Name: Visualização do axônio Thalamocortical ramificação e sinapse formação em Organotypic Cocultures (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: Aprenda a visualizar ramificação axonal e formação sináptica em coculturas organotípicas de tálamo e córtex cerebral. Este método permite observar dinamicamente o crescimento axonal e o desenvolvimento sináptico em células vivas.

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Agradecemos também o Gabriel Hand para leitura crítica.

Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes estabelecidas pelos comités de bem-estar animal da Universidade de Osaka e da sociedade de neurociência do Japão.
1. Organotypic cocultures do tálamo e córtex cerebral
Nota: Para o procedimento detalhado, consulte o original publicações7,8,13. Todos os procedimentos devem ser executados sob condições estéreis. Ratos Sprague-Dawley (SD) são utilizados para culturas neuronal.
<ol><li>
Preparação dos reagentes Nota: Volumes dos seguintes reagentes são para o cérebro de um rato.<ol>
<li>
Prepare-se 10 x modificado N2 suplemento 13: insulina (50 μg/mL), progesterona (200 nM), hidrocortisona (200 nM), Selenito de sódio (300 nM), transferrina (1 mg/mL), putrescina (1 mM), glicose (60 mg/mL)</li>
		<li>
Prepare soro contendo meio de cultura (10 mL): 85% DMEM/F12, suplemento de N2 10 x modificado 10%, 5% de soro fetal bovino (FBS)</li>
		<li>
Preparar meio de cultura livre de soro (20 mL): 90% DMEM/F12, 10% x 10 modificado N2 suplemento</li>
		<li>Prepare a solução de colágeno de cauda de rato (0,5 mL). Em breve, tomar fibras concursos de um rabo de rato em condições estéreis e incubar durante uma noite em solução de ácido acético. Após a centrifugação, recolher o sobrenadante (alguns mg/mL) e armazenar em um refrigerador13.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação de pratos de cultura
	<ol>
<li>Coloque uma inserção da membrana em uma placa de Petri de 35mm.</li>
		<li>Adicionar 40-50 μL de solução de colágeno de cauda de rato para a membrana e espalhe a solução de colágeno em torno do centro.</li>
		<li>Ar seco a membrana completamente em uma bancada limpa.</li>
		<li>Colocar 1,5-2 mL do meio de cultura contendo soro para o prato, para que a membrana é encharcada com o meio.</li>
		<li>Coloque o prato de cultura numa incubadora (37 ° C, ar umidificado 95% e 5% CO2) antes do chapeamento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação de fatias corticais
	<ol>
<li>Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos com etanol a 70% durante 10 min ou mais.</li>
		<li>Dissecar o cérebro todo rapidamente de um dia pós-natal (P) 2 rato sob anestesia gelada (imergido em lascas de gelo por alguns minutos).</li>
		<li>Lugar do cérebro em uma placa de Petri contendo 100 mL de frio Hanks de 100mm equilibrada solução salina.</li>
		<li>Remover o problema de pia do cérebro com pinça fina e cortar fatias corticais (300-400 μm de espessura) do córtex visual e somatossensorial com tesoura microcirúrgica (para detalhes, veja a Figura 1). Nota: Estima-se aproximadamente a espessura das fatias corticais pela escala de grades sob um microscópio binocular. Nota: Alternativamente, fatias corticais podem ser feitas com um vibratome sob condições estéreis.</li>
		<li>Transferi algumas fatias corticais para a inserção de membrana com uma pipeta descartável de plástico.</li>
		<li>Ajustar as posições das fatias perto do centro da inserção da cultura, com uma pipeta Pasteur fogo-polido (para obter detalhes, consulte8,13) e remover o excesso de meio da inserção. Nota: Ajuste o nível do meio ligeiramente abaixo da superfície das fatias para que as fatias podem receber uma oferta suficiente do gás e do médio. Isto é crucial para a viabilidade celular.</li>
