Name: Mapeamento simultâneo e quantificação de ribonucleotídeos no DNA mitocondrial humano (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 35 s
Description: Aprenda a mapear e quantificar ribonucleotídeos no DNA mitocondrial humano com resolução de nucleotídeo único. Este método combina clivagem enzimática com hidrólise alcalina e sequenciamento.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este estudo foi suportado pelo Conselho de pesquisa Sueco (www.vr.se) concede ao arco (2014-6466 e a Fundação sueca para a investigação estratégica (www.stratresearch.se) ao arco (ICA14-0060). Chalmers University of Technology prestou apoio financeiro à MKME durante este trabalho. Os financiadores não tinham qualquer papel no projeto de estudo, coleta de dados e análise, a decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

este protocolo é descrito na Figura 1 e inclui o isolamento de gDNA, digestão com enzimas de restrição para ser capaz de quantificar o número de ribonucleotídeos, tratamento com álcali para hidrolisar as ligações fosfodiéster de ribonucleotídeos incorporada a gDNA, fosforilação das extremidades livre 5´-OH, ssDNA ligadura dos adaptadores, segunda vertente de síntese e amplificação por PCR antes sequenciamento.
 1. índice de Primers e adaptadores <ol><li>ARC49 obter, ARC140 oligonucleotides, ARC76/77, adaptador e ARC78-ARC107 as primeiras demão índice (ver tabela 1). 
	Nota: Oligonucleotides devem ser purificado de HPLC. ARC76/77 são ordenados como duplex.</li>
	<li>Preparar 100 µM as soluções de cada oligonucleotide em tampão Tris-EDTA (TE) (consulte a Tabela de materiais) e armazenar a -20 ° C.</li>
	Soluções de <li>soluções de preparar 10 µM de ARC67/77 e 2 µM de primers ARC49 e índice diluindo em tampão de eluição (EB; consulte a Tabela de materiais). Loja a-20 ° C.</li>
</ol> 2. Crescimento e colheita de células <ol><li>células HeLa crescer em 70 mL Dulbecco &#39; s Modified Eagle Medium (DMEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal em um balão de 250 mL Spinner em 37 ° C.</li>
	<li>Contar o número de células e coletar 5 x 10 6 células em um tubo de 50 mL, centrifugar por 5 min a 200 x g e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Lavar as células com 20 mL 1X PBS, centrifugar por 5 min a 200 x g e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Congelar as bolinhas a-20 ° C ou continuar com a purificação de DNA.</li>
</ol> 3. Purificação de DNA e quantificação <ol><li>purificar gDNA usando extração fenol-clorofórmio, conforme descrito abaixo.
	<ol><li>Ressuspender as células em 2 mL de tampão de lise (consulte a Tabela de materiais) e incube por 30 min a 42 ° C em um bloco de aquecimento. 
		Cuidado: Lise contém componentes perigosos. Solução de SDS é irritante, Proteinase K é tóxico, irritante e sensibilização. Use roupas protetoras e luvas.</li>
		<li>Dividir a amostra em dois tubos de 2 mL e adicionar 1 volume (V) de álcool isoamílico-fenol-clorofórmio (25:24:1). 
		Cuidado: O álcool isoamílico-fenol-clorofórmio é tóxicos, mutagênicos, corrosivos e perigosos para ambientes aquáticos. Use em uma coifa, usar roupas protetoras e luvas e descarte de resíduos especiais de fenol-clorofórmio.</li>
		<li>Mix por inversão para 30-60 s e centrifugar durante 5 min à 15.000 x g à temperatura ambiente. 
		Nota: Fazer não vórtice DNA para evitar a introdução de quebras aleatórias, que iria distorcer os resultados.</li>
		<li>Transferir a fase aquosa, superior para um novo tubo de 2 mL e adicionar 1 V de álcool isoamílico-fenol-clorofórmio (25:24:1).</li>
		<li>Mix por inversão e centrifugar durante 5 min à 15.000 x g a 4 ° C.</li>
		<li>Transferir a fase aquosa, superior para um novo 2 mL tubo e adicionar 20 µ l NaCl (5 M) e 1 V de isopropanol frio. 
		Atenção: O Isopropanol é inflamável, irritante e tóxico. Armazená-lo em um gabinete ventilado, usar roupas protetoras e luvas e mantê-lo afastado de chamas.</li>
		<li>Mix por inversão e incubar durante pelo menos 1 h a -20 ° C.</li>
		<li>Centrífuga por 20 min em 15.000 x g, 4 ° C e descartar sobrenadante.</li>
		<li>Pellet de DNA de lavagem com 200 µ l 70% álcool etílico frio, centrifugar por 20 min a 15.000 x g a 4 ° C e descartar o sobrenadante. 
		Atenção: 70% de etanol é inflamável e irritante. Manter a solução de trabalho em-20 ° C, caso contrário loja no armário ventilado, roupas protetoras e luvas e mantê-lo afastado de chamas.</li>
		<li>Secar o sedimento de DNA à temperatura de 20-25 min.</li>
		<li>Pelotas de DNA dissolver em 100 µ l de TE do buffer e as amostras em um tubo do pool.</li>
	</ol></li> <li>Concentração de DNA dosar usando um reagente de quantificação de dsDNA de acordo com o fabricante &#39; s especificações (ver a Tabela de materiais). 
	Nota: Usar um reagente de quantificação de dsDNA, como quantificação espectrofotométrica do DNA pode ser afectada por fenol residual.</li>
	<li>DNA loja a-20 ° C ou continuar com o tratamento de HincII.</li>
</ol> 4. Hidrólise alcalina e tratamento de HincII <ol><li>Digest 1 µ g de DNA em uma reação de mistura contendo 5 µ l 10x buffer 3.1, 1 µ l (10 U) HincII e livre de nuclease H 2 O, até um volume final de 50 µ l. 
	Nota: Para conseguir condições óptimas para ligadura, segunda vertente de síntese e amplificação por PCR, pode ser necessário aumentar a quantidade de DNA de entrada se espera-se que o ADN contém um número muito baixo de ribonucleotídeos. Da mesma forma, pode ser necessário diminuir a entrada de DNA se o número de ribonucleotídeos é muito alto.</li>
	<li>Incubar durante 30 min a 37 ° C.</li>
	<li>HincII purificar tratados DNA com grânulos paramagnéticos. 
	Nota: Mantenha o tubo tampas abrir nas etapas a seguir para não perturbar pelotas abrindo os tubos.
	<ol><li>Adicionar 1,8 V de grânulos paramagnéticos para cada amostra, misturar cuidadosamente pipetando e incubar à temperatura ambiente durante 10 min.</li>
		<li>Usar um rack magnético para granular os grânulos por 5 min, em seguida, remover e descartar o sobrenadante.</li>
		<li>Lavar a pelota com 150 µ l de etanol 70% (temperatura ambiente) para cerca de 30 s em seguida, remover e descartar o sobrenadante.</li>
		<li>Lavagem a pelota com 200 µ l de etanol 70% (temperatura ambiente) por cerca de 30 s, então, remover e descartar o sobrenadante. 
		Nota: Etanol Residual pode ser removido com uma pipeta de 10 µ l. As gotas podem ser giradas para baixo brevemente antes.</li>
		<li>Secar as amostras em temperatura ambiente por cerca de 15-20 min. 
		Nota: O tempo exato depende do volume dos grânulos e a forma da pelota, portanto, as pastilhas devem ser verificadas visualmente.</li>
		<li>Remover tubos de rack magnético e eluir a pelota em µ l 45 EB, mistura pipetando cuidadosamente.</li>
		<li>Incubar por 5 min então granular os grânulos no rack magnético e use 45 µ l de DNA purificado na etapa 4.4.</li>
	</ol></li> <li>Adicionar 5 µ l de KOH (3 M) ou KCl (3 M) com o DNA criando um volume total de 50 µ l. 
	Cuidado: solução de KOH M 3 é corrosivo. Use roupas protetoras e luvas.</li>
	Forno de <li>incubar durante 2 h a 55 ° C em uma hibridação seguido por 5 min no gelo 
	Nota: Recomenda-se realizar o tratamento de KOH em um forno, ao invés de um bloco de aquecimento para manter um aquecimento uniforme do tubo e impedir a condensação na tampa.</li>
	<li>DNA precipitado pela adição de acetato de sódio 10 µ l (3 M, pH = 5,2) e 125 µ l 100% álcool etílico frio. Incubar no gelo por 5 min. 
	Atenção: 100% de etanol é inflamável e irritante. Armazenar em um gabinete ventilado, usar roupas protetoras e luvas e manter afastado de chamas.</li>
	<li>GDNA de pelotas por centrifugação a 21.000 x g, 4 ° C por 5 min e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Lavagem DNA pelota com 250 µ l frio 70% EtOH, centrifugar a 21.000 x g, 4 ° C por 5 min e descartar o sobrenadante. 
	Nota: Para remover as gotas, o tubo pode ser girado para baixo, brevemente novamente e sobrenadante pode ser removido com uma pipeta de 10 µ l.</li>
	<li>Deixar o sedimento secar em um tubo aberto por cerca de 5-10 min até visível todo o líquido tenha evaporado.</li>
