Name: In Vitro Enzima de medição para teste farmacológico acompanhante receptividade em Fabry e a doença de Pompe (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Aprenda a realizar ensaio enzimático in vitro para triagem de chaperonas farmacológicas em doenças de Fabry e Pompe. Este método padronizado permite avaliação fenotípica rápida e auxilia no desenvolvimento de terapias para doenças de armazenamento lisossômico.

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Os autores que gostaria de agradecer a Mandy Loebert e Tina Czajka por excelente suporte técnico. Agradecemos a Flora Luo (Harvard Medical School, Boston, MA, EUA) para o idioma de edição ajuda.

1. preparação das construções de mutante pcDNA3.1/ABL e pcDNA3.1/GAA
Nota: As estratégias de clonagem para a ABL e GAA codificação de sequências (cds) têm sido relatados anteriores15,18.
<ol>
	<li>Mutagenesis local-dirigido usando o Mutagenesis local-dirigido
	<ol>
		<li>Uso a referência sequências NM_000169.2 e NM_000152.4 como modelos para o mutagenesis de genes GLA e GA , respectivamente. Tenho um conjunto de alta pureza sal gratuito primers (25-37-mers) sintetizada por um provedor comercial, com sentido e antisentido primers carregando um das alterações respectivas sequência centrais ao seu comprimento apresentar individualmente a mutação. Use a ferramenta de projeto de epoxi para apoiar o projeto de cartilha19.</li>
		<li>Para a mistura de reação, use as condições padrão para a solução de reação e condições PCR fornecidas pelo fabricante.<ol>
			<li>Mistura de 5 µ l de 10 x 10, amortecedor da reação ng modelo dupla-hélice do ADN do plasmídeo (pcDNA3.1/ABL ou pcDNA3.1/GAA), 125 ng de cada primer, 1 µ l da mistura fornecida dNTP, 3 µ l de reagente de DMSO em um volume adequado de água desionizada (volume final de reação : 50 Μ L). Finalmente, adicione 2,5 U de DNA polimerase e misturar pipetando para cima e para baixo. Como um controle negativo, transporte ao longo de uma amostra não-primer.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Iniciar o PCR usando o programa a seguir: passo 1: 95 ° C por 1 min, passo 2: 95 ° C por 50 s, etapa 3: 60 ° C para 50 s, passo 4: 68 ° C por 8 min, repita a etapa 2-4 18 vezes e passo 5: 68 ° C por 10 min.<ol>
			<li>PCR, a seguir adicione 1 µ l do Dpnenzima de restrição (10 U / µ l) e ainda mais, incubar o frasco de reação a 37 ° C por 1h.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transformação e triagem para o desejado Clone
	<ol>
		<li>Transforme uma alíquota de células ultracompetent em conformidade com as recomendações do fabricante. Médio de utilização SOC (triptona 2% (p/v), levedura extrato 0,5% (p/v), NaCl 10 mM, KCl 2.5 mM, esterilizar a 121 ° C e em seguida, adicionar soluções estéreis filtrada de MgCl2 e glicose até concentrações finais de 10 e 20 mM, respectivamente) em vez do fabricante médio. Após o procedimento, placa 250 µ l do mutagenesis de amostra em um LB contendo ampicilina de 100 µ g/mL a placa e incubar a 37 ° C por 18 h.</li>
		<li>Assegurar que o número de transformants é &#62; 10 e a reação produz pelo menos três vezes mais colônias como a reação de controle não-primer, por exemplo, usando uma placa luminosa para facilitar a contagem de colônia. Em seguida, escolher 3 colônias e preparar 3 mL culturas durante a noite, no meio de caldo LB.</li>
		<li>No dia seguinte, realizar preparação de plasmídeo com um kit padrão e analisar toda a sequência usando T7 (5ʹ-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3ʹ) e BGHr (5ʹ-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3ʹ) primers através de Sanger padrão sequenciamento.</li>
		<li>Use uma ferramenta adequada de biologia molecular para analisar a sequência. Quando a mutação desejada é detectada e não mais sequência anormalidade em relação ao NM_000169.2 (α-galactosidase A) ou NM_000152.4 (ácido α-glucosidase) é visto, selecione o clone para purificação de plasmídeo de transfeccao-grau.</li>
		<li>Determine a pureza do DNA por medir a absorvância em espectrofotómetro. Nota: Permitir que apenas os preparativos que rendem uma pureza de plasmídeo com um rácio de absorvância 260/280 de &#62; 1.8 para celular cultura experiências.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. cultivo de células HEK293H
<ol>
	<li>Manter as células HEK293H em glicose alta (4,5 g/L) Dulbecco´s Modified Eagle suplementado (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% penicilina/estreptomicina. Manter as células uma incubadora a 37 ° C, sob uma atmosfera de2 5% CO de water-jacket.</li>
	<li>Cultive as células para uma densidade de 80-90%.</li>
	<li>Aspire o meio e lavar uma vez usar o fosfato tampão salino (PBS) sem Ca2 + e Mg2 +.</li>
	<li>Passagem pela adição de 0.05% Trypsin-EDTA e incubar durante 5 min a 37 ° C e 5% de CO2.</li>
	<li>Dividi as células 01:15 em meio fresco e a semente para um novo balão T75 para manter a cultura permanente. Não utilize pilhas com mais de 25 passagens.</li>
</ol>
3. pcDNA3.1/ABL e pcDNA3.1/GAA transfeccao Plasmideo e tratamento de HEK293H
<ol>
	<li>24 h antes o transfeccao, lavar as células HEK293H em um frasco de cultura celular T75 uma vez com PBS com Ca2 +, Mg2 +. As células com 0,05% Trypsin-EDTA como foi dito acima e semente de 1,5 x 105 células nas cavidades de uma placa de cultura bem 24 usando 500 µ l DMEM suplementado com 10% da colheita FBS sem antibióticos.</li>
	<li>Realize um protocolo de Transfeccao de acordo com o manual do fabricante. Normalmente, use uma mistura de 1 µ g de DNA de plasmídeo e 2,5 µ l de reagente de transfeccao em 100 µ l de soro livre DMEM. Incubar durante 20 min à temperatura ambiente e adicionar às células de maneira algumas, depois disso.</li>
	<li>Remova a mídia que contém o reagente de transfeccao após um período de 4 h em 37 °C/5% CO2 e adicione 500 µ l de fresco DMEM com 10% FBS / 1% penicilina/estreptomicina. Nota: Durante esta etapa, cloridrato de 1-Deoxygalactonojirimycin (DGJ) ou cloridrato de 1-Deoxynojirimycin (DNJ) pode ser adicionado ao meio de cultura onde se destina (usar uma solução aquosa de estoque de 10 mM a fim de obter uma concentração final de 20 µM DGJ e DNJ ). Fresco DGJ ou DNJ foi adicionado h 42 depois de transfeccao Plasmideo.</li>
</ol>
4. celular colheita e α-galactosidase A ou medição de atividade de ácido α-glicosidase
<ol>
	<li>Colheita da pilha
	<ol>
		<li>No dia da colheita, remover as células da incubadora e aspire o meio. Lave cuidadosamente as células 2 vezes com PBS com Ca2 + e Mg2 +. Nota: Esta etapa é essencial porque DGJ e DNJ são potentes inibidores da α-galactosidase e α-glucosidase, respectivamente, e qualquer sobra invalidaria o teste.</li>
		<li>Adicione 200 µ l de água desionizada diretamente sobre as células. Enxagúe as células da placa e transferi-los para um tubo de reação de 1,5 mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Homogeneização por congelamento e descongelamento
	<ol>
		<li>Colocar as amostras em um rack de espuma apropriado e vórtice para 5 s para fazer a lise mais eficiente. Colocar as amostras alternando em nitrogênio líquido para 10 s e um banho de água de temperatura ambiente até o descongelamento foi completa (5 min).</li>
		<li>Repita este procedimento 5 vezes e em seguida girar as amostras durante 5 min à 10.000 x g.</li></ol></li></ol>Manter o sobrenadante e pipeta em um novo tubo de reação.
	