		<li>Manter as fatias em meio de cultura contendo soro a 37 ° C, em um ambiente de umidificado 95% ar e 5% de CO2e cultura sozinha por um dia antes de um bloco talâmica é levado e colocado ao lado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação dos blocos talâmicos
	<ol>
<li>Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos com etanol a 70% durante 10 min ou mais.</li>
		<li>Anestesia um rato grávido (embrionário dia 15) por injeção intraperitoneal de pentobarbital (50 mg/kg) contendo anestésico.</li>
		<li>Dissecar cada embrião partir os cornos uterinos e colocar os embriões em uma placa de Petri contendo 100 mL de solução salina balanceada de Hanks frio de 100mm.</li>
		<li>Sob um microscópio binocular, remover o cérebro de cada embrião e cortar blocos talâmicos que contêm principalmente o núcleo geniculado lateral e complexo (aproximadamente 0,5 mm x 3) ventrobasal7 usando tesoura microcirúrgica (ver Figura 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cultura e manter organotypic cocultures
	<ol>
<li>Usando uma pipeta Pasteur, coloque o bloco talâmica junto a superfície ventricular da fatia cortical que foi colocada no filtro de membrana.</li>
		<li>Manter os cocultures em meio de cultura contendo soro a 37 ° C, em um ambiente de ar umidificado 95% e 5% de CO2.</li>
		<li>Troca metade do médio com meio de cultura livre de soro depois de dois dias em cultura. Depois disso, troca o meio de cada 2-3 dias. Nota: O nível de médio porte deve ser verificado após o câmbio médio, como é importante para a sobrevivência da pilha.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. eletroporação
Todos os procedimentos devem ser executados sob condições estéreis.
Nota: Execute electroporation um dia após o preparo dos blocos talâmicos para evitar o desprendimento dos blocos.
<ol><li>
Plasmídeos
	<ol>
<li>Fazer uma mistura de plasmídeos da seguinte forma: pCAGGS-DsRed 2 μg/μL; pCAG-SYP-EGFP 3,5 μg/μL. Nota: Purificar os ambos Plasmideos usando um kit de Maxiprep livre de endotoxinas e dissolver numa solução salina balanceada de Hanks.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Instalação de equipamento de eletroporação Os instrumentos elétricos como um estimulador e um isolador devem ser conectados conforme mostrado na Figura 2.<ol>
<li>Conecte o estimulador do isolador bifásico.</li>
		<li>Conecte um eletrodo (um fio de prata 0,2 mm de diâmetro) para o terminal negativo do isolador.</li>
		<li>Conecte um eletrodo (um fio de prata 1 mm de diâmetro) em série com um resistor Ω a 100 e o terminal positivo do isolador.</li>
		<li>Ligar o amplificador ao osciloscópio para monitorar se correntes elétricas são passadas através do resistor, medindo a tensão com o amplificador.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação de pipetas de vidro Nota: Dois tipos de pipetas de vidro são utilizados para ejeção da solução do plasmídeo e a aplicação de pulsos elétricos.<ol>
<li>Fazer as pipetas de capilares de vidro com um extrator de eletrodo.</li>
		<li>Quebre a ponta para a pipeta de ejeção (o diâmetro da ponta deve ser de 20-50 μm).</li>
		<li>Moer e polir a ponta da pipeta eletrodo com lixa seguida de fogo-polimento (o diâmetro interno deve ser de 50-200 μm). Nota: Ponta do eletrodo deve ser plana e Lisa, como que toca diretamente o tecido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Procedimento de eletroporação
	<ol>
<li>Conecte as ejeção e eletrodo pipetas para os manipuladores.</li>
		<li>Introduza um fio de prata (0,2 mm de diâmetro) dentro da pipeta de eletrodo.</li>
		<li>Anexe a pipeta de ejeção de uma seringa de 1 mL com um tubo de plástico.</li>
		<li>Ocupam > 5 μL de solução de plasmídeo dentro da pipeta de ejeção por sucção da seringa.</li>
		<li>Colocar o coculture no palco electroporation e inserir o eletrodo de diâmetro de 1 mm no meio de cultura.</li>
		<li>Coloque a pipeta de ejeção do explante talâmica.</li>
		<li>Empurre a seringa manualmente após a ponta toca a superfície do bloco talâmica. Nota: Sobre 0,5 μL do plasmídeo solução geralmente é usada por um bloco talâmica.</li>
