Visualização do axônio Thalamocortical ramificação e sinapse formação em Organotypic Cocultures
28 de março de 2018
Este protocolo descreve um método para tratamento de imagens simultâneo de thalamocortical axônio ramificação e sinapse formação em cocultures de organotypic do tálamo e córtex cerebral. Axônios de thalamocortical individuais e seus terminais pré-sináptica são visualizados pela técnica de eletroporação única célula com DsRed e Sinaptofisina GFP-etiquetado.
O objetivo geral deste método é estudar as mudanças morfológicas dinâmicas da ramificação do axônio e da formação de sinapses na projeção tálamo-cortical. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurobiologia, como a formação de novos circuitos neurais. A principal vantagem desta técnica é a observação simultânea do crescimento do axônio e da formação de sinapses em células vivas individuais.
Este método pode fornecer informações sobre a relação entre a ramificação do axônio e a formação de sinapses nas projeções tálamo-corticais. Também pode ser aplicado a outros circuitos neurais, como a conexão intrínseca no córtex cerebral. Para iniciar este procedimento, esterilize todos os instrumentos cirúrgicos com etanol a 70% por 10 minutos ou mais.
Em seguida, disseque todo o cérebro rapidamente de um rato pós-parto sob anestesia gelada. Em seguida, coloque o cérebro em uma placa de Petri de 100 milímetros contendo 40 mililitros de solução salina balanceada de Hank fria. Sob um microscópio binocular, remova a matéria pia cuidadosamente com uma pinça fina e corte o córtex visual e somatossensorial primário em fatias de 300 a 400 mícrons de espessura usando uma tesoura microcirúrgica.
Em seguida, transfira as fatias corticais para o filtro de membrana do folheto de cultura usando uma pipeta de plástico descartável. Ajuste as posições das fatias perto do centro do inserto de cultura com a pipeta de plástico descartável e remova o excesso de meio do inserto. Mantenha as fatias no meio de cultura contendo soro a 37 graus Celsius e cultive-as sozinhas por um dia antes de colocar um bloco talâmico de um embrião E15 próximo a ele.
Ajustar o nível do meio ligeiramente abaixo da superfície da fatia, de modo a que as fatias possam receber um abastecimento suficiente do gás e do meio. Isso é crucial para a viabilidade das fatias. Nesta etapa, faça os capilares de vidro com um extrator de eletrodo.
Em seguida, quebre as pontas dos capilares de vidro para injeção de plasmídeo. Para as pipetas de eletrodos, triture e polir as pontas dos capilares de vidro com uma lixa. E então poli-los para atingir um diâmetro interno de 50 a 200 mícrons.
Em seguida, conecte a pipeta de eletrodo e a pipeta de ejeção aos manipuladores. Transfira cinco microlitros de solução de plasmídeo para uma placa de Petri. Em seguida, aspire a solução para a pipeta de eletrodo com ação capilar.
Insira o eletrodo de 0.2 milímetros de diâmetro na pipeta do eletrodo. Depois de conectar a pipeta de ejeção a uma seringa de um mililitro com um tubo de plástico, transfira cinco microlitros de solução de plasmídeo para uma placa de Petri novamente. Em seguida, aspire lentamente a solução para a pipeta de ejeção usando a seringa.
Em seguida, transferir a cocultura para a fase de electroporação e inserir o eléctrodo de um milímetro de diâmetro no meio de cultura. Em seguida, coloque a pipeta de ejeção no bloco talâmico cultivado. Empurre a seringa manualmente depois que a ponta tocar a superfície do bloqueio talâmico.
Coloque a pipeta de eletrodo no bloco talâmico imediatamente após a retração da pipeta de ejeção. Agora, forneça os pulsos elétricos. Monitore a amplitude e o número de trens no osciloscópio.