	
	<li>Determinação da concentração da proteína usando bicinchoninic ácido (BCA) ensaio
	<ol>
		<li>Prepare um tubo fresco para cada amostra contendo 40 µ l de deionizada H2O e adicionar 10 µ l de amostra. Misturar a solução vortexing brevemente e transferir 10 µ l em uma cavidade de uma placa bem 96 (cada amostra em triplicata). Diluir uma solução de reserva de albumina de soro bovino (BSA) 2 mg/mL em desionizada H2O da seguinte maneira para obter uma curva padrão: 50 µ l H2O/50 µ l BSA; 60 µ l H2O/40 µ l BSA; 70 µ l H2O/30 µ l BSA; 80 µ l H2O/20 µ l BSA; 90 µ l H2O/10 µ l BSA; 100 µ l de H2O.</li>
		<li>Comece a reação adicionando-se 200 µ l de reagente BCA (Reagente A e Reagente B misturado na proporção de 50: 1) e incube por 1h no escuro a 37 ° C, sob agitação ligeira em um agitador orbital (300 rpm). Medir a absorvância a 560 nm em um leitor de placa. Nota: As amostras contêm tipicamente entre 1 e 1,5 µ g proteína por µ l.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Medição de atividade da enzima com substratos artificiais Methylumbelliferyl-4 (4-MUG)
	<ol>
		<li>Dilua a quantidade calculada de cada amostra e pipeta nos tubos de reação fresca 1,5 mL para obter 0,05 (para A α-galactosidase) ou 0,5 (para ácido α-glucosidase) soluções de proteína / µ l µ g. Vórtice amostras para 5 s novamente e pipetar 10 µ l desta diluição em um 96 placa bem (cada amostra em duplicado).</li>
		<li>Inicie a reação pela adição de 20 µ l da solução de substrato respectivos: Para α-galactosidase r: 2 mM 4-Methylumbelliferyl-α-D-galactopyranoside (4-MU-gal) em tampão de citrato de fosfato 0,06 M, pH 4,7. Para ácido α-glucosidase: 2 mM 4-methylumbelliferyl α-D-glucopiranósido (4-MU-glu) em acetato de sódio 0,025 M, pH 4.0.</li>
		<li>Incube as reacções enzimáticas por 1h no escuro a 37 ° C, sob agitação ligeira em um agitador orbital (300 rpm). Terminar a reação pela adição de 200 µ l de 1,0 M, tampão de pH 10,5 ajustado glicina-NaOH.</li>
		<li>Prepare uma curva padrão de 4-methylumbelliferone de um estoque de 0,01 mg/mL (4-MU), como segue: 100 µ l de H2O / não 4-MU; 80 µ l H2O / 20 µ l 4-MU; 60 µ l H2O / 40 µ l 4-MU; 40 µ l H2O / 60 µ l 4-MU; 20 µ l H2O / 80 µ l 4-MU; Não H2O / 100 µ l 4-MU, pipetar 10 µ l de cada diluição em 96 poço da placa (em duplicatas) e adicione 200 µ l de buffer de glicina-NaOH 1.0 M a cada poço a fim de ajustar o volume e o pH.</li>
		<li>Medida da atividade enzimática em um leitor de fluorescência, equipado com o filtro apropriado definir e analisar os dados usando o software apropriado para o dispositivo do leitor de fluorescência. Nota: Ambos os substratos 4-caneca são reduzidos a 4-MU durante a exposição ao α-galactosidase A ou ácido α-glucosidase. 4-MU lançado é um fluorocromo, que pode ser medido em 360 e 465 nm como os excitação e emissão de comprimentos de onda, respectivamente, um leitor de fluorescência de microplaca.</li>
	</ol>
	</li>