		<li>Coloca a pipeta do eletrodo no bloco talâmica imediatamente depois da retração da pipeta ejeção.</li>
		<li>Entrega os pulsos elétricos (50-400 μA, trens de 3 a 5 de 200 pulsos quadrados de 1 ms duração a 200 Hz). Monitore a amplitude e o número de trens no osciloscópio. Nota: A amplitude das correntes elétricas depende do diâmetro interno de um eletrodo pipeta13.</li>
		<li>Retire a pipeta do eletrodo e devolver o prato para a incubadora.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Observação microscópica
	<ol>
<li>Coloque o prato de cultura num palco microscópica de um microscópio confocal vertical equipado com dois conjuntos de filtro para EGFP (excitação, 488 nm; emissão, 515 nm) e DsRed (excitação, 514 nm; emissão, 565 nm).</li>
		<li>Com imagens de 10-25 seções óticas em tamanhos de 1-7 µm-passo com uma lente objetiva distância de long-trabalho X 20. Selecione individualmente distinguíveis rotulados axônios que expressam tanto DsRed e SYP-EGFP. Nota: A área observada é aproximadamente 0,7 x 0,7 mm (correspondente a 1024 x 1024 pixels, ou seja, 0,68 μm/pixel).</li>
		<li>Capture imagens cada 24 h para a geração de imagens diária. Concluída dentro de 10 min à temperatura ambiente e retornar as culturas para a incubadora. Para a imagem latente de lapso de tempo curto intervalo, manter a cultura em uma câmara de cultura, que mantém que o ambiente de humedecido 95% ar e 5% CO2 a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Kageyama, G. H., Robertson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+geniculocortical+projections+to+visual+cortex+in+rat%3A+evidence+early+ingrowth+and+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Development of geniculocortical projections to visual cortex in rat: evidence early ingrowth and synaptogenesis.</a> J. Comp. Neurol. 335 (1), 123-148 (1993).</li>
<li>Lopez-Bendito, G., Molnar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalamocortical+development%3A+how+are+we+going+to+get+there%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Thalamocortical development: how are we going to get there.</a> Nat. Rev. Neurosci. 4 (4), 276-289 (2003).</li>
<li>Espinosa, J. S., Stryker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+plasticity+of+the+primary+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development and plasticity of the primary visual cortex.</a> Neuron. 75 (2), 230-249 (2012).</li>
<li>Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+modes+of+axon+elaboration+in+the+developing+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex.</a> PLoS Biol. 3 (8), 272(2005).</li>
<li>Holtmaat, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+structural+synaptic+plasticity+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).</li>
<li>Bhatt, D. H., Zhang, S., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine dynamics.</a> Annu Rev Physiol. 71, 261-282 (2009).</li>
<li>Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+connections+between+the+lateral+geniculate+nucleus+and+visual+cortex+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro.</a> Science. 245 (4914), 192-194 (1989).</li>
<li>Yamamoto, N., Yamada, K., Kurotani, T., Toyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+specificity+of+extrinsic+cortical+connections+studied+in+coculture+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Laminar specificity of extrinsic cortical connections studied in coculture preparations.</a> Neuron. 9 (2), 217-228 (1992).</li>
<li>Uesaka, N., Hirai, S., Maruyama, T., Ruthazer, E. S., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+dependence+of+cortical+axon+branch+formation%3A+a+morphological+and+electrophysiological+study+using+organotypic+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity dependence of cortical axon branch formation: a morphological and electrophysiological study using organotypic slice cultures.</a> J. Neurosci. 25 (1), 1-9 (2005).</li>
