In Vitro Enzima de medição para teste farmacológico acompanhante receptividade em Fabry e a doença de Pompe

Há uma demanda para fazer pré-clínicos de teste para uma novela classe de drogas "órfão" chamado acompanhantes farmacológicos podem ser reproduzidos, rápido e eficiente. Desenvolvemos um ensaio de baseado em cultura celular altamente padronizado, simples e versátil para tela para pacientes elegíveis, bem como drogas de romance acompanhante farmacológica.

O objetivo geral deste protocolo de cultura celular alterado é fornecer uma avaliação fenotípica rápida da variância alélica na doença de Fabry e Pompe. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo das doenças de armazenamento lisossômico, como resultados prognósticos e decisões terapêuticas. A principal vantagem dessa técnica é que ela é altamente reprodutível e pode auxiliar no desenvolvimento de novos medicamentos, como farmacochaperonas.

Para realizar a mutagênese dirigida ao local, comece usando as sequências de referência NM 00169.2 e NM 00152.4 como modelos para a mutagênese dos genes GLA e GAA, respectivamente. Use a ferramenta gratuita Primer Design para dar suporte ao design de primers. Em seguida, tenha um conjunto de primers de alta pureza e sem sal sintetizados por um fornecedor comercial, com primers sense e antisense carregando uma das respectivas modificações de sequência, centrais para seu comprimento, para introduzir individualmente a mutação.

Preparar a mistura de reacção num volume de 50 microlitros e executar o programa de PCR utilizando as condições normalizadas fornecidas pelo fabricante e indicadas no protocolo de texto. Após a PCR, adicione um microlitro de enzima de restrição Dpn1 e continue a incubar os frascos de reação a 37 graus Celsius por uma hora. Depois de transformar o DNA plasmático em células E.coli competentes e preparar plasmídeos da transformância desejada de acordo com o protocolo de texto, use uma ferramenta de biologia molecular adequada para analisar a sequência.

Quando a mutação desejada for detectada e nenhuma outra anormalidade de sequência em comparação com NM 000169.2 para alfa-galactosidase A ou NM 000152.4 para alfa-galactosidase ácida for observada, selecione o clone para purificação de plasmídeo de grau de transfecção. Determinar a pureza do ADN medindo a absorvância num espectrofotómetro. Após o cultivo de HEK293H células em frasco de cultura T75 de acordo com o protocolo de texto, 24 horas antes da transfecção, usar PBS sem cálcio ou magnésio para lavar as células uma vez.

Com 0,05% de tripsina-EDTA, colha as células e nas cavidades de uma placa de cultura de 24 poços use 500 microlitros de DMEM suplementado com 10% de FBS para semear 1,5 vezes 10 para as cinco células. Realize a transfecção celular de acordo com o manual do fabricante. Usando uma mistura de um micrograma de DNA plasmidial dissolvido em 100 microlitros de DMEM sem soro e 2,5 microlitros de reagente de transfecção.

Incube a solução por 20 minutos em temperatura ambiente e, em seguida, adicione-a às células gota a gota. Após um período de quatro horas a 37 graus Celsius e 5% de CO2, remova o meio que contém o reagente de transfecção e adicione 500 microlitros de DMEM fresco com 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina. Como opção durante esta etapa, adicione DGJ ou DNJ ao meio de cultura onde pretendido.

No dia da colheita, retire as células da incubadora. Em seguida, aspire o meio e use PBS com cálcio e magnésio para lavar cuidadosamente as células duas vezes. Esta etapa é crítica porque DGJ e DNJ são inibidores de ambas as enzimas e, portanto, qualquer sobra invalidaria o teste.

Após a lavagem, adicione 200 microlitros de água deionizada diretamente sobre as células. Em seguida, enxágue as células da placa e transfira-as para um tubo de reação de 1,5 mililitro. Coloque as amostras em um rack de espuma apropriado e vórtice-as por cinco segundos para tornar a lise mais eficiente.

Em seguida, alterne as amostras entre nitrogênio líquido por 10 segundos e banho-maria em temperatura ambiente até que o descongelamento esteja completo. Depois de repetir o procedimento de homogeneização cinco vezes, gire as amostras por cinco minutos a 10.000g. Em seguida, transferir o sobrenadante para um novo tubo de reacção.