<ol><li>Cardiff University. , 
 <a target="_blank" href="http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.">http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.</a> (2017).</li>
<li>Meiji Pharmaceutical University. , <a target="_blank" href="http://fabry-database.org">http://fabry-database.org</a> (2017).</li>
<li>Erasmus Medical Center. Mutations In Human Acid Alpha-Glucosidase. , <a target="_blank" href="http://cluster15.erasmusmc.nl/klgn/pompe/mutations.html?lang=en">http://cluster15.erasmusmc.nl/klgn/pompe/mutations.html?lang=en</a> (2017).</li>
<li>Ishii, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+alpha-galactosidase+A+enzymes+identified+in+Fabry+disease+patients+with+residual+enzyme+activity%3A+biochemical+characterization+and+restoration+of+normal+intracellular+processing+by+1-deoxygalactonojirimycin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Mutant alpha-galactosidase A enzymes identified in Fabry disease patients with residual enzyme activity: biochemical characterization and restoration of normal intracellular processing by 1-deoxygalactonojirimycin.</a> Biochem J. 406, 285-295 (2007).</li>
<li>Tajima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+biochemical+studies+on+Pompe+disease+and+a+%26%2334%3Bpseudodeficiency+of+acid+alpha-glucosidase%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Structural and biochemical studies on Pompe disease and a &#34;pseudodeficiency of acid alpha-glucosidase&#34.</a> J Hum Genet. 52, 898-906 (2007).</li>
<li>Lukas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+Clinical+Consequences+of+Novel+%CE%B1-Galactosidase+A+Mutations+in+Fabry+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mutat%22%5BJournal%5D)">Functional and Clinical Consequences of Novel α-Galactosidase A Mutations in Fabry Disease.</a> Hum Mutat. 37, 43-51 (2016).</li>
<li>Parenti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treating+lysosomal+storage+diseases+with+pharmacological+chaperones%3A+from+concept+to+clinics%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Treating lysosomal storage diseases with pharmacological chaperones: from concept to clinics.</a> EMBO Mol Med. 1, 268-279 (2009).</li>
<li>Yasuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabry+disease%3A+characterization+of+alpha-galactosidase+A+double+mutations+and+the+D313Y+plasma+enzyme+pseudodeficiency+allele%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mutat%22%5BJournal%5D)">Fabry disease: characterization of alpha-galactosidase A double mutations and the D313Y plasma enzyme pseudodeficiency allele.</a> Hum Mutat. 22, 486-492 (2003).</li>
<li>Shimotori, M., Maruyama, H., Nakamura, G., Suyama, T., Sakamoto, F., Itoh, M., Miyabayashi, S., Ohnishi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+mutations+of+the+GLA+gene+in+Japanese+patients+with+Fabry+disease+and+their+functional+characterization+by+active+site+specific+chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mutat%22%5BJournal%5D)">Novel mutations of the GLA gene in Japanese patients with Fabry disease and their functional characterization by active site specific chaperone.</a> Hum Mutat. 29, 331(2008).</li>
<li>Andreotti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapy+of+Fabry+disease+with+pharmacological+chaperones%3A+from+in+silico+predictions+to+in+vitro+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Orphanet+J+Rare+Dis%22%5BJournal%5D)">Therapy of Fabry disease with pharmacological chaperones: from in silico predictions to in vitro tests.</a> Orphanet J Rare Dis. 6, 66(2011).</li>
<li>Khanna, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pharmacological+chaperone+AT2220+increases+the+specific+activity+and+lysosomal+delivery+of+mutant+acid+alpha-glucosidase%2C+and+promotes+glycogen+reduction+in+a+transgenic+mouse+model+of+Pompe+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The pharmacological chaperone AT2220 increases the specific activity and lysosomal delivery of mutant acid alpha-glucosidase, and promotes glycogen reduction in a transgenic mouse model of Pompe disease.</a> PLoS One. 9, e102092(2014).</li>
<li>Siekierska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-Galactosidase+aggregation+is+a+determinant+of+pharmacological+chaperone+efficacy+on+Fabry+disease+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">α-Galactosidase aggregation is a determinant of pharmacological chaperone efficacy on Fabry disease mutants.</a> J Biol Chem. 287, 28386-28397 (2012).</li>
<li>Parenti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+enhancement+of+mutated+alpha-glucosidase+activity+in+fibroblasts+from+patients+with+Pompe+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Pharmacological enhancement of mutated alpha-glucosidase activity in fibroblasts from patients with Pompe disease.</a> Mol Ther. 15, 508-514 (2007).</li>
<li>Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pharmacogenetic+approach+to+identify+mutant+forms+of+%CE%B1-galactosidase+A+that+respond+to+a+pharmacological+chaperone+for+Fabry+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mutat%22%5BJournal%5D)">A pharmacogenetic approach to identify mutant forms of α-galactosidase A that respond to a pharmacological chaperone for Fabry disease.</a> Hum Mutat. 32, 965-977 (2011).</li>
<li>Lukas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterisation+of+alpha-galactosidase+a+mutations+as+a+basis+for+a+new+classification+system+in+fabry+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Functional characterisation of alpha-galactosidase a mutations as a basis for a new classification system in fabry disease.</a> PLoS Genet. 9, e1003632(2013).</li>