<li>Uesaka, N., Hayano, Y., Yamada, A., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+laminar+specificity+and+activity-dependent+mechanisms+of+thalamocortical+axon+branching%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Interplay between laminar specificity and activity-dependent mechanisms of thalamocortical axon branching.</a> J. Neurosci. 27 (19), 5215-5223 (2007).</li>
<li>Uesaka, N., Nishiwaki, M., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+electroporation+method+for+axon+tracing+in+cultured+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Single cell electroporation method for axon tracing in cultured slices.</a> Dev. Growth Differ. 50 (6), 475-477 (2008).</li>
<li>Matsumoto, N., Hoshiko, M., Sugo, N., Fukazawa, Y., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse-dependent+and+independent+mechanisms+of+thalamocortical+axon+branching+are+regulated+by+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synapse-dependent and independent mechanisms of thalamocortical axon branching are regulated by neuronal activity.</a> Dev Neurobiol. 76 (3), 323-336 (2016).</li>
<li>Matsumoto, N., Sasaki, K., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/282233732_Electroporation_Method_for_Mammalian_CNS_Neurons_in_Organotypic_Slice_Cultures">Electroporation Method for Mammalian CNS Neurons in Organotypic Slice Cultures.</a> Electroporation Methods in Neuroscience. , 159-168 (2015).</li>
<li>Molnar, Z., Blakemore, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+regional+specificity+for+connections+formed+between+thalamus+and+cortex+in+coculture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lack of regional specificity for connections formed between thalamus and cortex in coculture.</a> Nature. 351 (6326), 475-477 (1991).</li>
<li>Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+specific+afferent+connections+in+organotypic+slice+cultures+from+rat+visual+cortex+cocultured+with+lateral+geniculate+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus.</a> J. Neurosci. 12 (8), 3054-3070 (1992).</li>
<li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+mechanism+by+polysialic+acid+for+lamina-specific+branch+formation+of+thalamocortical+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inhibitory mechanism by polysialic acid for lamina-specific branch formation of thalamocortical axons.</a> J. Neurosci. 20 (24), 9145-9151 (2000).</li>
<li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+factors+regulating+lamina-specific+growth+of+thalamocortical+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of factors regulating lamina-specific growth of thalamocortical axons.</a> J Neurobiol. 42 (1), 56-68 (2000).</li>
<li>Ohnami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+RhoA+in+activity-dependent+cortical+axon+branching%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Role of RhoA in activity-dependent cortical axon branching.</a> J. Neurosci. 28 (37), 9117-9121 (2008).</li>
<li>Yamada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+pre-+and+postsynaptic+activity+in+thalamocortical+axon+branching%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Role of pre- and postsynaptic activity in thalamocortical axon branching.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (16), 7562-7567 (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O protocolo atual também é uma ferramenta poderosa para estudar aspectos do desenvolvimento do crescimento de axônios, além do TC projeção11. Por exemplo, uma combinação de cultura fatia cortical e a técnica de eletroporação permite visualizar a morfologia axonal individual de neurônios corticais e observação de longo prazo9,18.
Usando o protocolo atual, os papéis de genes interessantes na formação de ramificaçã...