	<li>DNA deixa pelota dissolvê-los em 20 µ l EB por 30 min à temperatura ambiente.</li>
</ol> 5. 5´ final fosforilação <ol><li>preparar a mistura de reação para cada amostra antecipadamente contrasome de 2,5 µ l 10 x T4 amortecedor da reação da quinase polinucleotídicas, 1 µ l (10 U) 3´-fosfatase-menos T4 polinucleotídicas da quinase e 2,5 µ l ATP (10 mM).</li>
	<li>Transferência 19 µ l de cada DNA para um novo tubo de 200 µ l da amostra e desnaturar por 3 min a 85 ° C em um thermo-cycler.</li>
	<li>Cool DNA amostras no gelo e adicione 6 µ l da mistura de reação para cada amostra.</li>
	<li>Mistura de reação de incubar a 37 ° C por 30 min e parar a reação incubando-se as amostras a 65 ° C por 20 min.</li>
	<li>Purificar DNA como descrito no ponto 4.3, usando 1.8 V dos grânulos paramagnéticos mas eluir em µ l 14 EB.</li>
</ol> 6. ssDNA ligadura <ol><li>preparar a mistura de reação para cada amostra antecipadamente consistindo de 0.5 µ l ATP (2 mM), 5 µ l 10 x amortecedor da reação do RNA T4 ligase, 5 µ l CoCl 3 (NH 3) 6 (10 mM), 0,5 µ l ARC140 (100 µM) e 25% de 50 µ l PEG 8000. Mistura bem pipetando. 
	Atenção: CoCl 3 (NH 3) 6 é cancerígeno, sensibilização e perigosas para o ambiente aquático. Use roupas protetoras e luvas.</li>
	<li>Transferência 13 µ l de DNA purificado de passo 5.5 para um novo tubo de 200 µ l e desnaturar por 3 min a 85 ° C em um thermo-cycler.</li>
	<li>Legal o DNA no gelo e adicione 36 µ l da mistura de reação para cada amostra, misturar pipetando spin para baixo brevemente.</li>
	<li>Adicionar 1 µ l (10 U) de T4 Ligase de RNA para cada reação, misturar pipetando e spin para baixo brevemente.</li>
	<li>Incubar as amostras à temperatura ambiente na noite escura.</li>
</ol> 7. Síntese segundo-Costa <ol><li>Purify ligado DNA, conforme descrito no ponto 4.3, mas usar 0,8 V de grânulos paramagnéticos, granular os grânulos por 10 min e eluir em 20 µ l EB. 
	Nota: Devido à maior viscosidade da mistura de reação da ligadura, a primeira etapa de granulação é prolongada.</li>
	<li>Transferência de 20 µ l de amostra de DNA para um novo tubo de PCR de 200 µ l. Repita a etapa de purificação usando 0.8 V de grânulos paramagnéticos seguindo o fabricante &#39; s especificações e eluir em µ l 14 EB.</li>
	<li>Preparar a mistura de reação para cada amostra antecipadamente consistindo de 2 µ l de 10 x T7 DNA polimerase amortecedor da reação, 2 µ l ARC76/77 (2 µM), 2 µ l dNTPs (2 mM) e 0,8 µ l BSA (1 mg/mL).</li>
	<li>µ L 12,8 transferir purificado DNA para um novo tubo de 200 µ l, desnaturar por 3 min a 85 ° C em um thermo-cycler.</li>
	<li>Legal o DNA no gelo e adicionar 6,8 µ l da mistura de reação de cada amostra, misturar pipetando, spin para baixo rapidamente e incubar durante 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Adicionar 0,4 µ l (4 U) T7 DNA polimerase para cada reação e incubar durante 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Purificar DNA como descrito no ponto 4.3, usando 0.8 V de grânulos paramagnéticos e eluir em 11 µ l EB.</li>
</ol> 8. Amplificação por PCR e quantificação da biblioteca tubo de <ol><li>Prepare a mistura de reação para cada amostra em um novo 200 µ l antecipadamente consistindo de 7,5 µ l ARC49 (2 µM), primeira demão de índice 7,5 µ l (2 µM, exclusivo para cada amostra) e 25 µ l 2 x começo quente mistura pronta.</li>
	<li>Adicionar 10 µ l de amostra de DNA para cada reação. Amplificar a biblioteca usando as seguintes condições: desnaturar a 95 ° C por 45 s, seguido de 18 ciclos de 98 ° C por 15 s, 65 ° C por 30 s, 72 ° C por 30 s, terminando com um alongamento final a 72 ° C para amostras de espera de 2 min. a 4 ° C após amplificação.</li>
	<li>Purificar bibliotecas conforme descrito no ponto 4.3, usando 0.8 V de grânulos paramagnéticos e eluir no buffer de TE 20 µ l.</li>
	<li>Dosar bibliotecas usando um reagente de quantificação de dsDNA, de acordo com o fabricante &#39; s especificações (ver a Tabela de materiais).</li>
	<li>Armazenar amostras a-20 º C ou continuar com a análise de biblioteca.</li>
</ol> 9. Análise de biblioteca e de <ol><li>determinar a qualidade de cada biblioteca e estimar o tamanho do fragmento média usando um sistema de eletroforese digital. 
	Nota: O tamanho do fragmento média é avaliado pela estimativa onde a área sob a curva da electroferograma é reduzido a metade, desconsiderando a picos de marcadores. Resultados representativos dos perfis de biblioteca apropriada após tratamento KOH ou KCl são dadas na Figura 2A.</li>
	<li>Calcular a concentração (nM) das bibliotecas como: 
	/(p*650) (c/10 3)] * 10 9 onde c é a concentração da biblioteca em ng / µ l e p é o tamanho do fragmento média na bp, como estimado em 9.1.</li>
	<li>Piscina molares quantidades iguais de até 24 bibliotecas amplificadas com primers de índice diferente para sequenciamento. Adicionar tampão TE para um volume final de 25 µ l e concentração de 10 nM. 
	Nota: Dependendo do número de bibliotecas seja agrupado, é ajustar a quantidade de DNA de cada biblioteca. Se dímeros cartilha foram detectados na etapa 9.1 como um distinto pico de cerca de 130 bp, o volume final da biblioteca piscina pode exceder 25 µ l, porque a etapa de purificação é repetida, conforme descrito no ponto 4.3, usando 0.8 V de grânulos paramagnéticos, e DNA é eluída em 25 µ l TE buf Fer.
	<ol><li>Determinar a concentração de piscina nova biblioteca usando um reagente de quantificação de dsDNA de acordo com o fabricante &#39; s especificações e a média de pico tamanho conforme descrito acima. Prossiga para sequenciamento e análise de dados (capítulo 10 e 11).</li>
	</ol></li></ol> 10. Sequenciamento de <ol><li>realizar 75-base emparelhado-final sequenciamento em bibliotecas em pool 12.</li></ol>
 11. análise de dados <ol><li>Trim todas as leituras para remover sequências de adaptador, filtro para qualidade e leia o comprimento. 
	Nota: Isto pode ser feito usando cutadapt 1.2.1 20 com o comando ' cutadapt -f fastq - jogo-leitura-curingas - silêncio - 15 m - q 10 - um NNNNNNN &#60; arquivo &#62;', onde NNNNNNN é substituído com a sequência de adaptador real e &#60; arquivo &#62; é substituído com o nome do arquivo fastq.</li>
	<li>Remover companheiros de leituras que foram descartados no passo anterior usando scripts personalizados.</li>
	<li>Pares de alinhar o companheiro 1 do restante a um índice que contém a sequência de todos os oligonucleotídeos utilizados para a preparação de biblioteca (por exemplo, usando Bowtie 0.12.8 21 e a linha de comando opções - m1-v2). Elimine todos os pares com alinhamentos bem sucedidos.</li>
	<li>Alinhar pares restantes para o genoma de referência de organismo usando gravata borboleta com a linha de comando opções - v2 -X 10000..--melhor.</li>
	<li>Mapa lê esse intervalo entre a molécula mitocondrial começo e fim, alinhando 1 companheiro de todos os pares desalinhados (usando gravata borboleta com a linha de comando opções - v2).</li>
	<li>Determinar a contagem de fins-de-5´ para todos os alinhamentos de fim único e emparelhados. Mude a posição destes por um base montante para a posição onde estavam os hidrolisado ribonucleotídeos.</li>
	<li>Dados de exportação do arquivo bowtie formato em um formato de arquivo de bedgraph usando scripts personalizados para visualização em comum navegadores do genoma. Normalizar as leituras para cada vertente de leituras por milhões.</li>
	<li>Usando a posição e contagens do arquivo bedgraph, referência a sequência genômica do organismo, para determinar a identidade do incorpditado ribonucleotídeos. 
	Nota: Para o genoma mitocondrial humano lê das regiões 16.200-300 e 5.747-5.847 para cada vertente deve ser excluído desde que estas regiões contêm muitos 5´-extremidades livres, não relacionados à incorporação ribonucleótido pela DNA polimerase γ.</li>
	<li>Dividir o lê total, não incluindo leituras dos onze locais de HincII, com o número médio de leituras por HincII site para obter o número de ribonucleotídeos por intervalo único filamento, (ou seja, o número de ribonucleotídeos por molécula mitocondrial).</li>
</ol>

