Livre do Envelhecimento” propõe que espécies reativas de oxigênio produzidas nas células durante o metabolismo normal evocam senescência celular e morte.

Até agora, discutimos os aspectos negativos dessas moléculas altamente reativas, mas elas também têm papéis positivos na fisiologia celular. Durante as respostas imunológicas quando os fagocitos engolfam patógenos, as células montam uma “explosão respiratória” durante a qual quantidades excessivas de espécies reativas de oxigênio são geradas para degradar oxidativamente patógenos. Além disso, são intermediários necessários e reguladores de uma variedade de vias de sinalização celular, e podem até mesmo sinalizar a morte de células que se tornaram cancerosas.

Para quantificar esses oxidantes celulares influentes, os cientistas exploram moléculas que, após a oxidação, tornam-se fluorescentes. Uma sonda comumente usada para detectar a espécie de oxigênio reativo é H₂DCFDA ou dihidro-fluorescete, um análogo não fluorescente de fluoresceína. Quando adicionada às células, sua natureza permeante celular permite que ela se difunda passivamente.

Em seguida, esterases intracelulares catalisam uma reação de hidrólise, o que resulta em fissura de grupos de acetato. Isso torna o composto mais polar, de modo que ele é retido dentro da célula. Após a oxidação, que envolve a remoção de átomos de hidrogênio por uma ampla gama de espécies de oxigênio reativa, o H2DCFDA não fluorescente é convertido para o altamente fluorescente dicloro-fluoresceína, ou DCF. Isso pode ser lido e quantificado por um leitor de placas, citômetro de fluxo ou microscopia de fluorescência.

Agora que você sabe como este ensaio funciona, vamos ver como ele é realizado em um ambiente de laboratório.

Comece transferindo células cultivadas em soro fisiológico tamponado de cultura para fosfato, seguido de centrifugação para lavá-las. Remova o supernasce e adicione a solução H₂DCFDA da sonda fluorescente. Incubar as células carregadas de corante no escuro para evitar fotobleaching. Após a incubação, lave as células para remover o corante descarregado e transfira as células para uma placa. Neste ponto, podem ser adicionados indutores experimentais de estresse oxidativo.

Quando prontas para análise, as células podem ser inseridas no leitor de placas. Os comprimentos de onda de excitação e emissão são definidos para fluoresceína. Após a leitura das placas, os valores podem ser analisados. Os resultados revelam a quantidade relativa de espécies reativas de oxigênio entre amostras em determinados pontos de tempo.

Agora que examinamos o protocolo real, vamos ver como ele está sendo aplicado em experimentos hoje.

Os pesquisadores frequentemente usam esse método para investigar a mecânica da fagocitose. Este grupo de cientistas queria estudar a capacidade do zebrafish de montar uma resposta imune em diferentes estágios de desenvolvimento. Como mencionado anteriormente, a fagocitose resulta na geração de espécies de oxigênio reativas elevadas, ou “uma explosão respiratória”, que é usada para matar patógenos. Uma vez que a enzima NADPH oxidase é um importante produtor de ROS em células fagocíticas, esses cientistas induziram a resposta explosiva tratando zebrafish com um indutor DE NADPH. Os resultados demonstraram que entre os embriões de zebrafish cuja resposta “estourada” havia sido provocada, aqueles em 72 horas após a fertilização mostraram maior desenvolvimento de espécies reativas de oxigênio do que aqueles em 48 horas após a fertilização.

A disfunção mitocondrial devido ao aumento da espécie de oxigênio reativo é uma característica patológica de muitas doenças. Portanto, os pesquisadores podem identificar disfunção mitocondrial medindo o nível de estresse oxidativo. Aqui, os cientistas carregaram H2DCFDA em neurônios, e então montaram as amostras em um microscópio de fluorescência. Na adição de um estressor oxidativo, como o peróxido de hidrogênio, os corpos celulares apresentaram um aumento repentino na fluorescência, o que poderia ser uma indicação de disfunção mitocondrial.

Os astrócitos foram sugeridos para proteger os neurônios do sistema nervoso central do estresse oxidativo. Por causa dessa significância, esses pesquisadores buscaram desenvolver um ensaio para detectar estresse oxidativo em astrócitos na presença de um indutor externo. Eles fizeram isso incubando astrócitos com peróxido de hidrogênio e a sonda fluorescente para detecção reativa de espécies de oxigênio. A fluorescência subsequente gerada foi analisada utilizando-se um citômetro de fluxo. Os astrócitos ativados para o estresse oxidativo foram observados para cair dentro de uma região de maior intensidade de fluorescência, visto deslocado para a direita.

Você acabou de assistir ao vídeo do JoVE sobre a detecção de espécies reativas de oxigênio ou ROS. Resumindo, neste vídeo discutimos a ligação entre espécies reativas de oxigênio, metabolismo celular e doenças. Examinamos então o princípio e o procedimento de um ensaio para detecção reativa de espécies de oxigênio. Finalmente, exploramos como os pesquisadores estão aplicando esse método às suas investigações. A análise dos papéis ainda enigmáticos das espécies reativas de oxigênio é de grande interesse para os biólogos celulares, e a medição confiável com sondas fluorescentes está se mostrando inestimável. Como sempre, obrigado por assistir!

Transcript

Reactive oxygen species produced in cells have been implicated in tissue homeostasis, cellular aging, and disease states like cancer. As their name implies, these molecules arise from oxygen, which naturally exists as a stable, dioxygen molecule since all its electrons are paired. The addition of one unpaired electron renders it unstable, and leads to formation of the superoxide anion—a form of reactive oxygen species or ROS. Other than the superoxide anion, there are several types of reactive species with unpaired electrons, whose levels the cell aims to tightly control.