<li>Andreotti, G., Citro, V., Correra, A., Cubellis, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thermodynamic+assay+to+test+pharmacological+chaperones+for+Fabry+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">A thermodynamic assay to test pharmacological chaperones for Fabry disease.</a> Biochim Biophys Acta. 1840, 1214-1224 (2014).</li>
<li>, <a target="_blank" href="https://www.google.ch/patents/US9095584">https://www.google.ch/patents/US9095584</a> (2017).</li>
<li>Lukas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+enhancers+for+the+treatment+of+Fabry+and+Pompe+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Enzyme enhancers for the treatment of Fabry and Pompe disease.</a> Mol Ther. 23, 456-4564 (2015).</li>
<li>, <a target="_blank" href="http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp ">http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp </a> (2017).</li>
<li>Yam, G. H., Bosshard, N., Zuber, C., Steinmann, B., Roth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+chaperone+corrects+lysosomal+storage+in+Fabry+disease+caused+by+trafficking-incompetent+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Pharmacological chaperone corrects lysosomal storage in Fabry disease caused by trafficking-incompetent variants.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 290, C1076-C1082 (2006).</li>
<li>Shin, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+pharmacological+chaperones+in+Fabry+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Screening for pharmacological chaperones in Fabry disease.</a> Biochem Biophys Res Commun. 359, 168-173 (2007).</li>
<li>Shin, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+response+of+mutated+alpha-galactosidase+A+to+a+pharmacological+chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenet+Genomics%22%5BJournal%5D)">Prediction of response of mutated alpha-galactosidase A to a pharmacological chaperone.</a> Pharmacogenet Genomics. 18, 773-7780 (2008).</li>
<li>Filoni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+studies+of+new+GLA+gene+mutations+leading+to+conformational+Fabry+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Functional studies of new GLA gene mutations leading to conformational Fabry disease.</a> Biochim Biophys Acta. 1802, 247-252 (2010).</li>
<li>Citro, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Large+Phenotypic+Spectrum+of+Fabry+Disease+Requires+Graduated+Diagnosis+and+Personalized+Therapy%3A+A+Meta-Analysis+Can+Help+to+Differentiate+Missense+Mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">The Large Phenotypic Spectrum of Fabry Disease Requires Graduated Diagnosis and Personalized Therapy: A Meta-Analysis Can Help to Differentiate Missense Mutations.</a> Int J Mol Sci. 17, (2016).</li>
<li>Cammisa, M., Correra, A., Andreotti, G., Cubellis, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabry_CEP%3A+a+tool+to+identify+Fabry+mutations+responsive+to+pharmacological+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Orphanet+J+Rare+Dis%22%5BJournal%5D)">Fabry_CEP: a tool to identify Fabry mutations responsive to pharmacological chaperones.</a> Orphanet J Rare Dis. 8, 111(2013).</li>
<li>Leinekugel, P., Michel, S., Conzelmann, E., Sandhoff, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+correlation+between+the+residual+activity+of+beta-hexosaminidase+A+and+arylsulfatase+A+and+the+severity+of+the+resulting+lysosomal+storage+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Quantitative correlation between the residual activity of beta-hexosaminidase A and arylsulfatase A and the severity of the resulting lysosomal storage disease.</a> Hum Genet. 88, 513-523 (1992).</li>
<li>Germain, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+pharmacodynamic+effects+of+a+pharmacological+chaperone+on+%CE%B1-galactosidase+A+activity+and+globotriaosylceramide+clearance+in+Fabry+disease%3A+report+from+two+phase+2+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Orphanet+J+Rare+Dis%22%5BJournal%5D)">Safety and pharmacodynamic effects of a pharmacological chaperone on α-galactosidase A activity and globotriaosylceramide clearance in Fabry disease: report from two phase 2 clinical studies.</a> Orphanet J Rare Dis. 7, 91(2012).</li>
<li>Hughes, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+pharmacological+chaperone+migalastat+compared+with+enzyme+replacement+therapy+in+Fabry+disease%3A+18-month+results+from+the+randomised+phase+III+ATTRACT+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Genet%22%5BJournal%5D)">Oral pharmacological chaperone migalastat compared with enzyme replacement therapy in Fabry disease: 18-month results from the randomised phase III ATTRACT study.</a> J Med Genet. 54, 288-296 (2017).</li>
<li>Parenti, G., Andria, G., Valenzano, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+Chaperone+Therapy%3A+Preclinical+Development%2C+Clinical+Translation%2C+and+Prospects+for+the+Treatment+of+Lysosomal+Storage+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Pharmacological Chaperone Therapy: Preclinical Development, Clinical Translation, and Prospects for the Treatment of Lysosomal Storage Disorders.</a> Mol Ther. 23, 1138-1148 (2015).</li>
<li>Parenti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Chaperone+Enhances+Blood+%CE%B1-Glucosidase+Activity+in+Pompe+Disease+Patients+Treated+With+Enzyme+Replacement+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">A Chaperone Enhances Blood α-Glucosidase Activity in Pompe Disease Patients Treated With Enzyme Replacement Therapy.</a> Mol Ther. 22, 2004-2012 (2014).</li>
</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