<ol><li>Traut, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+Concentrations+of+Purines+and+Pyrimidines%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Physiological Concentrations of Purines and Pyrimidines.</a> Mol. Cell. Biochem. 140, 1-22 (1994).</li>
<li>McElhinny, S. A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundant+ribonucleotide+incorporation+into+DNA+by+yeast+replicative+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Abundant ribonucleotide incorporation into DNA by yeast replicative polymerases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 4949-4954 (2010).</li>
<li>Williams, J. S., Lujan, S. A., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+ribonucleotides+incorporated+during+eukaryotic+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Processing ribonucleotides incorporated during eukaryotic DNA replication.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17, 350-363 (2016).</li>
<li>Clausen, A. R., Zhang, S., Burgers, P. M., Lee, M. Y., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonucleotide+incorporation%2C+proofreading+and+bypass+by+human+DNA+polymerase+delta%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Ribonucleotide incorporation, proofreading and bypass by human DNA polymerase delta.</a> DNA Repair. 12, 121-127 (2013).</li>
<li>Potenski, C. J., Klein, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+misincorporation+of+ribonucleotides+into+genomic+DNA+can+be+both+harmful+and+helpful+to+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">How the misincorporation of ribonucleotides into genomic DNA can be both harmful and helpful to cells.</a> Nucleic Acids Res. 42, 10226(2014).</li>
<li>Vengrova, S., Dalgaard, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNase-sensitive+DNA+modification%28s%29+initiates+S.+pombe+mating-type+switching%5BTitle%5D)+AND+%22Gene.+Dev%22%5BJournal%5D)">RNase-sensitive DNA modification(s) initiates S. pombe mating-type switching.</a> Gene. Dev. 18, 794-804 (2004).</li>
<li>Lujan, S. A., Williams, J. S., Clausen, A. R., Clark, A. B., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonucleotides+Are+Signals+for+Mismatch+Repair+of+Leading-Strand+Replication+Errors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Ribonucleotides Are Signals for Mismatch Repair of Leading-Strand Replication Errors.</a> Mol. Cell. 50, 437-443 (2013).</li>
<li>Ghodgaonkar, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonucleotides+Misincorporated+into+DNA+Act+as+Strand-Discrimination+Signals+in+Eukaryotic+Mismatch+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Ribonucleotides Misincorporated into DNA Act as Strand-Discrimination Signals in Eukaryotic Mismatch Repair.</a> Mol. Cell. 50, 323-332 (2013).</li>
<li>DeRose, E. F., Perera, L., Murray, M. S., Kunkel, T. A., London, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+Structure+of+the+Dickerson+DNA+Dodecamer+Containing+a+Single+Ribonucleotide%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Solution Structure of the Dickerson DNA Dodecamer Containing a Single Ribonucleotide.</a> Biochemistry. 51, 2407-2416 (2012).</li>
<li>Li, Y. F., Breaker, R. R. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja990592p">Kinetics of RNA degradation by specific base catalysis of transesterification involving the 2 '-hydroxyl group.</a> J. Am. Chem. Soc. 121, 5364-5372 (1999).</li>
<li>McElhinny, S. A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+instability+due+to+ribonucleotide+incorporation+into+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome instability due to ribonucleotide incorporation into DNA.</a> Nat. Chem. Biol. 6, 774-781 (2010).</li>
<li>Berglund, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+pools+dictate+the+identity+and+frequency+of+ribonucleotide+incorporation+in+mitochondrial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Genet%22%5BJournal%5D)">Nucleotide pools dictate the identity and frequency of ribonucleotide incorporation in mitochondrial DNA.</a> Plos Genet. 13, (2017).</li>
<li>Brown, J. A., Suo, Z. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlocking+the+Sugar+%22Steric+Gate%22+of+DNA+Polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Unlocking the Sugar "Steric Gate" of DNA Polymerases.</a> Biochemistry. 50, 1135-1142 (2011).</li>
<li>Sparks, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNase+H2-Initiated+Ribonucleotide+Excision+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">RNase H2-Initiated Ribonucleotide Excision Repair.</a> Mol. Cell. 47, 980-986 (2012).</li>
<li>Miyabe, I., Kunkel, T. A., Carr, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Major+Roles+of+DNA+Polymerases+Epsilon+and+Delta+at+the+Eukaryotic+Replication+Fork+Are+Evolutionarily+Conserved%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Genet%22%5BJournal%5D)">The Major Roles of DNA Polymerases Epsilon and Delta at the Eukaryotic Replication Fork Are Evolutionarily Conserved.</a> Plos Genet. 7, (2011).</li>
<li>Clausen, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+replication+enzymology+in+vivo+by+genome-wide+mapping+of+ribonucleotide+incorporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 22, 185-191 (2015).</li>
<li>Koh, K. D., Balachander, S., Hesselberth, J. R., Storici, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribose-seq%3A+global+mapping+of+ribonucleotides+embedded+in+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Ribose-seq: global mapping of ribonucleotides embedded in genomic DNA.</a> Nat. Methods. 12, 251(2015).</li>
<li>Keszthelyi, A., Daigaku, Y., Ptasinska, K., Miyabe, I., Carr, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+ribonucleotides+in+genomic+DNA+and+exploring+replication+dynamics+by+polymerase+usage+sequencing+%28Pu-seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Mapping ribonucleotides in genomic DNA and exploring replication dynamics by polymerase usage sequencing (Pu-seq).</a> Nat. Protoc. 10, 1786-1801 (2015).</li>
<li>Ding, J., Taylor, M. S., Jackson, A. P., Reijns, M. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+embedded+ribonucleotides+and+other+noncanonical+nucleotides+using+emRiboSeq+and+EndoSeq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of embedded ribonucleotides and other noncanonical nucleotides using emRiboSeq and EndoSeq.</a> Nat. Protoc. 10, 1433-1444 (2015).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17, 10-12 (2011).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10, (2009).</li>
</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Aqui apresentamos uma técnica para mapear e quantificar ribonucleotídeos em gDNA e DNA mitocondrial, em particular, pela simples introdução de clivagem de DNA em locais específicos de sequência no genoma como um complemento para o protocolo de HydEn-seq estabelecido simultaneamente. Enquanto este estudo centra-se no DNA mitocondrial humano, originalmente, o método de HydEn-seq foi desenvolvido em Saccharomyces cerevisiae, ilustrando a tradução do método para outros organismos12,16.
Para confiáveis resultados obtidos com esta abordagem, devem notar-se alguns passos importantes: (A) desde que adaptadores de sequenciamento ligam para todos os fins-de-5´ disponíveis, é fundamental trabalhar com DNA altamente intacta. DNA deve ser isolado e bibliotecas devem ser feitas de preferência imediatamente após o isolamento do DNA, ou o DNA pode ser armazenado a-20 ° C. Não é recomendável armazenar DNA na geladeira por muito tempo ou para congelar e descongelar repetidamente. (B) para gerar bibliotecas adequadas com este método, é crucial realizar o tratamento de KOH do DNA em um forno de incubação, ao invés de um bloco de aquecimento, garantindo o aquecimento homogêneo da amostra inteira e hidrólise quantitativa. (C) Além disso, é fundamental para controlar a qualidade das bibliotecas antes de pool e sequenciamento. O DNA devem ser quantificadas e analisadas usando um sistema automatizado de eletroforese para assegurar quantidades adequadas de biblioteca de DNA, confirmar tamanhos apropriados do fragmento e verifique dímeros da primeira demão.
Para uma análise de dados significativos, também é importante notar que o valor informativo desse método é dependente de controles apropriados para avaliar fundo contagens e sequência ou vertente de preconceitos. Nós rotineiramente atingir uma eficiência de mapeamento em amostras de KCl de cerca de 70% quando apenas digerindo com a endonuclease específica sequência (Figura 2B, painéis à esquerda). Além disso, é importante confirmar que o tratamento de endonuclease não está afetando o total detecção de ribonucleotídeos incorporados, comparando HincII tratada e não tratada amostras (Figura 3B). Nesses experimentos, usamos HincII apresentar cortes de local específico, embora outras enzimas de restrição de alta-fidelidade também poderia ser usadas.
O protocolo pode ser adaptado estudar outros tipos de lesões do ADN que podem ser processados para 5´-fosfato ou 5´-OH termina. A precisão dos resultados depende da especificidade do processamento e requer controles adequados (por exemplo, o tipo selvagem ou não tratada) para verificação. Além disso, quando adaptar esse método para outros aplicativos ou para uso com outros organismos, deve-se considerar que o método em sua configuração atual requer cerca de 1 µ g de DNA que é processado em uma biblioteca. Desde que o número de extremidades é dependente do número de ribonucleotídeos incorporados, que varia de acordo com o organismo ou mutante, amostras, incluindo um número menor de ribonucleotídeos exigiria mais entrada de DNA para gerar um número suficiente de extremidades na construção de biblioteca subsequentes. Da mesma forma, se as amostras de DNA têm um número muito maior de ribonucleotídeos, também exigiria usando menos entrada de DNA para obter condições óptimas para ligadura, segunda vertente de síntese e amplificação por PCR. Vale ressaltar que a construção de biblioteca, conforme descrito neste protocolo também gerou dados cobrindo o genoma nuclear (conforme exibido na Figura 2D) e somente a análise de dados centrou-se no DNA mitocondrial. Isso ilustra que genomas maiores com frequências ribonucleótido moderadamente baixas também são capturadas por esse método.
Ao considerar este método, certas limitações devem ser consideradas: embora este método deve, em teoria, ser aplicável a virtualmente qualquer organismo, um genoma de referência adequada é necessário para o alinhamento de leituras. Além disso, os resultados obtidos do nosso protocolo representam as leituras de um grande número de células. Padrões de incorporação ribonucleótido específicas de um subconjunto de células não podem ser identificados por esta abordagem. Se ribonucleotídeos são mapeados em genomas maiores com um número muito baixo de ribonucleotídeos, pode ser um desafio para discriminar ribonucleotídeos de nicks aleatórios e controlos adequados, portanto, são necessários.
O método que descrevemos aqui, estende as técnicas disponíveis na vivo como HydEn-Seq16, Ribose-Seq17, Pu-Seq18ou emRiboSeq19. Essas abordagens aproveitar-se da sensibilidade dos ribonucleotídeos incorporado à alcalina ou tratamento de RNase H2, respectivamente, empregando sequenciamento de próxima geração para identificar ribonucleotídeos todo o genoma, que permite o mapeamento e comparação de incorporação de relativa. Por fendendo a sequência do DNA, especificamente, como descrito acima, além de hidrólise alcalina a ribonucleotídeos incorporados, o lê para ribonucleotídeos pode ser normalizado para esses sites de clivagem, que permite não só a identificação e o mapeamento de ribonucleotídeos, mas também sua quantificação para cada molécula de DNA. A aplicação da nossa técnica no contexto das doenças relacionadas com a replicação do DNA, reparo do DNA e TLS poderia fornecer uma compreensão mais profunda do papel de ribonucleotídeos no subjacente mecanismos moleculares e a integridade do genoma em geral.