In this video, we’ll learn how reactive oxygen species are related to cell metabolism and disease, explore the principles behind an assay for its detection using a fluorescent probe, and we’ll go over a generalized protocol for this assay. Lastly, we’ll investigate how scientists are implementing this method in experiments today.

First, let’s discuss how reactive oxygen species are produced, and consider their influence in cell metabolism and disease.

A significant source of cellular reactive oxygen species is the mitochondria. Normally, during cell metabolism electrons are transported through a chain of protein complexes, culminating in the reduction of molecular oxygen to water and simultaneous generation of ATP. Despite the extraordinary regulation of this process, electrons do leak out, resulting in the formation of superoxide anion.

The presence of superoxide anion quickly gives rise to other forms of reactive oxygen species, such as hydrogen peroxide and hydroxyl radical. These radicals, which all possess a highly reactive unpaired electron, can oxidatively damage membranes, DNA, and proteins. To counteract, the cell maintains its own antioxidant stockpile of enzymes like superoxide dismutase, or molecules like vitamin C, that reduce free radicals. Any imbalance in this defense system can result in a potentially fatal positive feedback loop, resulting in a condition of excessive reactive oxygen species known as oxidative stress.

Reactive oxygen species have been implicated in initiation and progression of cancer. Another harmful effect of these molecules is the induction of cellular aging, also known as senescence. The “Free Radical Theory of Aging” proposes that reactive oxygen species produced in cells during normal metabolism evoke cellular senescence and death.

Until now, we discussed the negative aspects of these highly reactive molecules, but they have positive roles in cellular physiology as well. During immune responses when phagocytes engulf pathogens, cells mount a “respiratory burst” during which excessive amounts of reactive oxygen species are generated to oxidatively degrade pathogens. In addition, they are necessary intermediates and regulators of a variety of cell signaling pathways, and can even signal the death of cells that have turned cancerous.

To quantify these influential cellular oxidants, scientists exploit molecules that upon oxidation turn fluorescent. A commonly used probe to detect the reactive oxygen species is H2DCFDA or dichloro-dihydro-fluorescein diacetate, a non-fluorescent analogue of fluorescein. When added to cells, its cell permeant nature allows it to passively diffuse in.

Then, intracellular esterases catalyze a hydrolysis reaction, which results in cleaving of acetate groups. This makes the compound more polar, so that it is retained within the cell. Upon oxidation, which involves removal of hydrogen atoms by a wide range of reactive oxygen species, the non-fluorescent H2DCFDA is converted to the highly fluorescent dichloro-fluorescein, or DCF. This can be read and quantified by a plate reader, flow cytometer, or fluorescence microscopy.

Now that you know how this assay works, let’s see how it’s performed in a laboratory setting.

Start by transferring cells grown in culture medium to phosphate buffered saline, followed by centrifugation to wash them. Remove supernatant, and add the fluorescent probe H2DCFDA solution. Incubate the dye-loaded cells in the dark to prevent photobleaching. After incubation, wash the cells to remove unloaded dye and transfer cells to a plate. At this point, experimental oxidative stress inducers can be added.

When ready for analysis, cells can be inserted into the plate reader. The excitation and emission wavelengths are set for fluorescein. After plates are read, values can be analyzed. Results reveal the relative amount of reactive oxygen species between samples at particular time points.

Now that we’ve examined the actual protocol, let’s look how it’s being applied in experiments today.

Researchers often use this method to investigate the mechanics of phagocytosis. This group of scientists wanted to study the ability of zebrafish to mount an immune response at different stages of development. As mentioned earlier, phagocytosis results in the generation of high reactive oxygen species, or “a respiratory burst,” that is used to kill pathogens. Since the enzyme NADPH oxidase is a significant ROS producer in phagocytic cells, these scientists induced the burst response by treating zebrafish with a NADPH inducer. The results demonstrated that amongst zebrafish embryos whose “burst” response had been provoked, those at 72 hours post-fertilization showed higher reactive oxygen species development than those at 48 hours post-fertilization.

Mitochondrial dysfunction due to increased reactive oxygen species is a pathological feature of many diseases. Therefore, researchers can identify mitochondrial dysfunction by measuring the level of oxidative stress. Here, scientists loaded H2DCFDA onto neurons, and then mounted the samples onto a fluorescence microscope. On addition of an oxidative stressor, like hydrogen peroxide, cell bodies displayed a sudden increase in fluorescence, which could be an indication of mitochondrial dysfunction.

Astrocytes have been suggested to protect central nervous system neurons from oxidative stress. Because of this significance, these researchers aimed to develop an assay to detect oxidative stress in astrocytes in the presence of an external inducer. They did this by incubating astrocytes with hydrogen peroxide and the fluorescent probe for reactive oxygen species detection. Subsequent fluorescence generated was analyzed using a flow cytometer. Astrocytes activated for oxidative stress were observed to fall within a region of increased fluorescence intensity, seen shifted to the right.

You’ve just watched JoVE’s video on detecting reactive oxygen species or ROS. To sum up, in this video we discussed the link between reactive oxygen species, cell metabolism, and disease. We then examined the principle and procedure of an assay for reactive oxygen species detection. Finally, we explored how researchers are applying this method to their investigations. The analysis of the still enigmatic roles of reactive oxygen species is of great interest to cell biologists, and reliable measurement with fluorescent probes is proving to be invaluable. As always, thanks for watching!

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