Name: Uso de zinco sináptica histoquímica para revelar as diferentes regiões e lâminas no cérebro em desenvolvimento e adulto (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Aprenda a técnica de histoquímica de zinco sináptico para distinguir regiões e camadas corticais em cérebros de furões em desenvolvimento e adultos. Este método simples e confiável permite visualizar padrões de marcação específicos em neurociência.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi financiado por doações do centro nacional para recursos de pesquisa (2G12RR03060-26A1); O Instituto Nacional sobre saúde de minoria e disparidades de saúde (8G12MD007603-27) dos institutos nacionais de saúde; Profissional pessoal Congresso-City University de Nova York (CUNY-PSC); e faculdade Research Grant (FRG II) Universidade Americana de Sharjah. Agradecemos Vidyasagar Sriramoju por nos apresentar para esses métodos.

<ol><li>Nakashima, A., Dyck, R. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19026685">Zinc and cortical plasticity.</a> Brain Res. Rev. 59, 347-373 (2009).</li>
<li>Frederickson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurobiology+of+zinc+and+zinc-containing+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neurobiology of zinc and zinc-containing neurons.</a> Int Rev Neurobiol. 31, 145-238 (1989).</li>
<li>Beaulieu, C., Dyck, R., Cynader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+glutamate+in+zinc-containing+terminals+of+the+cat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroReport%22%5BJournal%5D)">Enrichment of glutamate in zinc-containing terminals of the cat visual cortex.</a> NeuroReport. 3 (10), 861-864 (1992).</li>
<li>Martinez-Guijarro, F. J., Soriano, E., Del Rio, J. A., Lopez-Garcia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc-positive+boutons+in+the+cerebral+cortex+of+lizards+show+glutamate+immunoreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Zinc-positive boutons in the cerebral cortex of lizards show glutamate immunoreactivity.</a> J Neurocytol. 20 (10), 834-843 (1991).</li>
<li>Dyck, R., Beaulieu, C., Cynader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+localization+of+synaptic+zinc+in+the+developing+cat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Histochemical localization of synaptic zinc in the developing cat visual cortex.</a> J Comp Neurol. 329 (1), 53-67 (1993).</li>
<li>Garrett, B., Geneser, F. A., Slomianka, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+acetylcholinesterase+and+zinc+in+the+visual+cortex+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Embryol.+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Distribution of acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the mouse.</a> Anat Embryol. (Berl). 184 (5), 461-468 (1991).</li>
<li>Garrett, B., Osterballe, R., Slomianka, L., Geneser, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoarchitecture+and+staining+for+acetylcholinesterase+and+zinc+in+the+visual+cortex+of+the+Parma+wallaby+%28Macropus+parma%29%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Evol%22%5BJournal%5D)">Cytoarchitecture and staining for acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the Parma wallaby (Macropus parma).</a> Brain Behav Evol. 43 (3), 162-172 (1994).</li>
<li>Dyck, R., Cynader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+interdigitated+columnar+mosaic+of+cytochrome+oxidase%2C+zinc%2C+and+neurotransmitter-related+molecules+in+cat+and+monkey+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">An interdigitated columnar mosaic of cytochrome oxidase, zinc, and neurotransmitter-related molecules in cat and monkey visual cortex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. (90), 9066-9069 (1993).</li>
<li>Land, P. W., Akhtar, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+alteration+of+synaptic+zinc+in+rat+somatosensory+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Somatosens+Mot+Res%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent alteration of synaptic zinc in rat somatosensory barrel cortex.</a> Somatosens Mot Res. 16 (2), 139-150 (1999).</li>
<li>Danscher, G. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00543951">Exogenous selenium in the brain: a histochemical technique for light and electron microscopic localization of catalytic selenium bonds.</a> Histochemistry. 76, 281-293 (1982).</li>