Em uma célula eucariótica, a concentração de ribonucleotídeos (rNTPs) é muito maior do que a concentração de desoxirribonucleicos (dNTPs)1. As polimerases de DNA discriminam ribonucleotídeos, mas esta discriminação não é perfeita e, como consequência, ribonucleotídeos em vez de deoxyribonucleotides podem ser incorporados em genomas durante a replicação do DNA. Ribonucleotídeos podem ser mais comuns não-canônicos nucleotídeos incorporados ao genoma2. A maioria destes ribonucleotídeos é removida durante o amadurecimento de fragmento de Okazaki por reparo de excisão de iniciados ribonucleótido RNase H2 (RER) ou Topoisomerase 1 (revisto em referência3). Ribonucleotídeos que não podem ser removidos ficar estàvel incorporados no DNA2,4 e podem afetá-lo de maneiras prejudiciais e benéficas (revistas em revista5). Além de ser capaz de agir como sinais positivos, por exemplo tipo de acasalamento alternar no Schizosaccharomyces pombe6 e marcando a sequência de DNA nascente durante a incompatibilidade de reparar (MMR)7,8, ribonucleotídeos afetam o estrutura9 e estabilidade do DNA circundante devido ao grupo hidroxila-2´ de seus ribose10, resultando em replicative stress e genoma instabilidade11. A abundância de ribonucleotídeos no DNA genômico (gDNA) e sua relevância na replicação e mecanismos de reparação, bem como as implicações para a estabilidade do genoma, dá razão para investigar a sua exacta ocorrência e a frequência de uma forma de todo o genoma.
Atividade RNase H2 não foi encontrada na mitocôndria humana e ribonucleotídeos são, portanto, não eficientemente removidos no DNA mitocondrial (mtDNA). Diversas vias estão envolvidas no fornecimento de nucleotídeos à mitocôndria humana e para investigar se distúrbios na piscina nucleotídica mitocondrial causam um número elevado de ribonucleotídeos no DNA mitocondrial humano, desenvolvemos um protocolo para mapear e quantificar Esses ribonucleotídeos no DNA mitocondrial humano isolado de fibroblastos, células HeLa e linhas de célula paciente12.
A maioria das abordagens em vitro (revistas em revista13) para determinar a seletividade dos polymerases DNA contra rNTPs baseiam-se único ribonucleótido inserção ou primeira demão extensão experiências onde rNTPs concorrentes estão incluídos na reação mistura, permitindo a identificação ou quantificação relativa de incorporação ribonucleotídeo em breve modelos de DNA. Abordagens quantitativas em sequências curtas podem não refletir piscinas dNTP e rNTP em concentrações celulares e, portanto, fornecer insights sobre seletividade do polymerase, mas são de importância limitada sobre genomas toda. Tem sido demonstrado que a quantidade relativa de ribonucleotídeos incorporado durante a replicação de um modelo de DNA mais longo, como um plasmídeo, pode ser visualizada em um gel de sequenciamento usando radiolabeled dNTPs e hidrólise de DNA em um meio alcalino14. Além disso, foram analisado gDNA sobre os borrões do Sul após hidrólise alcalina, permitindo que a vertente específica de sondagem e determinação das taxas absolutas de ribonucleotídeo incorporação na vivo15. Essas abordagens permitem uma comparação relativa de frequência de incorporação mas não entregam nenhum insight sobre a posição ou a identidade de ribonucleotídeos os incorporado. Abordagens mais recentes para analisar o conteúdo de ribonucleotídeo no gDNA na vivo, como HydEn-Seq16, Ribose-Seq17, Pu-Seq18ou emRiboSeq19, aproveite dos ribonucleotídeos incorporados sensibilidade à alcalina ou tratamento de RNase H2, respectivamente e empregar o sequenciamento de próxima geração para identificar todo o genoma de ribonucleotídeos. Esses métodos não fornecer a introspecção a frequência absoluta de incorporação dos ribonucleotídeos detectados. Adicionando a etapa de clivagem enzimática específica de sequência para o protocolo de HydEn-seq, o método que aqui descrevemos convenientemente estende a informação adquirida com uma abordagem de sequenciamento, permitindo mapeamento simultâneo e quantificação de incorporado ribonucleotídeos12. Este método é aplicável a praticamente qualquer organismo, dado que extratos de DNA altamente intactos podem ser gerados e um genoma de referência adequada está disponível. O método pode ser adaptado para dosar e determinar a localização de qualquer lesão que não pode ser digerida por uma nuclease e deixa um 5´-fosfato ou um fim de 5´-OH.
Para mapear e dosar ribonucleotídeos no DNA genômico, o método combina clivagem por uma endonuclease específica sequência e hidrólise alcalina, gerando 5´-fosfato termina em locais onde se encontra a sequência de reconhecimento específica para a endonuclease e 5´- OH termina em posições onde se localizavam ribonucleotídeos. Desde que as extremidades livres geradas são posteriormente ligadas com adaptadores e sequenciado usando sequenciamento de próxima geração, é de importância usar DNA altamente intacta e evitar a fragmentação aleatória durante a preparação de extração e biblioteca de DNA. Avaliar estas leituras normalizadas para as leituras dos locais de clivagem de endonuclease permite uma quantificação simultânea e mapeamento de ribonucleotídeos os detectado. 5´-extremidades livres são detectados em experimentos de controle onde a hidrólise alcalina de DNA é substituída pelo tratamento com KCl. Os dados adquiridos fornecem a introspecção do ribonucleotídeo localização e quantidade e permite análises em relação a frequência de conteúdos e incorporação de ribonucleotídeo.