O protocolo descrito neste documento proporciona resultados robustos para avaliação dos danos da enzima em doenças lisossômicas hereditárias do metabolismo. Este manuscrito é que uma alteração do protocolo publicado anteriores15. As modificações mais cruciais envolvem rigor (ou seja, no processo de preparação de construção vector mutante), padronização do protocolo de cultura de célula (ou seja, as condições de manutenção e transfecção de células HEK293H) e a alta número de repet...

Há dúzias de desordens de doenças de depósito lisossômico (DDL) relacionados a disfunção glicosidase como resultado de mutações do gene principal. Em Fabry (OMIM #301500) e a doença de Pompe (OMIM #232300), mais de 500 e 200 mutações missense1,2,3 têm sido relatadas, respectivamente, que corresponde a cerca de 60% da contagem total de mutação. Numerosas novas variantes do gene ainda estão sendo identificadas, muitos dos quais têm desconhecido significado. Extensos estudos bioquímicos revelaram que certos genótipos não conduziu a uma completa perda de função do gene ABL (OMIM * 300644) na doença de Fabry, mas causam a enzima correspondente a falha alcançar um estado de dobramento termodinamicamente favorecido4 . Isso resulta em retenção de ER e degradação prematura da enzima funcional caso contrário. Conclusões similares foram desenhadas em outros LSDs, incluindo a doença de Pompe5. Além disso, caracterização molecular das variantes da enzima pode facilitar a interpretação clínica das mutações no momento do diagnóstico6, sugerindo que a progressão de LSD é um processo individual, com base na natureza da mutação. Portanto, a classificação convencional em diferentes tipos clínicos normalmente de 2 a 3 deve ser reavaliada a fim de racionalizar o aconselhamento clínico e decisões terapêuticas.
Terapia de reposição enzimática (ERT) está disponível para ambas as doenças. ERT, no entanto, tem limitada eficácia em tecidos/órgãos afetados como o cérebro e o músculo esquelético. Além disso, a ERT pode eliciar uma resposta imunogênica que coloca em risco seus benefícios terapêuticos. Acompanhantes farmacológicas (PCs) são uma alternativa atraente de tratamento para pacientes com mutações responsivos so-called. PCes servem como um andaime molecular para proteínas correto e estabilização que por sua vez impede a retenção de retículo endoplasmático (ER) e ER-associado a degradação da enzima. Além disso, PCs podem ser administrados por via oral e são potencialmente capazes de atravessar a barreira hemato-encefálica. Portanto, o PCT pode ser uma opção mais viável para o tratamento de pacientes com determinados genótipos. Para uma extensa revisão sobre aplicação de PC em DDL, consulte a excelente revisão por Parenti7.
A descoberta de centenas de doenças causando alelos mutantes desafia testar da droga do pre-clínica e exige uma avaliação simples, rápida e altamente padronizada de pacientes passíveis de uma abordagem de medicina personalizada. A fim de avaliar os efeitos nocivos de mutações do gene de LSD e testar mutações candidato para predizer pacientes passíveis de PCT, era um sistema de sobre-expressão altamente padronizados em células HEK293H que permite a medição de atividade enzimática rápida e confiável desenvolvido. Sistemas de sobre-expressão semelhantes têm sido descritos anteriormente para a doença de Fabry e Pompe com COS-78,9,10,11, de células HeLa12ou HEK29313 ,14,15,16 células para o gene glicosidase.
Um método muito semelhante mesmo foi patenteado como "Método para predizer a resposta ao tratamento farmacológico acompanhante de doenças"17 , indicando a relevância de uma célula de cultura sistema capaz de ser integrada na prática clínica.