A projeção thalamocortical (TC) do cérebro de mamíferos é um sistema adequado para investigar a orientação do axônio e mecanismos de direcionamento. Durante o desenvolvimento, axônios sensoriais do TC crescem na placa cortical e ramos de formulário e sinapses preferencialmente em camada IV das áreas sensoriais primárias no córtex cerebral1,2. Mesmo após o estabelecimento de conexões fundamentais, mandris axonal e terminais sinápticos são remodelados dependendo de mudanças ambientais3,4. No entanto, como morfologia do axônio TC é alterada dinamicamente é mal compreendida. Uma das principais razões é a falta de uma técnica adequada para observar mudanças estruturais a nível uma única célula. Embora os desenvolvimentos recentes na microscopia, tais como a microscopia de dois fotões, permitiram a observação directa da vida neurônios corticais na vivo, existem limitações ainda técnicas para capturar o global TC trajetórias5, 6. portanto, em vitro métodos para geração de imagens ao vivo de axônios de TC que fornece ferramentas poderosas para análises estruturais de formação de ramificação e sinapse do axônio.
Nosso grupo pela primeira vez estabeleceu um método de cultura estático fatia com membrana permeável7. Usando este método, uma fatia de cortical do rato foi cocultured com um bloco talâmica sensorial, e conexões de TC de lâmina específica foram recapituladas neste organotypic cocultures7,8. Etiquetando esparsas com uma proteína fluorescente ainda mais nos permitiu observar crescimento do axônio TC e ramo formação9,10,11. Recentemente, temos desenvolvido um novo método para tratamento de imagens simultâneo de ramificação e formação de sinapse de axônios individuais de TC no organotypic cocultures12. Para visualizar sites pré-sináptica e axônios TC simultaneamente, DsRed e EGFP-tag Sinaptofisina (SYP-EGFP) foram co transfectadas em um pequeno número de neurônios talâmicos por eletroporação de coculture o organotypic. O método atual facilita a análise morfológica de axônios de TC e permite a observação a longo prazo, que pode ser usada para mostrar a relação causal entre a formação de ramificação e sinapse do axônio.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>GIBCO</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina balanceada de Hanks (HBSS)</td><td>Nissui</td><td>5905</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30396-03</td><td>Hyclone</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>Progesterona</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona</td><td>Sigma& nbsp;</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>Selenito de sódio</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>192-10843</td><td></td></tr><tr><td>Transferrina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Putrescine&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>16806-25</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de 35 mm</td><td>Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Inserção Millicell-CM Placas de</td> Petri <td>Millipore</td><td>PICMORG50</td><td></td></tr><tr><td>100 mm</td><td>Placa de Petri BIO-BIK</td><td>I-90-20</td><td>Estéril</td></tr><tr><td>HiPure Plasmid Maxiprep Kit</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>K210006</tr><tr>Pipetas <td></td><td>de plástico estéreis descartáveis</td><td>202-IS</td><td>pipetas de transferência estéreis</td></tr><tr><td>capilares de vidro: OD 1,2 mm</td><td>Narishige</td><td>&nbsp; G-1.2</td><td>diâmetro interno, 1.2 mm</td></tr><tr><td>Fio de prata: 0.2 e 1 mm&nbsp;</td><td>Nilaco</td><td>AG-401265 (diâmetro, 0,2 mm), AG-401485 (diâmetro, 1,0 mm)</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 1 mL</td><td>Terumo</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>Estimulador&nbsp;</td><td>Isolador bifásico A.M.P.I</td><td>Master 8</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Amplificador BAK ELECTRONICS</td><td>BSI-2</td><td></td></tr>&<tr><td>nbsp;</td>Osciloscópio <td>Modelo 1800</td><td></td> <td>da A-M Systems</td></tr><tr><td></td><td>Hitachi</td><td>VC-6723</td><td></td></tr><tr><td>Manipulador</td><td>Narishige</td><td>SM-15</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Narishige</td><td>MO-10</td><td></td></tr><tr><td>Estereomicroscópio&nbsp;</td><td>Suporte universal Olympus</td><td>SZ40</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sistema</td> de iluminação de luz <td>Olympus SZ-STU2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>LG-PS2, LG-DI, HLL301</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de eletrodos&nbsp;</td>Microscópio confocal <td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>Digital eclipse C1 laser</td><td></td></tr><tr><td>x20 objetiva</td><td>Nikon</td><td>ELWD 20x/0.45</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de cultura</td><td>Tokai Hit</td><td>UK A16-U</td><td></td></tr><tr><td>Sprague-Dawley (SD) rato</td><td>Japão SLC e Nihon-Dobutsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de microcirurgia</td><td>Natsume&nbsp;</td><td>MB-54-1</td><td></td></tr></tbody></table>

