Mapeamento simultâneo e quantificação de ribonucleotídeos no DNA mitocondrial humano

O objetivo geral deste experimento é mapear a localização dos ribonucleotídeos incorporados no nível de resolução de nucleotídeo único e quantificar o número de ribonucleotídeos presentes no DNA mitocondrial humano. Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre integridade do DNA, mecanismos de replicação do DNA, mecanismos de reparo do DNA e como defeitos em qualquer um desses mecanismos causam doenças. A principal vantagem deste método é que tanto a localização quanto o número de ribonucleotídeos incorporados no DNA mitocondrial podem ser determinados em um único experimento.

Embora este método possa fornecer informações sobre o conteúdo de ribonucleotídeos no DNA mitocondrial humano, ele também pode ser aplicado para estudar o conteúdo de DNA nuclear e ribonucleotídeos em genomas de sequência de outros organismos modelo. O DNA genômico previamente isolado de células HeLa e descrito nas seções dois e três do protocolo de texto é usado neste experimento. Para digerir o DNA, misture cuidadosamente o seguinte em um tubo de microcentrífuga.

Um micrograma de DNA, cinco microlitros de tampão 10X 3,1, um microlitro de HincII e água livre de nuclease até um volume final de 50 microlitros. Incube a 37 graus Celsius por 30 minutos. Quando a digestão estiver concluída, adicione 1,8 volumes de esferas paramagnéticas a cada amostra, cuidadosamente misturadas por pipetagem, e incube em temperatura ambiente por 10 minutos.

Coloque os tubos em um rack magnético por cinco minutos para pellet as contas e, em seguida, remova e descarte o sobrenadante. Lave o pellet com 150 microlitros de etanol a 70% por cerca de 30 segundos, depois remova e descarte o sobrenadante. Repita a lavagem com 200 microlitros de etanol a 70% por mais 30 segundos.

Seque as amostras à temperatura ambiente durante cerca de 15 a 20 minutos. Em seguida, remova os tubos do rack magnético. Eluir cada pellet em 45 microlitros de tampão de eluição, misturado pipetando cuidadosamente e incubar por cinco minutos.

Pulverize as esferas no rack magnético e transfira 45 microlitros de cada amostra de DNA para um novo tubo. Para cada 45 microlitros de DNA isolado ou purificado, adicione cinco microlitros de hidróxido de potássio de três molares ou cinco microlitros de cloreto de potássio de três molares, criando um volume total de 50 microlitros. As oito reações estão resumidas nesta tabela.

Incube em um forno de hibridização a 55 graus Celsius por duas horas e, em seguida, incube as amostras no gelo por cinco minutos. Precipite o DNA adicionando 10 microlitros de acetato de sódio de três molares a pH 5,2 e 125 microlitros de frio, 100% de etanol e incube no gelo por cinco minutos. Pulverizar o ADN centrifugando a 21 000 vezes G a quatro graus Celsius durante cinco minutos.

Descarte o sobrenadante e lave cada pellet de DNA com 250 microlitros de etanol a frio, 70%, centrifugue novamente e descarte o sobrenadante. Deixe o pellet secar no tubo aberto por cerca de cinco a 10 minutos, até que qualquer fluido visível tenha evaporado. Por fim, adicione 20 microlitros de tampão de eluição e deixe o pellet de DNA se dissolver em temperatura ambiente por 30 minutos.

Comece este procedimento preparando a mistura de reação para cada amostra como uma mistura principal. Para cada amostra, adicione 2,5 microlitros de tampão de reação de polinucleotídeo quinase 10x T4, 2,5 microlitros de ATP e um microlitro de três fosfatase primária-menos polinucleotídeo quinase T4. Transfira 19 microlitros de cada amostra de DNA para um novo tubo de 200 microlitros e desnature a 85 graus Celsius em um termociclador por três minutos.

Em seguida, resfrie as amostras de DNA no gelo e adicione seis microlitros da mistura de reação preparada a cada amostra. Incube as misturas de reação a 37 graus Celsius por 30 minutos, seguidas de 65 graus Celsius por 20 minutos para interromper a reação. Purifique o DNA usando esferas paramagnéticas, como demonstrado anteriormente, mas elua com 14 microlitros de tampão de eluição.

Preparar previamente a mistura de reacção como mistura principal, contendo os seguintes elementos para cada amostra. Cinco microlitros de tampão de reação de RNA ligase 10x T4, cinco microlitros de cloreto de hexamminecobalt (III), 0,5 microlitros de oligonucleotídeo ARC140, 0,5 microlitros de ATP e 25 microlitros de 50% PEG 8000. Misture bem pipetando.

Transfira 13 microlitros de cada DNA purificado para um novo tubo de 200 microlitros e desnature a 85 graus Celsius em um termociclador por três minutos. Resfrie o DNA no gelo e, em seguida, adicione 36 microlitros de mistura de reação a cada amostra, misture por pipetagem e gire brevemente. Adicione um microlitro de RNA ligase T4 a cada reação, misture por pipetagem e diminua brevemente.