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuikChange II XL Kit de Mutagênese Dirigida ao Local&nbsp;</td><td>Stratagene, La Jolla, CA, EUA</td><td>#200522</td><td></td></tr><tr><td>Primer GLA[R301Q]-frw: 5&agudo;- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3&agudo;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemanha</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GLA[R301Q]-rev: 5&agudo;- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3&agudo;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemanha</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GLA[A156V]-frw: 5&agudo;-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3&agudo;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemanha</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GLA[A156V]-rev: 5&agudo;-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3&agudo;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemanha</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GLA[A156V]-frw: 5&agudo;-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3&agudo;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemanha</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GLA[A143T]-rev: 5&agudo;-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3&agudo;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemanha</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA[F455Y]-frw: 5&acute;-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3&agudo;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemanha</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA[F455Y]-rev: 5&agudo;-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3&agudo;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemanha</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA[P545L]-frw: 5&acute;-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3&agudo;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemanha</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA[P545L]-rev: 5&agudo;-CCA ACC ACC CCA AGC ACG TAG GGT G-3&agudo;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemanha</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA[L552P]-frw: 5&agudo;-TTG GGG GGA CCC CCC AGG CGG CCA C-3&agudo;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemanha</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA[P545L]-rev: 5&agudo;-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3&agudo;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemanha</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>T7: 5&agudo;-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3&agudo;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemanha</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>BGHrev: 5&agudo;-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3&agudo;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemanha</td><td>n.a.Triptona</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha</td><td>8952.1</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Merck, Darmstadt, Alemanha</td><td>103.753</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Merck, Darmstadt, Alemanha</td><td>1.064.041.000</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Merck, Darmstadt, Alemanha</td><td>1.049.360.500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 x 6H2O</td><td>Merck, Darmstadt, Alemanha</td><td>1.058.330.250</td><td></td></tr><tr><td>D (+)-Glicose monohidratada</td><td>Merck, Darmstadt, Alemanha</td><td>1.083.422.500</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de Sódio</td><td>Merck, Darmstadt, Alemanha</td><td>1.064.980.500</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha</td><td>3908.2</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha</td><td>X863.3</td><td></td></tr><tr><td>hidrogenofosfato dissódico</td><td>Merck, Darmstadt, Alemanha</td><td>1.065.860.500</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sódio</td><td>Merck, Darmstadt, Alemanha</td><td>1.062.640.050</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Sigma Aldrich, Munique, Alemanha</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha</td><td>X969.2</td><td></td></tr><tr><td>LB Medium</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha</td><td>X968.2</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Minipreparação de Plasmídeo</td><td>Zyppy ZymoResearch, Freiburg, Alemanha</td><td>D4020</td><td></td></tr><tr><td>QIAfilter Kit Midi de Plasmídeo</td><td>Qiagen, Hilden, Alemanha</td><td>12245</td><td></td></tr><tr><td>Linha celular HEK293H</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha</td><td>11631-017&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&agudo; s Modified Eagle Medium&nbsp;</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha</td><td>31966-047</td><td></td></tr><tr><td>HyClone soro fetal bovino</td><td>GE Healthcare, South Logan, Utah, EUA</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de Cultura de Células Padrão CELLSTAR, Greiner Bio One</td><td>VWR International GmbH, Hannover, Alemanha</td><td>82050-854</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de células (24 poços)</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Alemanha</td><td>831,836</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 poços Cellstar</td><td>Greiner bio one, Frickenhausen, Alemanha</td><td>655185</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de reação SafeSeal, 1,5mL&nbsp;</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Alemanha</td><td>72,706</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de 1-Desoxigalactonojirimicina&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich, Munique, Alemanha</td><td>D9641</td><td></td></tr><tr><td>1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride&nbsp;</td><td>Toronto Research Chemicals, Toronto, Canadá</td><td>D236500</td><td></td></tr><tr><td>1-Desoxinojirimicina&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich, Munique, Alemanha</td><td>D9305</td><td></td></tr><tr><td>PBS Dulbecco sem cálcio, sem biocromo de magnésio</td><td>, Berlim, Alemanha</td><td>L 1825</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol</td><td>Thermo Scientific, Braunschweig, Alemanha</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensaio de proteína Pierce BCA</td><td>Thermo Scientific, Braunschweig, Alemanha</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>4-metilumbeliferona</td><td>Sigma Aldrich, Munique, Alemanha</td><td>M1381</td><td></td></tr><tr><td>4-metilumbelliferil &alfa;-D-galactopiranosídeo Sigma</td><td>Aldrich, Munique, Alemanha</td><td>M7633</td><td></td></tr><tr><td>4-metilumbelliferil &alfa;-D-glucopiranosídeo</td><td>Sigma Aldrich, Munique, Alemanha</td><td>M9766</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo </td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>incubadora tipo T6</td><td>Heraeus Instruments, Hanau, Alemanha</td><td>n.a.Placa</td><td></td></tr> <tr><td>Luminosa Gr. 2 E</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha</td><td>P265.1</td><td></td></tr><tr><td>3130 xl Analisador Genético&nbsp;</td><td>Applied Biosystems, Darmstadt, Alemanha</td><td>n.a.GFL-3032</td><td></td></tr> <tr><td>agitador bacteriano</td><td>GFL, Burgwedel, Alemanha&nbsp;</td><td>n.a.Avanti</td><td></td></tr> <tr><td>J-25 centrífuga</td><td>Beckman/Coulter, Krefeld, Alemanha</td><td>n.a.Ultraspec</td><td></td></tr> <tr><td>3100 pro Espectrofotômetro</td><td>Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Reino Unido</td><td>n.a.incubadora</td><td></td></tr> <tr><td>de jaqueta d'água&nbsp;</td><td>Binder, Tuttlingen, Alemanha</td><td>n.a.Vortex</td><td></td></tr> <tr><td>Genie 1 misturador de toque</td><td>Scientific Industries, Bohemia, NY, EUA</td><td>n.a.Z</td><td></td></tr> <tr><td>233 MK-2 centrífuga de microtubos refrigerada</td><td>Hermle, Tuttlingen, Alemanha&nbsp;</td><td>n.a.LaboStar</td><td></td></tr> <tr><td>dispositivo de água ultrapura</td><td>Siemens, Berlim, Alemanha</td><td>n.a.Thermo</td><td></td></tr> <tr><td>Shaker PST-60HL-4 agitador orbital</td><td>Biosan, Riga, Letônia</td><td>n.a.Tecan</td><td></td></tr> <tr><td>GENios Reader</td><td>Tecan, M&auml; nnedorf, Suíça</td><td>n.a.HI</td><td></td></tr> <tr><td>223 Medidor de pH Microprocessador</td><td>HANNA Instruments, Arvore, Portugal</td><td>n.a.CASY</td><td></td></tr><<tr><td>br/> Contador de Células + Sistema Analisador Modelo TT</td><td>Innovatis AG, Cham/Zug, Suíça</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magellan software de análise de dados v6.6</td><td>Tecan, M&auml; nnedorf, Suíça</td><td>n.a.GraphPad</td><td></td></tr> <tr><td>Prism 5.04</td><td>GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA; EUA</td><td>n.a.Microsoft</td><td></td></tr> <tr><td>Office 2010</td><td>Microsoft Corporation, Redmond, WA, EUA</td><td>n.a.BioEdit</td><td></td></tr> <tr><td>Alignment Editor, V7.0.1</td><td>http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Abreviações</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>frw = para a frente; rev = reverse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>n.a. = não aplicável</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro enzima de medição para teste farmacológico acompanhante receptividade em fabry e a doença de pompe