<li>Danscher, G., Howell, G., Perez-Clausell, J., Hertel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dithizone%2C+Timm%27s+sulphide+silver+and+the+selenium+methods+demonstrate+a+chelatable+pool+of+zinc+in+CNS%3A+a+proton+activation+%28PIXE%29+analysis+of+carbon+tetrachloride+extracts+from+rat+brains+and+spinal+cords+intravitall+treated+with+dithizone%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">The dithizone, Timm's sulphide silver and the selenium methods demonstrate a chelatable pool of zinc in CNS: a proton activation (PIXE) analysis of carbon tetrachloride extracts from rat brains and spinal cords intravitall treated with dithizone.</a> Histochemistry. 83, 419-422 (1985).</li>
<li>Gallyas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+staining+of+myelin+by+means+of+physical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol+Res%22%5BJournal%5D)">Silver staining of myelin by means of physical development.</a> Neurol Res. 1 (2), 203-209 (1979).</li>
<li>Wong-Riley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+visual+system+of+monocularly+sutured+or+enucleated+cats+demonstrable+with+cytochrome+oxidase+histochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry.</a> Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).</li>
<li>Miró-Bernié, N., Ichinohe, N., Perez-Clausell, J., Rockland, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc-rich+transient+vertical+modules+in+the+rat+retrosplenial+cortex+during+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Zinc-rich transient vertical modules in the rat retrosplenial cortex during postnatal development.</a> J Neurosci. 138 (2), 523-535 (2006).</li>
<li>Ichinohe, N., Rockland, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+synaptic+zinc+in+the+macaque+monkey+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Distribution of synaptic zinc in the macaque monkey amygdala.</a> J Comp Neurol. 489 (2), 135-147 (2005).</li>
<li>Innocenti, G. M., Manger, P. R., Masiello, I., Colin, I., Tettoni, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+and+callosal+connections+of+visual+areas+17%2C+18%2C+19+and+21+in+the+ferret+%28Mustela+putorius%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Architecture and callosal connections of visual areas 17, 18, 19 and 21 in the ferret (Mustela putorius).</a> Cereb Cortex. 12 (4), 411-422 (2002).</li>
<li>Khalil, R., Levitt, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+histochemistry+reveals+circuit+refinement+and+distinguishes+visual+areas+in+the+developing+ferret+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Zinc histochemistry reveals circuit refinement and distinguishes visual areas in the developing ferret cerebral cortex.</a> Brain Struct Funct. 218, 1293-1306 (2013).</li>
<li>Manger, P. R., Masiello, I., Innocenti, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Areal+organization+of+the+posterior+parietal+cortex+of+the+ferret+%28Mustela+putorius%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Areal organization of the posterior parietal cortex of the ferret (Mustela putorius).</a> Cereb Cortex. 12, 1280-1297 (2002).</li>
<li>Wong, P., Kaas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architectonic+subdivisions+of+neocortex+in+the+gray+squirrel+%28Sciurus+carolinensis.%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+anatomical+record%22%5BJournal%5D)">Architectonic subdivisions of neocortex in the gray squirrel (Sciurus carolinensis.).</a> The anatomical record. 291, 1301-1333 (2008).</li>
<li>Land, P. W., Shamalla-Hannah, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+plasticity+of+zinc-containing+cortical+circuits+during+a+critical+period+of+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent plasticity of zinc-containing cortical circuits during a critical period of postnatal development.</a> J Comp Neurol. 447 (1), 43-56 (2002).</li>
<li>Czupryn, A., Skangiel-Kramska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+synaptic+zinc+in+the+developing+mouse+somatosensory+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Distribution of synaptic zinc in the developing mouse somatosensory barrel cortex.</a> J Comp Neurol. 386, 652-660 (1997).</li>
<li>Timm, F. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00665092">Zur Histochemie der Schwermetalle. Das Sulfid-Silber-Verfahren.</a> Dtsch Z ges gerichtl Med. 46, 706-711 (1958).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O estudo atual emprega uma técnica histochemical baseada em uma versão modificada do Danscher método (1982)10, pelo qual localização de zinco sináptica pode ser detectada e visualizada no cérebro. Esse método funciona, essencialmente, injetando o animal com o Selenito de sódio quelante de zinco (ND2SeO3) (15 mg/kg). Após a injeção, o selenite viaja para o cérebro e vincula a zinco grátis que está localizado a vesículas pré-sináptica de zinco que contém neurônios. Íons de zinc...