Em seguida, retraia a pipeta do eletrodo e retorne o prato à incubadora. Para observar a amostra, coloque a placa de cultura no palco de um microscópio confocal vertical equipado com dois conjuntos de filtros para EGFP e DsRed. Em seguida, tire imagens de 10 a 25 seções ópticas, em tamanhos de passo de um a sete mícrons, com uma lente objetiva de longa distância de trabalho de 20x.
Selecione axônios marcados individualmente distinguíveis, que expressam DsRed e Syp-EGFP. Aqui é mostrada uma cocultura organotípica de fatias talâmicas e corticais após 12 DIV. Aqui está uma imagem ampliada da região encaixotada.
E aqui está uma célula talâmica marcada com DsRed estendendo um axônio para a fatia cortical e formando ramos nas camadas superiores. Essas imagens mostram o axônio tálamo-cortical marcado com DsRed e o puncta Syp-EGFP. Um acúmulo discreto de Syp-EGFP foi observado ao longo de um único axônio tálamo-cortical.
Os plasmídeos DsRed mais Syp-EGFP foram introduzidos em células talâmicas cultivadas em um DIV usando eletroporação. Este axônio foi fotografado diariamente durante quatro dias. A ramificação do axônio e a formação de sinapses foram dinâmicas, com adição e eliminação.
Seguindo esses procedimentos, a eletroporação com genes interessantes em conjunto com Syp-EGFP e DsRed pode ser realizada para investigar o papel do gene na ramificação do axônio e na formação de sinapses. Esta técnica abre caminho para pesquisadores no campo da neurobiologia explorarem os mecanismos de mudanças dinâmicas dos circuitos neurais.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo para a imagem simultânea do ramificamento de axônios talamocorticais e da formação de sinapses em culturas co-organotípicas do tálamo e do córtex cerebral. Ele enfoca as mudanças morfológicas dinâmicas na projeção talamocortical, fornecendo insights sobre a formação de novos circuitos neurais e a relação entre o crescimento axonal e o desenvolvimento sináptico.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Neurobiologia
- Biologia Celular
Antecedentes
- As projeções talamocorticais desempenham um papel fundamental no processamento sensorial.
- Compreender o ramificamento axonal e a formação de sinapses é essencial para obter insights sobre a formação de circuitos neurais.
- Os métodos atuais apresentam limitações na observação simultânea dessas alterações ao nível celular.
- O estudo aprimora técnicas de imageamento em contextos de células vivas.
Objetivo do Estudo
- Investigar alterações morfológicas dinâmicas durante a ramificação do axônio e a formação de sinapses.
- Fornecer um método que permita a observação de células vivas individuais em cultivo em co-cultura.
- Avaliar a relação entre o crescimento do axônio e o desenvolvimento sináptico em neurônios talamocorticais.
Métodos Utilizados
- Foram utilizadas culturas cocultivo organotípicas de fatias tálamo-corticais.
- Tecido de ratos do segundo dia pós-natal foi usado para criar o modelo biológico.
- A eletroporação foi realizada para introduzir marcadores fluorescentes para imagem.
- As culturas foram mantidas a 37 graus Celsius e observadas em pontos temporais específicos do desenvolvimento.
- A aquisição de imagens foi realizada usando um microscópio confocal para capturar a dinâmica axonal.
Resultados Principais
- Foram observadas mudanças dinâmicas no ramificamento axonal e na formação de sinapses, destacando a plasticidade nas projeções talamocorticais.
- Notou-se o acúmulo discreto de marcadores sinápticos ao longo dos axônios, indicando o desenvolvimento sináptico contínuo.
- A técnica permitiu a observação em tempo real de alterações morfológicas em células individuais.
- Os resultados enfatizam o potencial de investigar os papéis de genes na dinâmica de axônios e sinapses.
Conclusões
- Este estudo demonstra um novo método para explorar a dinâmica e a plasticidade dos circuitos neurais.
- Ele fornece insights sobre o acoplamento entre o crescimento do axônio e a formação de sinapses.