In Vitro Enzyme Measurement to Test Pharmacological Chaperone Responsiveness in Fabry and Pompe Disease

O uso da medicina personalizada para tratar doenças monogénicas raras como doenças de depósito lisossômico (DDL) é desafiado por projetos complexos de julgamento clínicos, custos elevados e baixos números de paciente. Centenas de alelos mutantes estão implicadas na maior parte a DDL. As doenças geralmente são classificadas em 2 ou 3 diferentes tipos clínicos de acordo com a gravidade. Além disso, a caracterização molecular do genótipo pode ajudar a prever os resultados clínicos e informar o atendimento ao paciente. Portanto, nós desenvolvemos um ensaio de cultura de células simples baseado em células HEK293H heterologously over expressando as mutações identificadas na doença de Fabry e Pompe. Um ensaio semelhante foi recentemente introduzido como um teste pré-clínicos para identificar mutações favoráveis para a terapia farmacológica de acompanhante (PCT) na doença de Fabry. Este manuscrito descreve um ensaio de cultura de célula alterada que permite rápida avaliação fenotípica de variantes alélicas na doença de Fabry e Pompe para identificar pacientes elegíveis para PCT e pode ajudar no desenvolvimento do romance pharmacochaperones.

O procedimento de mutagênese Para avaliar a eficiência de mutagênese do gene ABL , as mutações foram classificadas em uma das seguintes categorias. Esta abordagem para gerar mutações revelou que cerca de 66,5% das mutações ABL foram obtidas na primeira tentativa. Mais 25% pode ser obtido após uma PCR segundo ligeiramente modificada.
Categoria 1: O mutagenesis PCR foi eficaz na primeira tenta...

Há uma demanda para fazer pré-clínicos de teste para uma novela classe de drogas "órfão" chamado acompanhantes farmacológicos podem ser reproduzidos, rápido e eficiente. Desenvolvemos um ensaio de baseado em cultura celular altamente padronizado, simples e versátil para tela para pacientes elegíveis, bem como drogas de romance acompanhante farmacológica.

In Vitro Enzima de medição para teste farmacológico acompanhante receptividade em Fabry e a doença de Pompe

The use of personalized medicine to treat rare monogenic diseases like lysosomal storage disorders (LSDs) is challenged by complex clinical trial designs, ...