<table><tbody><tr><td>10x T4 Polinucleotídeo Quinase Reação Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B0201S</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 RNA Ligase Reação Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B0216L</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Medicago</td><td>09-9400-100</td><td>dissolver 1 comprimido em H2O para um volume final de 1 L</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33539-1L-GL-R</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalisador</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Centrífuga de 50 mL</td><td>VWR</td><td>525-0610</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5'-Trifosfato (ATP, 10 mM)</td><td>New England Biolabs</td><td>P0756S</td><td>diluído com EB para 2</td></tr><tr><td>mM Agilent DNA 1000 Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1504</td><td></td></tr><tr><td>BSA, Grau de Biologia Molecular (20 mg/mL)</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td>diltue com H2O livre de nuclease a 1 mg/mL</td></tr><tr><td>Buffer EB</td><td>QIAGEN</td><td>19086</td><td>referido como</td></tr><tr><td>contas paramagnéticas EB CleanPCR</td><td>CleanNA</td><td>CPCR-0050</td><td></td></tr><tr><td>Mistura de solução de desoxinucleotídeo (dNTP) (10 mM cada)</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td>diluir com EB para 2 mM</td></tr><tr><td>DMEM, glicose alta, GlutaMAX Suplemento</td><td>Gibco</td><td>61965026</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag 96 Side</td><td>Thermo Fisher</td><td>12331D</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 99,5% grau analítico</td><td>Solveco</td><td>1395</td><td>diluído com água miliQ para solução</td></tr> de <tr><td>ácido etilenodiaminotetracético a 70% (EDTA, 0,5 M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03690-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Gibco</td><td>10500056</td><td></td></tr><tr><td>tampão HEPES pH 8,0 (1 M) estéril BC</td><td>AppliChem</td><td>A6906,0125</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cobalto (III) de Hexammina (CoCl3(NH3)6)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7891-5G</td><td>dissolver-se em H2O livre de nuclease para 10&nbsp; M, filtro estéril. CUIDADO: cancerígeno, sensibilizante e perigoso para o ambiente aquático.</td></tr><tr><td>HincII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0103S</td><td>fornecido com NEBuffer 3.1</td></tr><tr><td>Hybridiser HB-1D</td><td>Techne</td><td>FHB4DD</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>Tampão</td><td></td><td></td> de lise <td>50 mM EDTA, 20 mM HEPES, NaCl 75 mM, Proteinase K (200 &micro; g/mL), 1% SDS</td></tr><tr><td>Micro tubo 1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga 5424R</td><td>Eppendorf</td><td>5404000014</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga MiniStar silverline</td><td>VWR</td><td>521-2844</td><td></td></tr><tr><td>Multiplicar&nbsp; &micro; Tubo StripPro 0.2 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.991.992</td><td></td></tr><tr><td>Água livre de nuclease</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Fenol &ndash; clorofórmio &ndash; álcool isoamílico (25:24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77617-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio (KCl)</td><td>VWR</td><td>26764.232</td><td>dissolver em H2O livre de nuclease para 3&nbsp; M solução, filtro estéril</td></tr><tr><td>Hidróxido de potássio (KOH)</td><td>VWR</td><td>26668.296</td><td>dissolve-se em H2O livre de nuclease para 3&nbsp; Solução M, filtro estéril</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorômetro</td><td>Invitrogen</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Tubos de Ensaio</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Kit de Ensaio</td><td>Invitrogen</td><td>Q32850</td><td>CUIDADO: Contém componentes inflamáveis e tóxicos</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td>CUIDADO: Contém componentes inflamáveis e tóxicos</td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada 4K15</td><td>Centrífugas de laboratório Sigma</td><td>nº 10740</td><td></td></tr><tr><td>Solução SDS, 10%</td><td>Invitrogen</td><td>15553-035</td><td></td></tr><tr><td>Solução tampão de acetato de sódio, pH 5,2, 3 M (NaAc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>VWR</td><td>27810.295</td><td>dissolver em H2O livre de nuclease para 5&nbsp; Solução M, filtro estéril</td></tr><tr><td>T100 Termociclador</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polinucleotídeo quinase (3' fosfatase menos)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0236L</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204L</td><td>fornecido com PEG 8000 (50%)</td></tr><tr><td>T7 DNA Polimerase (não modificada)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0274S</td><td>fornecido com 10x T7 DNA Polimerase Reaction</td></tr><tr><td>Buffer TE Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>12090015</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer F2.0</td><td>Eppendorf</td><td>5387000013</td><td></td></tr></tbody></table>

mapeamento simultâneo e quantificação de ribonucleotídeos no dna mitocondrial humano

