4.12: Detecção de espécies reativas de oxigênio

As espécies reativas de oxigênio produzidas nas células têm sido implicadas na homeostase dos tecidos, no envelhecimento celular e em estados de doenças como o câncer. Como o próprio nome indica, essas moléculas surgem do oxigênio, que existe naturalmente como uma molécula estável de dioxigênio, uma vez que todos os seus elétrons estão emparelhados. A adição de um elétron desemparelhado o torna instável e leva à formação do ânion superóxido - uma forma de espécie reativa de oxigênio ou ROS. Além do ânion superóxido, existem vários tipos de espécies reativas com elétrons desemparelhados, cujos níveis a célula visa controlar rigidamente.

Neste vídeo, aprenderemos como as espécies reativas de oxigênio estão relacionadas ao metabolismo celular e à doença, exploraremos os princípios por trás de um ensaio para sua detecção usando uma sonda fluorescente e examinaremos um protocolo generalizado para este ensaio. Por fim, investigaremos como os cientistas estão implementando esse método em experimentos hoje.

Primeiro, vamos discutir como as espécies reativas de oxigênio são produzidas e considerar sua influência no metabolismo celular e na doença.

Uma fonte significativa de espécies reativas celulares de oxigênio são as mitocôndrias. Normalmente, durante o metabolismo celular, os elétrons são transportados através de uma cadeia de complexos proteicos, culminando na redução do oxigênio molecular à água e na geração simultânea de ATP. Apesar da extraordinária regulação desse processo, os elétrons vazam, resultando na formação de ânion superóxido.

A presença de ânion superóxido rapidamente dá origem a outras formas de espécies reativas de oxigênio, como peróxido de hidrogênio e radical hidroxila. Esses radicais, que possuem um elétron desemparelhado altamente reativo, podem danificar oxidativamente membranas, DNA e proteínas. Para neutralizar, a célula mantém seu próprio estoque antioxidante de enzimas como a superóxido dismutase, ou moléculas como a vitamina C, que reduzem os radicais livres. Qualquer desequilíbrio neste sistema de defesa pode resultar em um ciclo de feedback positivo potencialmente fatal, resultando em uma condição de espécies reativas excessivas de oxigênio conhecidas como estresse oxidativo.

Espécies reativas de oxigênio têm sido implicadas na iniciação e progressão do câncer. Outro efeito nocivo dessas moléculas é a indução do envelhecimento celular, também conhecido como senescência. O? Teoria do Envelhecimento dos Radicais Livres? propõe que as espécies reativas de oxigênio produzidas nas células durante o metabolismo normal evocam senescência e morte celular.

Até agora, discutimos os aspectos negativos dessas moléculas altamente reativas, mas elas também têm papéis positivos na fisiologia celular. Durante as respostas imunes, quando os fagócitos engolfam os patógenos, as células montam uma "explosão respiratória" durante o qual quantidades excessivas de espécies reativas de oxigênio são geradas para degradar oxidativamente os patógenos. Além disso, eles são intermediários e reguladores necessários de uma variedade de vias de sinalização celular e podem até sinalizar a morte de células que se tornaram cancerosas.

Para quantificar esses oxidantes celulares influentes, os cientistas exploram moléculas que, após a oxidação, se tornam fluorescentes. Uma sonda comumente usada para detectar as espécies reativas de oxigênio é o diacetato de H2DCFDA ou dicloro-dihidrofluoresceína, um análogo não fluorescente da fluoresceína. Quando adicionado às células, sua natureza permeável celular permite que ele se difunda passivamente.

Em seguida, as esterases intracelulares catalisam uma reação de hidrólise, que resulta na clivagem de grupos acetato. Isso torna o composto mais polar, de modo que é retido dentro da célula. Após a oxidação, que envolve a remoção de átomos de hidrogênio por uma ampla gama de espécies reativas de oxigênio, o H2DCFDA não fluorescente é convertido em diclorofluoresceína altamente fluorescente, ou DCF. Isso pode ser lido e quantificado por um leitor de placas, citômetro de fluxo ou microscopia de fluorescência.