Incubar as amostras à temperatura ambiente no escuro durante a noite. Quando a ligação de DNA de fita simples estiver completa, purifique o DNA conforme demonstrado anteriormente, mas use 0,8 volumes de grânulos paramagnéticos e peletize os grânulos por 10 minutos. Eluir em 20 microlitros de tampão de eluição e transferir 20 microlitros de cada amostra de DNA para um novo tubo de 200 microlitros.

Repita a purificação com 0,8 volumes de grânulos paramagnéticos e elua em 14 microlitros de tampão de eluição. Para cada amostra, prepare a mistura de reação como uma mistura mestre consistindo em dois microlitros de tampão de reação de DNA polimerase 10x T7, dois microlitros de ARC76/77, dois microlitros de dNTPs e 0,8 microlitros de BSA. Transfira 12,8 microlitros de DNA purificado para um novo tubo de 200 microlitros e desnature a 85 graus Celsius em um termociclador por três minutos.

Resfrie o DNA no gelo e, em seguida, adicione 6,8 microlitros de mistura de reação a cada amostra, misture por pipetagem, gire brevemente e incube em temperatura ambiente por cinco minutos. Adicione 0,4 microlitros de DNA polimerase T7 a cada reação e incube em temperatura ambiente por cinco minutos. Depois de purificar o DNA usando esferas paramagnéticas, eluir em 11 microlitros de tampão de eluição.

Para iniciar a amplificação por PCR, prepare a mistura de reação separadamente para cada amostra em um novo tubo de 200 microlitros composto por 7,5 microlitros de ARC49, 7,5 microlitros de primer de índice exclusivo e 25 microlitros de mistura pronta para partida a quente 2X. Adicione 10 microlitros de amostra de DNA a cada reação. Amplifique a biblioteca usando as seguintes condições.

Desnature a 95 graus Celsius por 45 segundos, seguido por 18 ciclos de 98 graus Celsius por 15 segundos, 65 graus Celsius por 30 segundos, 72 graus Celsius por 30 segundos e terminando com um alongamento final a 72 graus Celsius por dois minutos. Mantenha as amostras a quatro graus Celsius após a amplificação. Purifique as bibliotecas conforme descrito no protocolo de texto e elua em 20 microlitros de tampão TE.

Determine a qualidade e o tamanho médio do fragmento de cada biblioteca usando um sistema de eletroforese digital. São mostrados resultados representativos de perfis de biblioteca adequados após o tratamento com hidróxido de potássio ou cloreto de potássio. Depois de calcular a concentração de cada biblioteca, puxe quantidades molares iguais de até 24 bibliotecas amplificadas com diferentes primers de índice para sequenciamento, conforme descrito nas seções nove e 10 do protocolo de texto.

Adicione tampão TE a um volume final de 25 microlitros e concentração de 10 nanomolares. Após o sequenciamento, realize a análise de dados bioinformáticos conforme especificado na seção 11 do protocolo de texto. Esses gráficos mostram as leituras resumidas em todos os locais de HincII no DNA mitocondrial humano de fita leve e fita pesada após o tratamento com cloreto de potássio.

Cerca de 70% de todos detectaram cinco extremidades primárias localizadas nos locais de corte, demonstrando a alta eficiência da digestão do HincII. O tratamento de bibliotecas com hidróxido de potássio para hidrolisar o DNA em ribonucleotídeos incorporados diminui o número de leituras em HincII para cerca de 40% O número relativo de leituras no DNA mitocondrial e nuclear revela diferenças na cobertura e ilustra a importância da normalização apropriada para remover o viés da fita. A normalização das contagens de leitura para HincII fornece uma medida quantitativa do número de ribonucleotídeos por genoma mitocondrial na fita pesada ou leve.

As leituras após o tratamento com hidróxido de potássio para cada ribonucleotídeo, normalizadas para a composição da sequência de cada fita, mostram uma proporção diferente de um, indicando uma distribuição não aleatória de leituras e sugerindo um padrão distinto de ribonucleotídeos e uma alta qualidade de biblioteca. A normalização das leituras nos locais de ribonucleotídeos incorporados para aqueles em locais HincII, bem como para o conteúdo de nucleotídeos do genoma, gera uma medida quantitativa de quantos de cada ribonucleotídeo são incorporados por 1.000 bases complementares. Uma vez dominado, este protocolo pode ser feito em dois dias se for executado corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter o DNA altamente intacto e evitar a introdução de quebras de fita dupla durante a preparação da biblioteca. Após este procedimento, outros métodos semelhantes podem ser realizados para confirmar os dados de quantificação de ribonucleotídeos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar bibliotecas para o mapeamento e quantificação de ribonucleotídeos e DNA usando sequenciamento de próxima geração.

Não se esqueça de que trabalhar com produtos químicos como hidróxido de potássio pode ser perigoso, e precauções como usar proteção para os olhos e luvas devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.