- Os achados têm implicações para a compreensão dos mecanismos de conectividade neural e plasticidade na saúde e na doença.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite a visualização simultânea do ramificamento axonal e da formação de sinapses em circuitos neurais vivos, abordando uma lacuna mecanicista fundamental na validação de alvos neurodesenvolvimentais. Ao fornecer dados dinâmicos com resolução em nível de célula única sobre plasticidade estrutural, ele reforça a confiança preditiva nos estágios iniciais de descoberta, onde a redução de riscos mecanicistas de alvos sinápticos é crítica. A abordagem oferece continuidade translacional desde o entendimento mecanicista até a avaliação pré-clínica de fenótipos em nível de circuito em modelos de doenças neuropsiquiátricas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar hipóteses terapêuticas que relacionam a morfologia do axônio à conectividade sináptica em vias tálamo-corticais.
- Valor Operacional: Preserva a arquitetura laminar e a viabilidade neuronal para observação longitudinal de alterações estruturais dinâmicas.
- Valor Científico: Apoia a redução de riscos biológicos ao esclarecer as relações causais entre o crescimento estrutural e a sinaptogênese funcional.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera leituras quantitativas e multiplexadas de ramificação axonal e acúmulo de marcadores pré-sinápticos para padronização de ensaios.
- Valor Operacional: Permite a preparação de sistemas biológicos validados para triagem de compostos em vias de neurodesenvolvimento.
- Valor Operacional: Facilita fluxos de trabalho de imagem escaláveis e reprodutíveis, compatíveis com leituras fluorescentes multiplexadas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Alinha-se a sistemas relevantes para doenças em que a disconectividade tálamo-cortical contribui para fenótipos sensoriais e cognitivos.
- Valor Operacional: Oferece continuidade do rastreamento mecanicista em fase de descoberta até a validação pré-clínica do resgate em nível de circuito.
- Valor Científico: Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco, vinculando dinâmicas estruturais a resultados sinápticos funcionais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao permitir a observação direta da plasticidade estrutural anterior aos resultados dos ensaios funcionais em modelos de circuitos neurais.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre genes que regulam a dinâmica da ramificação axonal e a formação de sítios sinápticos em circuitos vivos.
- Triagem: Fornece dados morfológicos quantitativos e de pontuações fluorescentes prontos para ensaios, destinados ao perfilhamento de efeitos de compostos.
- Análises: Permite a comparação estatística da frequência de ramificação e da densidade de sinapses entre diferentes condições experimentais ao longo do tempo.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas mecanicistas a modelos pré-clínicos de transtornos do neurodesenvolvimento que apresentam alterações nas vias talamocorticais.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma de imagem reutilizável para avaliação multiparamétrica da neuritogênese e da sinaptogênese em diversos modelos neurais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir a ambiguidade nas relações estrutura-função durante a montagem de circuitos neurais.
- Valor Operacional: Padroniza fluxos de trabalho de imagem de dois canais para rastreamento consistente e longitudinal da dinâmica axonal e sináptica.
- Valor Estratégico: Melhora decisões de prosseguir ou interromper projetos ao fornecer evidências mecanicistas sobre o engajamento do alvo em vias de plasticidade estrutural.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base em efeitos validados no acoplamento entre axônios e sinapses em circuitos relevantes para humanos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência no manejo de culturas-organotípicas em co-cultivo, eletroporação e microscopia confocal.
- Depende de instrumentos cirúrgicos estéreis, preparação de micropipetas e qualidade do DNA plasmidial para uma transfeção eficiente.
- Exige controle ambiental a 37°C e meio contendo soro para manter a viabilidade dos fragmentos por vários dias.
- A adaptação a circuitos neurais alternativos requer validação da compatibilidade tecidual e da eficiência de eletroporação.
- As limitações práticas incluem a variabilidade na eficiência de transfeção e a necessidade de análise pós-hoc de imagens para quantificar a dinâmica de ramificações e de pontos.