Simultaneous Mapping and Quantitation of Ribonucleotides in Human Mitochondrial DNA

Abordagens estabelecidas para estimar o número de ribonucleotídeos presentes em um genoma são limitadas para a quantificação de ribonucleotídeos incorporados usando fragmentos de DNA sintéticos curtos ou plasmídeos como modelos e em seguida a extrapolação dos resultados para toda a genoma. Alternativamente, o número de ribonucleotídeos presentes em um genoma pode ser estimado usando gel alcalina ou os borrões do Sul. Mais recente na vivo abordagens empregam sequenciamento de próxima geração, permitindo o mapeamento de todo o genoma de ribonucleotídeos, fornecendo a posição e a identidade de ribonucleotídeos incorporados. No entanto, não permitem a quantificação do número de ribonucleotídeos que são incorporados em um genoma. Aqui descrevemos como simultaneamente mapear e quantificar o número de ribonucleotídeos incorporadas humana mitochondrial DNA na vivo por sequenciamento de próxima geração. Vamos usar DNA altamente intacta e introduzir quebras da cadeia dupla específico de sequência digerindo-a com uma endonuclease, posteriormente hidrólise de ribonucleotídeos incorporados com alcaloide. As extremidades geradas são ligadas com adaptadores e essas extremidades são sequenciadas em uma máquina de sequenciamento de nova geração. O número absoluto de ribonucleotídeos pode ser calculado como o número de leituras fora do site de reconhecimento por número médio de leituras no local de reconhecimento para a endonuclease específica de sequência. Este protocolo também pode ser utilizado para mapear e dosar cortes grátis no DNA e permite a adaptação mapear outras lesões do ADN que podem ser processados para 5´-OH pontas ou extremidades 5´-fosfato. Além disso, este método pode ser aplicado a qualquer organismo, dado que um genoma de referência adequada está disponível. Este protocolo, portanto, fornece uma ferramenta importante para estudar a replicação do DNA, processamento de 5´ final, danos ao DNA e reparação do DNA.

Ilustrando a metodologia descritos acima, representativos de dados foram gerados, analisando o DNA mitocondrial humano HeLa células12. Figura 2B mostra as leituras resumidas em todos os sites HincII em pesados (HS) e fio de luz (LS) de DNA mitocondrial humano após tratamento de KCl (painéis à esquerda). Aproximadamente 70% de todos os fins-de-5´ detectados localizar para os corte-sites, demonstrando a alta eficiência da digestão HincII. Tratamento de bibliotecas com KOH para hidrolisar o ADN ribonucleotídeos incorporados diminui o número de leituras em sites HincII para cerca de 40% (Figura 2B, painéis certo). Isto é esperado desde que um grande número de fins-de-5´ é gerado aos sítios de incorporação ribonucleotídeo e é indicativo de uma qualidade suficiente da biblioteca. Figura 2 ilustra a localização e a frequência de fins-de-5´ (verde) após leituras e tratamento de KCl geraram por HydEn-seq (magenta) após o tratamento de KOH, detectar tanto 5´-extremidades livres e extremidades geradas no ribonucleotídeos por hidrólise alcalina. 5´-extremidades livres e ribonucleotídeos localizando o SH de DNA mitocondrial humano são mostrados no painel da esquerda e aqueles localizando para o LS são mostradas no painel direito. Os números relativos de leituras crus em ribonucleotídeos (Figura 2D, painel superior) ou sites de HincII (painel inferior) em HS e LS do mtDNA mostram, respectivamente, uma cobertura mais forte 14-fold ou 31-fold do LS em relação a HS, enquanto um viés semelhante não foi observado para DNA nuclear. Este viés de vertente podem ser explicada pela diferença na composição de base das duas vertentes distinta e ilustra a importância da normalização para leituras em sites HincII.
Normalizando a leitura conta para HincII dá uma medida quantitativa do número de ribonucleotídeos por genoma mitocondrial (Figura 3A). Conforme ilustrado na Figura 3B, as leituras após tratamento de KOH para cada ribonucleótido normalizado para a composição de sequência de cada vertente mostram uma relação diferente de 1, indicando uma distribuição não aleatória de leituras sugerindo um ribonucleótido distinto padrão e uma qualidade elevada de biblioteca. Essa proporção é afetada pela digestão anterior com HincII, verificar a especificidade de clivagem da enzima. Normalizar as leituras aos sítios de ribonucleotídeos incorporados aos sítios de clivagem de HincII, bem como o conteúdo de nucleotídeos do genoma, gera uma medida quantitativa de quantos de cada ribonucleótido são incorporados por 1.000 bases complementares ( Figura 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56551/56551fig1.jpg"> 
Figura 1: esquemático para processamento de DNA e biblioteca preparação. (1) DNA genômico todo é clivado pela HincII para normalização na quantificação subsequente de ribonucleotídeos, gerando extremidades sem corte em HincII locais (seta preta). (2) o DNA é tratado com KOH para hidrolisar em sites ribonucleotídeo, levando a 2´, 3´-cíclico fosfato (Pentágono vermelho) em fins-de-3´ e 5´-OH livre termina. (3) 5´-OH extremidades são fosforiladas por T4 polinucleotídicas quinase 3´-fosfatase-subtração. (4) todos os fins-de-5´ um grupo de fosfato são ligados para do oligonucleotide ARC140 pela ligase do RNA do T4. (5) a segunda vertente é sintetizado usando T7 DNA polimerase e os oligonucleotides ARC76-77 contendo sequências de6 N aleatórias. (6) a biblioteca é amplificada por um Polymerase de ADN de alta-fidelidade usando ARC49 e um do ARC78 de ARC107 primeiras demão de índice que contém um único código de barras para multiplexação. (7) 5´-extremidades estão localizados por sequenciamento emparelhado-final. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56551/56551fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56551/56551fig2.jpg"> 
Figura 2: validação do método. (A) electropherograms representante gerado usando um sistema automatizado de electroforese para determinar a qualidade do gerado bibliotecas tratadas com KOH ou resumidos KCl. (B) sinal em locais HincII pesado (HS) e luz strand (LS) DNA mitocondrial humano depois de KCl (painéis esquerdos) ou tratamento de KOH (painéis de certo). (C) Circos figura de 5´-extremidades livres (verde) e de HydEn-Seq (5´-extremidades livres e ribonucleotídeos, magenta) no HS (painel esquerdo) e o DNA mitocondrial humano LS (painel direito). Picos são normalizados por milhões leituras e o pico máximo é ajustado para o máximo número de leituras da biblioteca HydEn-seq. (D) resumidos cru lê ribonucleotídeos (painel superior) e sites de HincII (painel inferior) em pesados (H) e fio de luz (L) no DNA mitocondrial humano (Mito.) ou no sentido inverso (RV) ou para a frente (FW) costa, no nuclear (Nuc). DNA. Figuras B, C e D são adaptadas de referência12. Barras de erro representam o erro padrão da média. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56551/56551fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56551/56551fig3.jpg"> 
Figura 3: resultados do representante. (A), o relativo número de ribonucleotídeos normalizada para leituras em HincII locais para bibliotecas KOH tratado no fio de luz (L) ou pesados (H). (B) relação de identidade ribonucleótido para composição de genoma de DNA mitocondrial para KOH tratados (KOH) e HincII clivado com KOH Tratado (HincII + KOH) bibliotecas no pesado (H) ou luz (L) fio de DNA mitocondrial. (C) frequência ribonucleótido normalizada para 1.000 bases complementares por HincII e KOH tratados bibliotecas no pesado (H) ou fio de luz (L) de DNA mitocondrial. Figuras são adaptadas de referência12. Barras de erro representam o erro padrão da média. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56551/56551fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nome</td>
			<td colspan="4">Sequência de</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC49</td>
			<td colspan="4">AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC76</td>
			<td colspan="4">GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNN * N * N</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC77</td>
			<td colspan="4">AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTC * A * C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC78</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC84</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC85</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC86</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC87</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGA</td></tr></tbody></table>TCT
		