visualização do axônio thalamocortical ramificação e sinapse formação em organotypic cocultures

Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures

Formação de ramificação e sinapse do axônio são processos cruciais para o estabelecimento de circuitos neuronais precisos. Durante o desenvolvimento, axônios sensoriais thalamocortical (TC) formam ramos e sinapses em camadas específicas do córtex cerebral. Apesar da óbvia correlação espacial entre formação de ramificação e sinapse do axônio, a relação causal entre eles é mal compreendida. Para resolver esse problema, recentemente desenvolvemos um método para tratamento de imagens simultâneo de ramificação e sinapse formação de axônios individuais de TC em organotypic cocultures.
Este protocolo descreve um método que consiste em uma combinação de um organotypic coculture e eletroporação. Organotypic cocultures do tálamo e córtex cerebral facilitam a observação dos processos axonal, preservando estruturas características tais como a configuração laminar e manipulação genética. Dois plasmídeos distintos codificação DsRed e Sinaptofisina com tag EGFP (SYP-EGFP) foram co transfectados em um pequeno número de neurônios talâmicos técnica de eletroporação. Este método permitiu-nos Visualizar morfologias axonal individuais dos neurônios de TC e seus sites pré-sináptica simultaneamente. O método permitiu também a observação a longo prazo, que revelou a relação causal entre formação de ramificação e sinapse do axônio.

O experimento aqui descrito destina-se a revelar a relação entre formação de ramificação e sinapse de axônio de TC. Para visualizar simultaneamente trajetórias axonal e locais de sites pré-sináptica, única ou poucas células talâmicos em organotypic cocultures foram transfectadas com dois plasmídeos codificação SYP-EGFP e DsRed usando eletroporação. Durante a segunda semana de cultura, axônios individualmente distinguíveis do TC foram claramente rotulados por DsRed (Fi...

Este protocolo descreve um método para tratamento de imagens simultâneo de thalamocortical axônio ramificação e sinapse formação em cocultures de organotypic do tálamo e córtex cerebral. Axônios de thalamocortical individuais e seus terminais pré-sináptica são visualizados pela técnica de eletroporação única célula com DsRed e Sinaptofisina GFP-etiquetado.

Visualização do axônio Thalamocortical ramificação e sinapse formação em Organotypic Cocultures

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) ...

O objetivo geral deste método é estudar as mudanças morfológicas dinâmicas da ramificação do axônio e da formação de sinapses na projeção tálamo-cortical. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurobiologia, como a formação de novos circuitos neurais. A principal vantagem desta técnica é a observação simultânea do crescimento do axônio e da formação de sinapses em células vivas individuais.Este método pode fornecer informações sobre a relação entre a ramificação do axônio e a formação de sinapses nas projeções tálamo-corticais. Também pode ser aplicado a outros circuitos neurais, como a conexão intrínseca no córtex cerebral. Para iniciar este procedimento, esterilize todos os instrumentos cirúrgicos com etanol a 70% por 10 minutos ou mais.Em seguida, disseque todo o cérebro rapidamente de um rato pós-parto sob anestesia gelada. Em seguida, coloque o cérebro em uma placa de Petri de 100 milímetros contendo 40 mililitros de solução salina balanceada de Hank fria. Sob um microscópio binocular, remova a matéria pia cuidadosamente com uma pinça fina e corte o córtex visual e somatossensorial primário em fatias de 300 a 400 mícrons de espessura usando uma tesou

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Neuroscience

Neurociência

Um método para gerar fatias organotípicas da E12.5 mesencéfalo embrionário murino é descrito. As culturas fatia organotípicas pode ser usado para observar o comportamento de neurônios dopaminérgicos ou outros neurônios do mesencéfalo ventral.

Organotípicas culturas de mesencéfalo ventral Slice Embrionárias: Um Sistema para o Estudo de Desenvolvimento Neuronal dopaminérgicos In vitro</em

Fonte: Winkle, C. C., et al. Utilizando metodologias combinadas para definir o papel da entrega da membrana plasmática durante a ramificação do axônio e a morfogênese neuronal. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra uma técnica de imagem ao vivo usando microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC) para observar a ramificação axonal em tempo real em neurônios corticais. Vídeos de lapso de tempo capturam os efeitos do tratamento com netrin-1, uma molécula de sinalização que induz...