O objetivo geral deste protocolo de cultura celular alterado é fornecer uma avaliação fenotípica rápida da variância alélica na doença de Fabry e Pompe. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo das doenças de armazenamento lisossômico, como resultados prognósticos e decisões terapêuticas. A principal vantagem dessa técnica é que ela é altamente reprodutível e pode auxiliar no desenvolvimento de novos medicamentos, como farmacochaperonas.Para realizar a mutagênese dirigida ao local, comece usando as sequências de referência NM 00169.2 e NM 00152.4 como modelos para a mutagênese dos genes GLA e GAA, respectivamente. Use a ferramenta gratuita Primer Design para dar suporte ao design de primers. Em seguida, tenha um conjunto de primers de alta pureza e sem sal sintetizados por um fornecedor comercial, com primers sense e antisense carregando uma das respectivas modificações de sequência, centrais para seu comprimento, para introduzir individualmente a mutação.Preparar a mistura de reacção num volume de 50 microlitros e executar o programa de PCR utilizando as condições normalizadas fornecidas pelo fabricante e indicadas no protocolo de texto. Após a PCR, adicione um microlitro de enzima de restrição Dpn1 e continue a incubar os frascos de reação a 37 graus Celsius por uma hora. Depois de transformar o DNA plasmático em células E.coli competentes e preparar plasmídeos da transformância desejada de acordo com o protocolo de texto, use uma ferramenta de biologia molecular adequada para analisar a sequência.Quando a mutação desejada for detectada e nenhuma outra anormalidade de sequência em comparação com NM 000169.2 para alfa-galactosidase A ou NM 000152.4 para alfa-galactosidase ácida for observada, selecione o clone para purificação de plasmídeo de grau de transfecção. Determinar a pureza do ADN medindo a absorvância num espectrofotómetro. Após o cultivo de HEK293H células em frasco de cultura T75 de acordo com o protocolo de texto, 24 horas antes da transfecção, usar PBS sem cálcio ou magnésio para lavar as células uma vez.Com 0,05% de tripsina-EDTA, colha as células e nas cavidades de uma placa de cultura de 24 poços use 500 microlitros de DMEM suplementado com 10% de FBS para semear 1,5 vezes 10 para as cinco células. Realize a transfecção celular de acordo com o manual do fabricante. Usando uma mistura de um micrograma de DNA plasmidial dissolvido em 100 microlitros de DMEM sem soro e 2,5 microlitros de reagente de transfecção.Incube a solução por 20 minutos em temperatura ambiente e, em seguida, adicione-a às células gota a gota. Após um período de quatro horas a 37 graus Celsius e 5% de CO2, remova o meio que contém o reagente de transfecção e adicione 500 microlitros de DMEM fresco com 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina. Como opção durante esta etapa, adicione DGJ ou DNJ ao meio de cultura onde pretendido.No dia da colheita, retire as células da incubadora. Em seguida, aspire o meio e use PBS com cálcio e magnésio para lavar cuidadosamente as células duas vezes. Esta etapa é crítica porque DGJ e DNJ são inibidores de ambas as enzimas e, portanto, qualquer sobra invalidaria o teste.Após a lavagem, adicione 200 microlitros de água deionizada diretamente sobre as células. Em seguida, enxágue as células da placa e transfira-as para um tubo de reação de 1,5 mililitro. Coloque as amostras em um rack de espuma apropriado e vórtice-as por cinco segundos para tornar a lise mais eficiente.Em seguida, alterne as amostras entre nitrogênio líquido por 10 segundos e banho-maria em temperatura ambiente até que o descongelamento esteja completo. Depois de repetir o procedimento de homogeneização cinco vezes, gire as amostras por cinco minutos a 10.000g. Em seguida, transferir o sobrenadante para um novo tubo de reacção.Para realizar o ensaio de BCA, prepare um novo tubo para cada amostra contendo 40 microlitros de H20 deionizado e adicione 10 microlitros de amostra. Misture cada solução por vórtice breve e transfira 10 microlitros de cada amostra em triplicado para as cavidades de uma placa de 96 poços. Para preparar uma curva padrão, diluir uma solução-mãe BSA de 2 miligramas por mililitro e H2O deionizado de acordo com o protocolo de texto.Depois de combinar o reagente A e o reagente B, inicie a reação adicionando 200 microlitros da solução reagente BCA e incube as amostras no escuro a 37 graus Celsius e 300 rpm em um agitador orbital por uma hora. Em seguida, meça a absorbância em 560 nanômetros em um leitor de placas. As amostras normalmente contêm entre um e 1,5 microgramas de proteína por microlitro.Diluir a quantidade calculada de cada amostra e pipetá-la para tubos de reação frescos de 1,5 mililitro para obter 0,05 microgramas de alfa-galactosidase A ou 0,5 microgramas de alfa-glicosidase ácida por microlitro de solução. Vortex as amostras por cinco segundos novamente e pipetar 10 microlitros dessa diluição em duplicata em uma placa de 96 poços. Inicie as reações adicionando 20 microlitros da respectiva solução de substrato.Para alfa-galactosidase A, adicione dois milimolares 4-metilumbelliferil alfa-D galactopiranosídeo, ou 4-MU-gal, em tampão fosfato-citrato 0,06 molar, pH 4,7. Para alfa-glicosidase ácida, adicione 2 milimolares de 4-metilumbeliferil alfa-D glicopiranosídeo, ou 4-MU-glu, em acetato de sódio 0,025 molar, pH 4,0. Incube as reações enzimáticas por uma hora no escuro a 37 graus Celsius e 300 rpm em um agitador orbital.Em seguida, termine a reação adicionando 200 microlitros de tampão glicina e hidróxido de sódio ajustado para pH 1,0 molar. Prepare uma curva padrão de 4-MU a partir de um estoque de 0,01 miligrama por mililitro de acordo com o protocolo de texto e pipete 10 microlitros das soluções em duplicata em uma placa de 96 poços. Adicione 200 microlitros do tampão de hidróxido de sódio de glicina molar 1,0 a cada poço para ajustar o volume e o pH.Finalmente, meça a atividade enzimática em um leitor de florescência equipado com o conjunto de filtros apropriado. E analise os dados usando o software apropriado para o dispositivo leitor de fluorescência. Para avaliar a eficiência da mutagênese do gene GLA, as mutações foram classificadas em três categorias e revelaram que cerca de 66,5% foram obtidas na primeira tentativa.Podem ser obtidos mais 25% após uma segunda PCR ligeiramente modificada. Na categoria três, mais esforço, como o redesenho do primer, teve que ser realizado para produzir o clone desejado. Esta tabela refere-se aos resultados da medição da atividade enzimática para três mutações da alfa-galactosidase A e três mutações da alfa-glicosidase ácida não tratadas ou tratadas com DGJ e DNJ.Os dados são exibidos como valores absolutos para a renovação do substrato e têm valores relativos normalizados para a enzima do tipo selvagem. Os dados absolutos de atividade enzimática foram corrigidos para a atividade enzimática endógena das células HEK293H usando células transfectadas com um vetor pcDNA 3.1 vazio. Os valores de atividade enzimática foram normalizados para enzima do tipo selvagem a partir de experimentos correspondentes, o que explica o desvio dos valores relativos entre os diferentes mutantes.Uma vez dominada, a fração pós-cultura de células deste experimento, que representa a maior parte do tempo prático, pode ser feita em quatro horas. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo de doenças de armazenamento lisossômico explorarem correlações genótipo-fenótipo na doença de Fabry e Pompe. Este protocolo pode auxiliar no desenvolvimento de novos medicamentos em doenças de armazenamento lisossômico.

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Research

JoVE Journal

Medicine

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