		<tr>
			<td>ARC88</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC89</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC90</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC91</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC93</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC94</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC95</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC96</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGTTGACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC97</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACGGAACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC98</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCTGACATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC99</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGGACGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC100</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGCGGACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC101</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTTTCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC102</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGGCCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC103</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCCGAAACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC104</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACGTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC105</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCCACTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC106</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATATCAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC107</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAAGGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC140</td>
			<td colspan="4">/ 5AmMC6/ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
	

Tabela 1: Oligonucleotides. Estão listados os oligonucleotides usados para HydEn-Seq. Negrito indica a indexação. * indica um vínculo phosphorothioate. ARC140 contém um grupo amino-5´ em vez de um grupo de 5´-OH, em combinação com um vinculador de C6. Esta alteração reduz a formação de concatemers ARC140 durante a ligadura.

Aqui nós descrevemos um método passível de dosar simultaneamente e ribonucleotídeos mapa de todo o genoma em DNA altamente intacta na resolução de single-nucleotide, combinando a clivagem enzimática do DNA genômico com sua hidrólise alcalina e subsequente 5´-final sequenciamento.

Mapeamento simultâneo e quantificação de ribonucleotídeos no DNA mitocondrial humano

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using ...

O objetivo geral deste experimento é mapear a localização dos ribonucleotídeos incorporados no nível de resolução de nucleotídeo único e quantificar o número de ribonucleotídeos presentes no DNA mitocondrial humano. Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre integridade do DNA, mecanismos de replicação do DNA, mecanismos de reparo do DNA e como defeitos em qualquer um desses mecanismos causam doenças. A principal vantagem deste método é que tanto a localização quanto o número de ribonucleotídeos incorporados no DNA mitocondrial podem ser determinados em um único experimento.Embora este método possa fornecer informações sobre o conteúdo de ribonucleotídeos no DNA mitocondrial humano, ele também pode ser aplicado para estudar o conteúdo de DNA nuclear e ribonucleotídeos em genomas de sequência de outros organismos modelo. O DNA genômico previamente isolado de células HeLa e descrito nas seções dois e três do protocolo de texto é usado neste experimento. Para digerir o DNA, misture cuidadosamente o seguinte em um tubo de microcentrífuga.Um micrograma de DNA, cinco microlitros de tampão 10X 3,1, um microlitro de HincII e água livre de nuclease até um volume final de 50 microlitros. Incube a 37 graus Celsius por 30 minutos. Quando a digestão estiver concluída, adicione 1,8 volumes de esferas paramagnéticas a cada amostra, cuidadosamente misturadas por pipetagem, e incube em temperatura ambiente por 10 minutos.Coloque os tubos em um rack magnético por cinco minutos para pellet as contas e, em seguida, remova e descarte o sobrenadante. Lave o pellet com 150 microlitros de etanol a 70% por cerca de 30 segundos, depois remova e descarte o sobrenadante. Repita a lavagem com 200 microlitros de etanol a 70% por mais 30 segundos.Seque as amostras à temperatura ambiente durante cerca de 15 a 20 minutos. Em seguida, remova os tubos do rack magnético. Eluir cada pellet em 45 microlitros de tampão de eluição, misturado pipetando cuidadosamente e incubar por cinco minutos.Pulverize as esferas no rack magnético e transfira 45 microlitros de cada amostra de DNA para um novo tubo. Para cada 45 microlitros de DNA isolado ou purificado, adicione cinco microlitros de hidróxido de potássio de três molares ou cinco microlitros de cloreto de potássio de três molares, criando um volume total de 50 microlitros. As oito reações estão resumidas nesta tabela.Incube em um forno de hibridização a 55 graus Celsius por duas horas e, em seguida, incube as amostras no gelo por cinco minutos. Precipite o DNA adicionando 10 microlitros de acetato de sódio de três molares a pH 5,2 e 125 microlitros de frio, 100% de etanol e incube no gelo por cinco minutos. Pulverizar o ADN centrifugando a 21 000 vezes G a quatro graus Celsius durante cinco minutos.Descarte o sobrenadante e lave cada pellet de DNA com 250 microlitros de etanol a frio, 70%, centrifugue novamente e descarte o sobrenadante. Deixe o pellet secar no tubo aberto por cerca de cinco a 10 minutos, até que qualquer fluido visível tenha evaporado. Por fim, adicione 20 microlitros de tampão de eluição e deixe o pellet de DNA se dissolver em temperatura ambiente por 30 minutos.Comece este procedimento preparando a mistura de reação para cada amostra como uma mistura principal. Para cada amostra, adicione 2,5 microlitros de tampão de reação de polinucleotídeo quinase 10x T4, 2,5 microlitros de ATP e um microlitro de três fosfatase primária-menos polinucleotídeo quinase T4. Transfira 19 microlitros de cada amostra de DNA para um novo tubo de 200 microlitros e desnature a 85 graus Celsius em um termociclador por três minutos.Em seguida, resfrie as amostras de DNA no gelo e adicione seis microlitros da mistura de reação preparada a cada amostra. Incube as misturas de reação a 37 graus Celsius por 30 minutos, seguidas de 65 graus Celsius por 20 minutos para interromper a reação. Purifique o DNA usando esferas paramagnéticas, como demonstrado anteriormente, mas elua com 14 microlitros de tampão de eluição.Preparar previamente a mistura de reacção como mistura principal, contendo os seguintes elementos para cada amostra. Cinco microlitros de tampão de reação de RNA ligase 10x T4, cinco microlitros de cloreto de hexamminecobalt (III), 0,5 microlitros de oligonucleotídeo ARC140, 0,5 microlitros de ATP e 25 microlitros de 50% PEG 8000. Misture bem pipetando.Transfira 13 microlitros de cada DNA purificado para um novo tubo de 200 microlitros e desnature a 85 graus Celsius em um termociclador por três minutos. Resfrie o DNA no gelo e, em seguida, adicione 36 microlitros de mistura de reação a cada amostra, misture por pipetagem e gire brevemente. Adicione um microlitro de RNA ligase T4 a cada reação, misture por pipetagem e diminua brevemente.Incubar as amostras à temperatura ambiente no escuro durante a noite. Quando a ligação de DNA de fita simples estiver completa, purifique o DNA conforme demonstrado anteriormente, mas use 0,8 volumes de grânulos paramagnéticos e peletize os grânulos por 10 minutos. Eluir em 20 microlitros de tampão de eluição e transferir 20 microlitros de cada amostra de DNA para um novo tubo de 200 microlitros.Repita a purificação com 0,8 volumes de grânulos paramagnéticos e elua em 14 microlitros de tampão de eluição. Para cada amostra, prepare a mistura de reação como uma mistura mestre consistindo em dois microlitros de tampão de reação de DNA polimerase 10x T7, dois microlitros de ARC76/77, dois microlitros de dNTPs e 0,8 microlitros de BSA. Transfira 12,8 microlitros de DNA purificado para um novo tubo de 200 microlitros e desnature a 85 graus Celsius em um termociclador por três minutos.Resfrie o DNA no gelo e, em seguida, adicione 6,8 microlitros de mistura de reação a cada amostra, misture por pipetagem, gire brevemente e incube em temperatura ambiente por cinco minutos. Adicione 0,4 microlitros de DNA polimerase T7 a cada reação e incube em temperatura ambiente por cinco minutos. Depois de purificar o DNA usando esferas paramagnéticas, eluir em 11 microlitros de tampão de eluição.Para iniciar a amplificação por PCR, prepare a mistura de reação separadamente para cada amostra em um novo tubo de 200 microlitros composto por 7,5 microlitros de ARC49, 7,5 microlitros de primer de índice exclusivo e 25 microlitros de mistura pronta para partida a quente 2X. Adicione 10 microlitros de amostra de DNA a cada reação. Amplifique a biblioteca usando as seguintes condições.Desnature a 95 graus Celsius por 45 segundos, seguido por 18 ciclos de 98 graus Celsius por 15 segundos, 65 graus Celsius por 30 segundos, 72 graus Celsius por 30 segundos e terminando com um alongamento final a 72 graus Celsius por dois minutos. Mantenha as amostras a quatro graus Celsius após a amplificação. Purifique as bibliotecas conforme descrito no protocolo de texto e elua em 20 microlitros de tampão TE.Determine a qualidade e o tamanho médio do fragmento de cada biblioteca usando um sistema de eletroforese digital. São mostrados resultados representativos de perfis de biblioteca adequados após o tratamento com hidróxido de potássio ou cloreto de potássio. Depois de calcular a concentração de cada biblioteca, puxe quantidades molares iguais de até 24 bibliotecas amplificadas com diferentes primers de índice para sequenciamento, conforme descrito nas seções nove e 10 do protocolo de texto.Adicione tampão TE a um volume final de 25 microlitros e concentração de 10 nanomolares. Após o sequenciamento, realize a análise de dados bioinformáticos conforme especificado na seção 11 do protocolo de texto. Esses gráficos mostram as leituras resumidas em todos os locais de HincII no DNA mitocondrial humano de fita leve e fita pesada após o tratamento com cloreto de potássio.Cerca de 70% de todos detectaram cinco extremidades primárias localizadas nos locais de corte, demonstrando a alta eficiência da digestão do HincII. O tratamento de bibliotecas com hidróxido de potássio para hidrolisar o DNA em ribonucleotídeos incorporados diminui o número de leituras em HincII para cerca de 40% O número relativo de leituras no DNA mitocondrial e nuclear revela diferenças na cobertura e ilustra a importância da normalização apropriada para remover o viés da fita. A normalização das contagens de leitura para HincII fornece uma medida quantitativa do número de ribonucleotídeos por genoma mitocondrial na fita pesada ou leve.As leituras após o tratamento com hidróxido de potássio para cada ribonucleotídeo, normalizadas para a composição da sequência de cada fita, mostram uma proporção diferente de um, indicando uma distribuição não aleatória de leituras e sugerindo um padrão distinto de ribonucleotídeos e uma alta qualidade de biblioteca. A normalização das leituras nos locais de ribonucleotídeos incorporados para aqueles em locais HincII, bem como para o conteúdo de nucleotídeos do genoma, gera uma medida quantitativa de quantos de cada ribonucleotídeo são incorporados por 1.000 bases complementares. Uma vez dominado, este protocolo pode ser feito em dois dias se for executado corretamente.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter o DNA altamente intacto e evitar a introdução de quebras de fita dupla durante a preparação da biblioteca. Após este procedimento, outros métodos semelhantes podem ser realizados para confirmar os dados de quantificação de ribonucleotídeos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar bibliotecas para o mapeamento e quantificação de ribonucleotídeos e DNA usando sequenciamento de próxima geração.Não se esqueça de que trabalhar com produtos químicos como hidróxido de potássio pode ser perigoso, e precauções como usar proteção para os olhos e luvas devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