Histológicas manchas tem sido tradicionalmente usadas para auxiliar na identificação de áreas corticais em várias espécies, revelando diferenças de características arquitetônicas. O uso combinado de técnicas histoquímicas como substância de Nissl, reatividade de citocromo oxidase (CO) ou mielina pode provar frutuoso, como revelam os limites areal semelhantes no cérebro adulto. No entanto, estas manchas histochemical não revelam sempre adequadamente limites claros entre áreas corticais e camadas no cérebro imaturo.
No sistema nervoso central, o zinco tem várias funções essenciais que incluem a estabilização da estrutura do DNA, agindo como um cofator de enzimas, participando em inúmeras funções reguladoras e agindo como um neuromodelador através da sua presença em vesículas sinápticas 1. zinco sináptico é único, como isso pode ser visualizado usando métodos histológicos, Considerando que o zinco ligados a proteína não pode ser visualizado2. Esta característica foi explorada para revelar o padrão de zinco sináptica em diferentes regiões corticais e histoquímica sináptica de zinco tem sido utilizada em um número de estudos. Um subconjunto de glutamatérgico neurônios no córtex cerebral contêm zinco nas vesículas pré-sináptica dentro seu axônio terminais3,4. Estudos histoquímicos revelaram uma distribuição heterogênea de zinco sináptica no córtex cerebral5,6,7. Parece haver uma distribuição diferente de areal e laminar de zinco histochemically reativa em diferentes regiões corticais (por exemplo, visual versus córtex somatossensorial), ou camadas (por exemplo, os níveis de zinco no supragranular e infragranular camadas do córtex visual primário são substancialmente superiores à camada de entrada de thalamocortical IV com níveis relativamente baixos de zinco sináptica)5,8,9. A heterogeneidade de zinco sináptico coloração observada no córtex é especialmente vantajosa como ele facilita a identificação de areal e laminar.
Aqui apresentamos uma descrição detalhada de um procedimento histochemical zinco sináptica, que é uma versão modificada do 1982 método10 do Danscher. Este método utiliza Selenito injectado intraperitonealmente (IP) em animais como um agente quelante. O selenite viaja para o cérebro para reagir com piscinas de zinco grátis encontradas em vesículas de um subconjunto de glutamatérgico sinapses no cérebro. Esta reação produz um precipitado que pode ser reforçado posteriormente pelo desenvolvimento prata2,10,11.
Esse procedimento revela padrões laminares e areal de zinco sináptico coloração; densitométricos análise pode ser utilizada para avaliar esses padrões, tanto qualitativa como quantitativamente no cérebro adulto e imaturo para estudar os efeitos de outras intervenções, tais como manipulações sensoriais, ambientais, farmacológicas ou genéticas. Além disso, um pode também querer avaliar possíveis alterações do desenvolvimento na distribuição de zinco sináptica em outras estruturas corticais ou subcorticais em outros sistemas de modelo. As informações quantitativas que análise densitométricos fornece neste método podem ser vantajosas para o desenvolvimento do cérebro seguir ao longo do tempo. Este protocolo fornece um companheiro para outros imuno - histoquímicos marcadores e para revelar os limites laminares e areal.