Agora que você sabe como esse ensaio funciona, vamos ver como ele é realizado em um ambiente de laboratório.

Comece transferindo células cultivadas em meio de cultura para solução salina tamponada com fosfato, seguida de centrifugação para lavá-las. Remova o sobrenadante e adicione a sonda fluorescente H2DCFDA solução. Incube as células carregadas de corante no escuro para evitar o fotobranqueamento. Após a incubação, lave as células para remover o corante descarregado e transfira as células para uma placa. Neste ponto, indutores experimentais de estresse oxidativo podem ser adicionados.

Quando estiverem prontas para análise, as células podem ser inseridas no leitor de placas. Os comprimentos de onda de excitação e emissão são definidos para fluoresceína. Depois que as placas são lidas, os valores podem ser analisados. Os resultados revelam a quantidade relativa de espécies reativas de oxigênio entre as amostras em determinados pontos de tempo.

Agora que examinamos o protocolo real, vamos ver como ele está sendo aplicado em experimentos hoje.

Os pesquisadores costumam usar esse método para investigar a mecânica da fagocitose. Este grupo de cientistas queria estudar a capacidade do peixe-zebra de montar uma resposta imune em diferentes estágios de desenvolvimento. Como mencionado anteriormente, a fagocitose resulta na geração de espécies de oxigênio de alta reatividade, ou "uma explosão respiratória", que é usado para matar patógenos. Como a enzima NADPH oxidase é um produtor significativo de ROS em células fagocíticas, esses cientistas induziram a resposta de explosão tratando o peixe-zebra com um indutor de NADPH. Os resultados demonstraram que entre os embriões de peixe-zebra cuja ?explosão? resposta foi provocada, aqueles com 72 horas após a fertilização mostraram maior desenvolvimento de espécies reativas de oxigênio do que aqueles com 48 horas após a fertilização.

A disfunção mitocondrial devido ao aumento das espécies reativas de oxigênio é uma característica patológica de muitas doenças. Portanto, os pesquisadores podem identificar a disfunção mitocondrial medindo o nível de estresse oxidativo. Aqui, os cientistas carregaram H2DCFDA nos neurônios e, em seguida, montaram as amostras em um microscópio de fluorescência. Com a adição de um estressor oxidativo, como o peróxido de hidrogênio, os corpos celulares exibiram um aumento repentino na fluorescência, o que pode ser uma indicação de disfunção mitocondrial.

Os astrócitos têm sido sugeridos para proteger os neurônios do sistema nervoso central do estresse oxidativo. Devido a essa importância, esses pesquisadores pretendiam desenvolver um ensaio para detectar o estresse oxidativo em astrócitos na presença de um indutor externo. Eles fizeram isso incubando astrócitos com peróxido de hidrogênio e a sonda fluorescente para detecção de espécies reativas de oxigênio. A fluorescência subsequente gerada foi analisada usando um citômetro de fluxo. Observou-se que os astrócitos ativados por estresse oxidativo caem dentro de uma região de maior intensidade de fluorescência, vista deslocada para a direita.

Você acabou de assistir ao vídeo de JoVE sobre a detecção de espécies reativas de oxigênio ou ROS. Para resumir, neste vídeo discutimos a ligação entre espécies reativas de oxigênio, metabolismo celular e doenças. Em seguida, examinamos o princípio e o procedimento de um ensaio para detecção de espécies reativas de oxigênio. Finalmente, exploramos como os pesquisadores estão aplicando esse método às suas investigações. A análise dos papéis ainda enigmáticos das espécies reativas de oxigênio é de grande interesse para os biólogos celulares, e a medição confiável com sondas fluorescentes está provando ser inestimável. Como sempre, obrigado por assistir!