simultaneous-mapping-quantitation-ribonucleotides-human-mitochondrial

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Devido à natureza transitória do pré-mRNA, pode ser difícil isolar e...

Um método rápido de alta capacidade para Ribonucleoproteínas Mapping (RNPs) no pré-mRNA Humanos

Aqui, apresentamos um protocolo para permitir que a quantificação exata de metilação de DNA (mtDNA) mitocondrial. Neste protocolo, descrevemos uma digestão enzimática de DNA com BamHI juntamente com um pipeline de análise de bioinformatic que pode ser usado para evitar a superestimação dos níveis de metilação do DNA mitocondrial causada pela estrutura secundária do DNA mitocondrial.

Metodologia para detecção precisa de metilação do DNA mitocondrial

O protocolo descreve rotulagem específica de nucleóides mitocondriais com uma mancha de gel de DNA comercialmente disponível, aquisição de série de lapso de tempo de células rotuladas ao vivo por microscopia de iluminação estruturada de super resolução (SR-SIM) e rastreamento automático do movimento nucleóide.

Rotulagem específica de nucleóides mitocondriais para microscopia estruturada de iluminação com lapso de tempo

Nós apresentamos uma estratégia RT-PCR-baseada circular combinando o RT-PCR circular, o RT-PCR quantitativo, o RNA 5 ' polyphosphatase-Treatment, e o borrão do Norte. Este protocolo inclui um passo de normalização para minimizar a influência do trifosfato 5 ' instável, e é adequado para discriminar e mapear as transcrições primárias e processadas estavelmente acumuladas em mitocódrias de milho.

Discriminação e mapeamento das transcrições primárias e processadas em Mitocídrias de milho usando uma estratégia circular RT-PCR-based

Os ensaios de pirosequenciamento permitem a genotipagem robusta e rápida de polimorfismos de nucleotídeo único do DNA mitocondrial em células ou tecidos heteroplasmáticos.

Genotipagem de Polimorfismos de Nucleotídeo Único no Genoma Mitocondrial por Pirosequenciamento

Um procedimento para estudar a dinâmica do metabolismo do DNA mitocondrial (mtDNA) em células usando um formato de placa multi-poço e imagens automatizadas de imunofluorescência para detectar e quantificar a síntese e distribuição do mtDNA é descrito. Isso pode ser usado para investigar os efeitos de vários inibidores, estresses celulares e silenciamento gênico no metabolismo do mtDNA.

Quantificação baseada em imagens de alto rendimento da síntese e distribuição do DNA mitocondrial

Diferenciação dirigida de hESCs em células específicas tem gerado muito interesse na medicina regenerativa. Nós fornecemos uma concisa, protocolo passo a passo para determinar...

Mapeamento de destino de células estaminais embrionárias humanas por formação de teratomas

Quantificação de DNA dupla fita-breaks, com base em γH2AX focos tem se tornado uma ferramenta valiosa, especialmente na biologia da radiação, para a avaliação da radiossensibilidade de tecidos e os efeitos de compostos de radiação modificando. Aqui mostramos o uso de um teste de imunofluorescência para quantificação de γH2AX focos em amostras de tecido.

Quantificação de γH2AX Focos em amostras de tecido

Descrita é um processo de rotulagem em duas etapas usando β-glicosiltransferase (β-GT) para transferir uma azida de glucose para 5 HMC, seguido por química do clique para transferir de um ligante de biotina para o enriquecimento fácil e densidade independente. Este método de marcação eficiente e específico permite o enriquecimento de 5 HMC com fundo extremamente baixo e de alto rendimento de mapeamento epigenômico via sequenciamento de última geração.

Captura selectivo de 5-hydroxymethylcytosine a partir de DNA genómico

Beacons bimoleculares proporcional (RBMBs) pode ser usado para imagens simples transcrições de RNA projetados em células vivas. Aqui, nós descrevemos a preparação e purificação de RBMBs, entrega de RBMBs em células de formação de microporos e de imagem fluorescente de transcritos de ARN em tempo real.

Imagens em tempo real de uma única Engineered RNA transcritos em células vivas usando raciométrica Bimolecular Beacons

Aprenda a mapear e quantificar ribonucleotídeos no DNA mitocondrial humano com resolução de nucleotídeo único. Este método combina clivagem enzimática com hidrólise alcalina e sequenciamento.

Mapeamento simultâneo e quantificação de ribonucleotídeos no DNA mitocondrial humano

Explorar mais vídeos