<table><tbody><tr><td>Euthasol (solução de eutanásia)</td><td>Henry Schein</td><td>710101</td><td></td></tr><tr><td>Selenito de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214485</td><td></td></tr><tr><td>Cetamina (Ketaved)</td><td>Henry Schein</td><td>48858</td><td>100 mg/ml injetáveis</td></tr><tr><td>Xilazina (Anased)</td><td>Henry Schein</td><td>33198</td><td>100 mg/ml injetáveis</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Diluído a 4%</td></tr> <tr><td>Goma arábica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9752-500G</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W302600</td><td></td></tr><tr><td>Hidroquinona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9003</td><td></td></tr><tr><td>Lactato de prata</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85210</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina de peixe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>Citocromo c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2506</td> <td>(Tipo III, do coração equino)</td></tr> <tr><td>Catalse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C10</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Domino</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xileno Fisher</td><td>Scientific</td><td>X5P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>100% Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A406-20</td><td>Usado para desidratação antes da montagem da lâmina</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Brain Research Laboratories</td><td>#3660-1</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas não subalternadas foscas</td><td>Brain Research Laboratories</td><td>#3875-FR</td><td></td></tr><tr><td>Micrótomo</td><td>American Optical Company</td><td>860</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Olympus</td><td>BX-60</td><td></td></tr><tr><td>Adope Photoshop</td><td>Adobe Systems, San Jose, CA</td><td></td><td>Para montar imagens</td></tr>, <tr><td>o software gratuito ImageJ</td><td>pode ser baixado em http://rsb.info.nih.gov/ij/</td><td></td> <td>Para medições densométricas</td></tr><tr><td>Bandeja de plástico</td><td>Qualquer bandeja de plástico padrão pode ser usada</td><td></td><td>para imergir slides na solução do revelador</td></tr><tr><td>Placa quente</td><td>Qualquer placa de aquecimento padrão pode ser usada</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

uso de zinco sináptica histoquímica para revelar as diferentes regiões e lâminas no cérebro em desenvolvimento e adulto

Use of Synaptic Zinc Histochemistry to Reveal Different Regions and Laminae in the Developing and Adult Brain

Caracterização da organização anatômica e funcional do cérebro e desenvolvimento requer a identificação precisa de circuitos neurais distintos e regiões no cérebro imaturo e adulto. Aqui descrevemos um procedimento coloração histoquímicos zinco que revela diferenças nos padrões de coloração entre diferentes camadas e regiões do cérebro. Outros têm utilizado este procedimento não só revelar a distribuição do zinco-contendo neurônios e circuitos no cérebro, mas também com sucesso delinear fronteiras areal e laminares no cérebro em desenvolvimento e adulto em diversas espécies. Aqui ilustramos este procedimento com imagens de desenvolver a coloração e cérebros adultos furão. Podemos revelar um padrão de zinco de coloração que serve como um marcador anatômico das áreas e camadas e pode ser usados confiantemente distinguir áreas corticais visuais no córtex visual adulto e em desenvolvimento. O objetivo principal do presente protocolo é apresentar um método histoquímico que permite a identificação exata das camadas e regiões no cérebro em desenvolvimento e adulto onde outros métodos não conseguem fazê-lo. Secundariamente, em conjunto com a análise de imagem densitométricos, este método permite avaliar a distribuição do zinco sináptica a revelar potenciais alterações ao longo do desenvolvimento. Este protocolo descreve detalhadamente os reagentes, ferramentas e etapas necessárias para manchar sucessivamente as seções do cérebro congelado. Embora este protocolo é descrito usando tecido cerebral de furão, facilmente pode ser adaptado para uso em roedores, gatos ou macacos, bem como em outras regiões do cérebro.

As principais etapas envolvidas neste protocolo para manchar as seções do cérebro para zinco sináptica são apresentadas em um fluxograma na Figura 1. O protocolo pode ser dividido em três fases: 1) perfusão e coleção de tecido, preparação 2) tecido de coloração e histoquímica de zinco 3). Resumidamente, durante a primeira fase do protocolo, o animal é anestesiado e injetados IP com a dose adequada de Selenito de sódio. Após um período de tempo suficiente (ide...

Descrevemos um procedimento histochemical que revela a característico zinco laminar e areal, coloração de padrões em regiões diferentes do cérebro. O padrão de coloração de zinco pode ser usado em conjunto com outros marcadores anatômicos confiantemente distinguir camadas e regiões no cérebro adulto e em desenvolvimento.

Uso de zinco sináptica histoquímica para revelar as diferentes regiões e lâminas no cérebro em desenvolvimento e adulto

Characterization of anatomical and functional brain organization and development requires accurate identification of distinct neural circuits and regions ...