Imagem in vitro em tempo real da ramificação axonal em neurônios corticais de camundongos

A co-cultura de fatia cerebral organotípicas com células de carcinoma permite visualizar as alterações morfológicas por fluorescência, bem como o campo brilhante (vídeo) microscopia durante o processo de invasão de células de carcinoma de tecido cerebral. Este modelo de sistema também permite abordagens taxas de célula e de reabastecimento e oferece uma ampla variedade de manipulações e análises.

Sistema de co-cultura com uma fatia organotípicas Cérebro e esferóide 3D de carcinomas de células

O uso de vários ângulos para cortar o cérebro do rato filhote, podemos melhorar em cima de uma fatia cerebral aguda anteriormente descrito que captura as conexões entre a maioria dos principais mesencéfalo e prosencéfalo estruturas auditivas.

A modificação de um Colliculo-tálamo-cortical do cérebro do rato Fatia, Incorporando a impressão 3-D da Câmara Components and Imaging Optical Multi-escala

Aqui apresenta-se um protocolo que é baseado em fatias de medula espinhal cultivadas em matrizes multi-eléctrodos para estudar a regeneração funcional de ligações propriospinal in vitro.

Investigando regeneração funcional em organotï¿½icas Medula Espinhal Co-culturas cultivadas em Arrays Multi-eletrodo

Este artigo descreve uma metodologia detalhada para obter secções tangenciais achatadas de mamíferos córtices e Visualizar módulos corticais usando histochemical e métodos de imuno-histoquímica.

Visualização de módulos corticais em córtices mamíferos achatadas

Neste protocolo, nosso objetivo é descrever um método reprodutível para os neurônios de células-tronco derivadas de pluripotentes humanas combinando dissociado e astrócitos juntos em 3D sphere cocultures, mantendo estas esferas em condições de flutuação livre e, posteriormente medindo a atividade sináptica circuito das esferas com immunoanalysis e gravações de matriz multielectrode.

Modelagem de microcircuito sináptica com Cocultures 3D de astrócitos e neurônios de células-tronco pluripotentes humanas

As interações neurônio-glial na neurodegeneração não são bem compreendidas devido a ferramentas e métodos inadequados. Aqui, descrevemos protocolos otimizados para obter neurônios induzidos, células precursoras de oligodendrócitos e oligodendrócitos de células-tronco pluripotentes humanas e fornecemos exemplos dos valores desses métodos na compreensão das contribuições específicas do tipo celular na doença de Alzheimer.

Geração de neurônios humanos e oligodendrócitos a partir de células-tronco pluripotentes para modelagem de interações neurônio-oligodendrócitos

Apresentamos protocolos detalhados para a geração e caracterização de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos 2D e 3D (hIPSC) de desenvolvimento neocortical, bem como metodologias complementares que permitem análise qualitativa e quantitativa da biogênese e função do cilium primário (PC).

Modelos pluripotentes 2D e 3D induzidos por humanos para dissecar o envolvimento do círio primário durante o desenvolvimento neocortical

Este protocolo demonstra um método simples e robusto para estudar na dinâmica do cone de crescimento e crescimento do axônio. Ele descreve como preparar ex vivo fisiologicamente relevantes fatias cerebrais agudas e fornece um pipeline de análise amigável.

In situ Visualização da Dinâmica do Cone de Crescimento e Crescimento do Axon em Culturas agudas de fatias de cérebro embrionário ex vivo

As áreas sensoriais primárias no neocórtex exibem atividades espontâneas únicas durante o desenvolvimento. Este artigo descreve como visualizar atividades de neurônios individuais e áreas sensoriais primárias para analisar atividades síncronas específicas de área em camundongos neonatais in vivo.

Visualização in vivo da atividade espontânea no córtex sensorial de camundongos neonatais com resolução de neurônio único

Aprenda a visualizar ramificação axonal e formação sináptica em coculturas organotípicas de tálamo e córtex cerebral. Este método permite observar dinamicamente o crescimento axonal e o desenvolvimento sináptico em células vivas.

Visualização do axônio Thalamocortical ramificação e sinapse formação em Organotypic Cocultures

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