Para realizar o ensaio de BCA, prepare um novo tubo para cada amostra contendo 40 microlitros de H20 deionizado e adicione 10 microlitros de amostra. Misture cada solução por vórtice breve e transfira 10 microlitros de cada amostra em triplicado para as cavidades de uma placa de 96 poços. Para preparar uma curva padrão, diluir uma solução-mãe BSA de 2 miligramas por mililitro e H2O deionizado de acordo com o protocolo de texto.

Depois de combinar o reagente A e o reagente B, inicie a reação adicionando 200 microlitros da solução reagente BCA e incube as amostras no escuro a 37 graus Celsius e 300 rpm em um agitador orbital por uma hora. Em seguida, meça a absorbância em 560 nanômetros em um leitor de placas. As amostras normalmente contêm entre um e 1,5 microgramas de proteína por microlitro.

Diluir a quantidade calculada de cada amostra e pipetá-la para tubos de reação frescos de 1,5 mililitro para obter 0,05 microgramas de alfa-galactosidase A ou 0,5 microgramas de alfa-glicosidase ácida por microlitro de solução. Vortex as amostras por cinco segundos novamente e pipetar 10 microlitros dessa diluição em duplicata em uma placa de 96 poços. Inicie as reações adicionando 20 microlitros da respectiva solução de substrato.

Para alfa-galactosidase A, adicione dois milimolares 4-metilumbelliferil alfa-D galactopiranosídeo, ou 4-MU-gal, em tampão fosfato-citrato 0,06 molar, pH 4,7. Para alfa-glicosidase ácida, adicione 2 milimolares de 4-metilumbeliferil alfa-D glicopiranosídeo, ou 4-MU-glu, em acetato de sódio 0,025 molar, pH 4,0. Incube as reações enzimáticas por uma hora no escuro a 37 graus Celsius e 300 rpm em um agitador orbital.

Em seguida, termine a reação adicionando 200 microlitros de tampão glicina e hidróxido de sódio ajustado para pH 1,0 molar. Prepare uma curva padrão de 4-MU a partir de um estoque de 0,01 miligrama por mililitro de acordo com o protocolo de texto e pipete 10 microlitros das soluções em duplicata em uma placa de 96 poços. Adicione 200 microlitros do tampão de hidróxido de sódio de glicina molar 1,0 a cada poço para ajustar o volume e o pH.

Finalmente, meça a atividade enzimática em um leitor de florescência equipado com o conjunto de filtros apropriado. E analise os dados usando o software apropriado para o dispositivo leitor de fluorescência. Para avaliar a eficiência da mutagênese do gene GLA, as mutações foram classificadas em três categorias e revelaram que cerca de 66,5% foram obtidas na primeira tentativa.

Podem ser obtidos mais 25% após uma segunda PCR ligeiramente modificada. Na categoria três, mais esforço, como o redesenho do primer, teve que ser realizado para produzir o clone desejado. Esta tabela refere-se aos resultados da medição da atividade enzimática para três mutações da alfa-galactosidase A e três mutações da alfa-glicosidase ácida não tratadas ou tratadas com DGJ e DNJ.

Os dados são exibidos como valores absolutos para a renovação do substrato e têm valores relativos normalizados para a enzima do tipo selvagem. Os dados absolutos de atividade enzimática foram corrigidos para a atividade enzimática endógena das células HEK293H usando células transfectadas com um vetor pcDNA 3.1 vazio. Os valores de atividade enzimática foram normalizados para enzima do tipo selvagem a partir de experimentos correspondentes, o que explica o desvio dos valores relativos entre os diferentes mutantes.

Uma vez dominada, a fração pós-cultura de células deste experimento, que representa a maior parte do tempo prático, pode ser feita em quatro horas. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo de doenças de armazenamento lisossômico explorarem correlações genótipo-fenótipo na doença de Fabry e Pompe. Este protocolo pode auxiliar no desenvolvimento de novos medicamentos em doenças de armazenamento lisossômico.