O objetivo geral deste método é realizar coloração histoquímica em seções cerebrais congeladas de furões para ilustrar a utilização de padrões de coloração sináptica de zinco na distinção de diferentes regiões e camadas no cérebro em desenvolvimento e adulto. Este método pode ajudar a responder a questões-chave, como as diferenças qualitativas e quantitativas no padrão de coloração sináptica de zinco entre diferentes regiões e camadas do cérebro. A principal vantagem é que esta técnica é simples e confiável, permitindo identificar diferentes regiões e camadas no cérebro em desenvolvimento e adulto com base em padrões de coloração únicos.Embora esse método tenha sido utilizado para fornecer informações sobre a demarcação de áreas e camadas no córtex visual selvagem, ele também pode ser usado para diferenciar camadas em diferentes regiões do cérebro de roedores, gatos ou primatas. Para preparar 200 mililitros da solução do revelador, adicione 40 gramas de goma arábica lentamente a 120 mililitros de água quente e continue mexendo com uma haste de vidro para dissolver completamente. Em seguida, deixe esfriar por alguns minutos e, em seguida, filtre-o por seis a oito camadas de gaze em um funil.Em seguida, adicione 5,04 gramas de ácido cítrico e 4,7 gramas de citrato de sódio em 20 mililitros de água destilada e dissolva para fazer o tampão citrato. Em seguida, adicione 1,7 gramas de hidroquinona a 30 mililitros de água destilada aquecida. Adicione 0,22 gramas de lactato de prata a 30 mililitros de água para fazer uma solução de lactato de prata.Na ordem a seguir, misture as soluções de goma arábica, tampão citrato, hidroquinona e, finalmente, lactato de prata para preparar a solução do revelador e mantê-la no escuro. Para iniciar este procedimento, injete uma dose de 15 miligramas por quilograma de peso corporal de solução de selenito de sódio, um quelante de zinco, por via intraperitoneal no furão anestesiado. Em seguida, aguarde de 60 a 90 minutos para que a solução de selenito de sódio chegue ao cérebro.Em seguida, injete uma overdose de 100 miligramas por quilograma de fenobarbital por via intraperitoneal para sacrificar o animal e aguarde vários minutos para que o euthasol funcione. Realize a perfusão transcárdica no furão eutanasiado primeiro com solução salina normal por um minuto e depois com paraformaldeído a 4% por 20 minutos. Em seguida, use um fixador com sacarose para completar o procedimento de fixação total em uma hora.Use um bisturi para fazer uma incisão na linha média começando do nariz ao pescoço para expor o crânio. Remova delicadamente o cérebro e, em seguida, use uma lâmina de bisturi para separar os hemisférios. Em seguida, corte e separe a parte posterior do resto do cérebro e pós-fixe por duas a quatro horas.Deixe o cérebro afundar mantendo o tecido em solução de sacarose a 30% em tampão fosfato 0,1 molar. Depois que o cérebro afundar, use um micrótomo deslizante de congelamento para fazer seções semitangenciais de 40 micrômetros de espessura através do córtex visual. Use um pincel para coletar todas as seções do cérebro e coloque-as em uma caixa cheia de solução salina tamponada com fosfato.Em seguida, monte rapidamente uma ou duas séries de seções cerebrais em lâminas revestidas de clara de ovo. Mantenha as lâminas em temperatura ambiente durante a noite para secar. Após a secagem das lâminas, mergulhe-as em álcool absoluto por 15 minutos.Em seguida, espere uma hora para deixar as lâminas secarem completamente em temperatura ambiente. Mergulhe rapidamente as seções em solução de gelatina a 1% por 10 segundos e escorra com cuidado. Mantenha as seções em temperatura ambiente para secar durante a noite.Use uma bandeja de plástico para organizar os slides lado a lado. Em seguida, despeje sobre a solução de revelação e certifique-se de que as lâminas estejam completamente submersas nela. Lembre-se de verificar as seções a cada 30 minutos para o desenvolvimento da reação.Se as lâminas tiverem sido manchadas adequadamente, remova as seções montadas na lâmina da bandeja e mantenha as lâminas em um suporte de corrediças. Use um prato grande para manchar o vidro para lavar as lâminas dentro do rack de lâminas em água corrente morna por 10 minutos para lavar a camada de gelatina e o depósito externo de prata. Após secar as lâminas à temperatura ambiente, desidrate-as por cinco minutos em etanol 100% e limpe por cinco minutos em xileno.Por fim, coloque uma lamínula com a mídia de montagem no slide. Use um microscópio de campo claro para examinar as seções e tirar fotos das áreas de interesse. Selecione seções coradas de zinco de fotomicrografias de regiões de interesse para escolher aleatoriamente colunas corticais de aproximadamente 450 micrômetros de largura.Em cada região de interesse, escolha um número apropriado de colunas de amostra de várias seções cerebrais diferentes. Em seguida, transfira as imagens da coluna para um software de processamento de imagem. No software, use a ferramenta de seção retangular para abranger toda a coluna cortical.Em seguida, utilize a ferramenta inverter para inverter o contraste da imagem. Em seguida, use a ferramenta de perfil de plotagem para fazer um gráfico bidimensional das intensidades de pixel ao longo da linha para produzir perfis de densidade óptica a partir das imagens. Por fim, use as opções de perfil de plotagem para converter o gráfico de perfil de plotagem em um perfil vertical.Em seguida, clique no perfil do gráfico mais uma vez. Fotomicrografias de seções semi-tangenciais coradas com zinco do cérebro juvenil do furão mostram a caracterização de tecidos super-corados e sub-corados. O tecido super-manchado desenvolve uma cor marrom muito escura com variação laminar inadequada e substância branca densamente corada.Em contraste, os tecidos sub-manchados desenvolvem uma cor marrom-clara com substância branca minimamente corada. Fotomicrografias de cortes semitangenciais mostram coloração sináptica de zinco na citocromo oxidase em áreas corticais visuais de um furão adulto. A intensidade da coloração de zinco sináptico é alta nas camadas supragranular e infragranular das áreas 17 e 18, enquanto a camada quatro cora levemente.Por outro lado, a camada quatro, de área de 17 e 18, é fortemente corada quando corada para reatividade da citocromo oxidase. As fotomicrografias colunares mostram a distribuição laminar do zinco sináptico em todas as camadas corticais com seus valores de densidade óptica normalizados complementares. Para refletir as mudanças na coloração sináptica de zinco de acordo com a profundidade cortical, gráficos normalizados de valores de densidade óptica foram gerados em cada área cortical visual.A calha presente nos perfis das parcelas mostra baixa coloração sináptica de zinco na camada quatro das áreas 17 e 18. Este procedimento pode ajudar a explicar se há alguma alteração no desenvolvimento e intensidade de coloração em determinadas regiões do cérebro ao longo do tempo. Essa técnica provou ser útil para pesquisadores de neuroanatomia explorarem como manipulações sensoriais, ambientais, farmacológicas ou genéticas podem afetar a distribuição da coloração sináptica de zinco no cérebro adulto e imaturo em uma variedade de espécies.Obrigado por assistir. Boa sorte com seus experimentos.

use-synaptic-zinc-histochemistry-to-reveal-different-regions-laminae

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Um método para carregar subventricular zona (SVZ) de células com corantes de cálcio indicador de actividade de cálcio gravação é descrito. A SVZ pós-natal contém células hermeticamente embalados, incluindo as células progenitoras neurais e neuroblastos. Ao invés de usar o carregamento banho foi injetado o corante por pressão dentro do tecido, permitindo uma melhor difusão de corante.

Preparação de fatias agudas zona subventricular for Imaging Cálcio

Fonte: McLeod, F., et al. Avaliação da densidade de sinapses em fatias de cérebro de roedores hipocampais. J. Vis. Exp. (2017). Este vídeo demonstra um método para visualizar marcadores sinápticos em fatias cerebrais do hipocampo usando análise de imunofluorescência confocal. As fatias são imunomarcadas com anticorpos primários direcionados a marcadores pré-sinápticos e pós-sinápticos, seguidos por anticorpos secundários conjugados com fluoróforo. Os marcadores marcados são então visualizados...

Análise microscópica de sinapses em fatias de hipocampo de camundongos usando imunofluorescência

Nós desenvolvemos uma preparação cordão intacto cérebro espinhal para gravar e monitorar a atividade elétrica através de patches gravação braçadeira dos neurônios e outras células Mauthner reticulospinais em embriões de peixe-zebra. Assim, somos capazes de gravar correntes sinápticas excitatórias e inibitórias, a atividade do canal voltagem-dependentes e potenciais de ação dos neurônios-chave em um embrião em desenvolvimento.

Grampo patch Gravações de Embryonic Cells Zebrafish Mauthner

Aqui nós descrevemos uma técnica para estudar a neurogênese pós-natal do hipocampo utilizando a técnica de cultura fatia organotípica. Este método permite a manipulação in vitro da neurogénese adulto e permite a aplicação directa de agentes farmacológicos para o hipocampo cultivadas.

Cultures Organotípicas fatia de Estudos de Pós-natal Neurogênese

Este protocolo apresenta um método para a recuperação morfológica dos neurónios durante patched registos electrofisiolicos utilizando biocitina de enchimento e de pós-processamento subsequente imuno-histoquímica. Mostramos que as seções encheu-biocitina grossas que estavam manchados e lamínulas pode ser restained com um segundo dia de anticorpos primários ou meses mais tarde.

Imunocoramento Secções biocitina-preenchidos e processados ​​para neuroquímicos Markers

Um protocolo para com precisão, identificando e analisando as sinapses em fatias hippocampal usando a imunofluorescência é descrito neste artigo.

Avaliação da densidade de sinapse em fatias Hippocampal cérebro de roedor

O protocolo descrito aqui descreve a análise de imunofluorescência, recuperação de biocytin e reconstruções de alta qualidade de hippocampal CA2 interneurônios seguindo o intracelulares gravações eletrofisiológicas in vitro, permitindo neuronal caracterização e anatomia neuronal, finalmente, bem a ser estudado.

Recuperação de Biocytin e reconstruções 3D de CA2 Hippocampal enchido interneurônios

A combinação de microscopia eletrônica de transmissão e transdução no útero é uma poderosa abordagem para o estudo de mudanças morfológicas na ultraestrutura fina do sistema nervoso durante o desenvolvimento. Este método combinado permite insights profundos sobre mudanças em detalhes estruturais subjacentes neuroplasticidade no que diz respeito a sua representação topográfica.

Avaliação dos parâmetros de neuroplasticidade ultraestrutural depois no Utero transdução da medula espinhal e cérebro de rato em desenvolvimento

Nós descrevemos procedimentos para processar o tecido recém-nascido do cérebro do rato para obter micrografias de elétron high-resolution para a Análise morfométrica da distribuição sináptica do vesícula em terminais do nervo. As micrografias obtidas com esses métodos também podem ser utilizadas para estudar a morfologia de uma série de outros componentes celulares e suas relações estruturais dimensionais.

Preparação do tecido cerebral de rato recém-nascido para Análise morfométrica ultraestrutural da distribuição de vesículas sinápticas em terminais nervosos

A dissecção crio-seção permite a preparação fresca e congelada do maior nicho neurogênico do cérebro murino para análise profunda de proteome quantitativo. O método é preciso, eficiente e causa perturbação mínima do tecido. Portanto, é ideal para estudar o microambiente molecular desse nicho, bem como outros órgãos, regiões e espécies.

Dissecção crio-seção da zona subependímal adulta para análise proteome quantitativa precisa e profunda

O protocolo apresentado descreve o uso de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) para quantificar as mudanças circadianas no córtex do barril de camundongos, focando principalmente no número de sinapses e na morfologia da coluna dendrítica.

Microscopia eletrônica de transmissão como técnica de visualização para análise da plasticidade sináptica circadiana no córtex de barril de camundongo

Aprenda a técnica de histoquímica de zinco sináptico para distinguir regiões e camadas corticais em cérebros de furões em desenvolvimento e adultos. Este método simples e confiável permite visualizar padrões de marcação específicos em neurociência.

Uso de zinco sináptica histoquímica para revelar as diferentes regiões e lâminas no cérebro em desenvolvimento e adulto

Explorar mais vídeos