Aplicação do sistema de cultura Aorta-gônada-mesonephros explante na hematopoiese do desenvolvimento
3 de novembro de 2017
Este protocolo descreve o uso culto Aorta-gônada-Mesonephros para análises de expressão, unidades formadoras de colônia, na cultura e baço e reconstituição de longo prazo para determinar o efeito de fatores regulatórios e vias de sinalização no tronco hematopoiético desenvolvimento da célula. Isto foi demonstrado como um sistema eficaz para estudar a função e biologia de células-tronco hematopoiéticas.
O objetivo geral deste experimento é usar uma cultura de explante aorta-gônada-mesonefros para investigar os reguladores críticos do desenvolvimento de células-tronco hematopoiéticas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na biologia das HSCs e nos campos de função sobre como identificar os fatores envolvidos na regulação do desenvolvimento das HSC em mamíferos. A principal vantagem desta técnica é que esses reguladores podem ser verificados através da análise da expressão de DNA e da capacidade de formação de colônias e da capacidade de reconstituição do HSC.
Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque a separação precisa da AGM dos tecidos circundantes na região do tronco requer prática para dominar. Antes de iniciar o procedimento, coloque malhas de aço inoxidável em poços individuais de uma placa de seis poços contendo dois mililitros de meio suplementado com fluoxetina recém-preparado por poço. Coloque um filtro de 0,65 microlitro esterilizado por UV por poço experimental em uma placa de cultura de células de vidro contendo água fervente fresca por duas lavagens de três minutos, imergindo os filtros em um recipiente de PBS em temperatura ambiente por dois minutos após cada lavagem.
Em seguida, coloque um filtro em cada malha de aço na interface ar-líquido de cada poço. Em seguida, use a tesoura de dissecação para retirar o útero de uma rata grávida embrionária do dia 11 e colher os embriões do útero. Usando uma tesoura de dissecação, remova o saco vitelino, o cordão umbilical e as vísceras do corpo do embrião.
E remova cuidadosamente os tecidos nervosos dorsais e os tecidos musculares circundantes. Usando fórceps, remova os tecidos dos membros anteriores e posteriores. E separe a região AGM do corpo embrionário.
Em seguida, coloque cada AGM em um único filtro na interface ar-líquido de cada poço. Coloque as culturas em uma incubadora de 37 graus Celsius e 5% de CO2. Após dois a três dias, transfira as amostras de AGM para tubos de microcentrífuga individuais de 1,5 mililitro contendo 200 microlitros de colagenase para sua dissociação a 37 graus Celsius por cerca de 20 minutos com agitação a cada cinco minutos.
No final da digestão, pare as reações com 200 microlitros de soro por explante. Transfira todo o conteúdo de cada tubo para poços individuais de uma placa de fixação ultrabaixa de 24 poços contendo 500 a 600 microlitros de meio M3434 por poço. Misture as células em cada poço com uma seringa de um mililitro sem agulha.
Coloque a placa na incubadora de cultura de células. O número de unidades formadoras de colônias dentro de cada poço pode ser pontuado após sete a 10 dias de cultura. Para transplante de explante AGM in vivo após dois a três dias de cultura AGM, como acabamos de demonstrar, erradique letalmente camundongos C57 pretos machos de oito a 10 semanas com nove cinzas de radiação.
Quatro a cinco horas depois, dissociar os explantes colhidos em 200 microlitros de colagenase por amostras, conforme demonstrado. Carga de 0,5 a um equivalente embrionário das suspensões unicelulares resultantes em uma seringa de um mililitro por animal receptor. Coloque o primeiro camundongo irradiado em um limitador e limpe a cauda com um cotonete embebido em etanol a 75% para promover a vasodilatação da veia da cauda.
Injete por via intravenosa todo o conteúdo de uma seringa em uma veia da cauda dilatada. Use um cotonete anti-séptico para estancar o sangramento após a remoção da agulha. Em seguida, retorne o animal à gaiola e injete o próximo animal.
11 dias após a transferência adotiva, os baços podem ser fixados na solução de Bouin para enumeração macroscópica das colônias visíveis do baço. As culturas AGM suplementadas com fluoxetina demonstram uma expressão aumentada de Runx1, um gene fundamental para o desenvolvimento de HSC nos níveis de expressão de mRNA e proteína. A fluoxetina também pode aumentar significativamente a capacidade de formação de colônias de HSC na AGM, incluindo eritróides de unidade formadora de explosão, monócitos granulares de unidade formadora de colônias e granulócitos de unidade formadora de colônias, eritrócitos, macrófagos e megacariócitos.
Além disso, o transplante in vivo de HSC tratado com fluoxetina isolado de explantes AGM resulta em aumento do número de colônias nos baços de animais receptores adultos irradiados. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar a AGM e realizar uma cultura de explante AGM para a identificação dos reguladores críticos do desenvolvimento de HSC dentro da AGM.
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Visão Geral
Este protocolo descreve o uso de Aorta-Gônada-Mesonefros (AGM) cultivados para análises de expressão e unidades formadoras de colônias no estudo do desenvolvimento de células-tronco hematopoiéticas (HSC). Trata-se de um sistema eficaz para investigar os fatores regulatórios e as vias de sinalização envolvidas na biologia das HSC.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia das células-tronco hematopoiéticas
- Técnicas de cultura celular
- Fatores regulatórios no desenvolvimento
Contexto
- A região AGM é crucial para o desenvolvimento de HSC em mamíferos.
- Compreender a regulação de HSC pode levar a avanços na medicina regenerativa.
- Ensaios de formação de colônias são essenciais para avaliar a funcionalidade de HSC.
- A separação da região AGM dos tecidos circundantes exige habilidade e prática.
Objetivo do Estudo
- Investigar reguladores essenciais do desenvolvimento das CSH.
- Identificar fatores envolvidos na regulação das CSH.
- Aprimorar o entendimento da biologia e função das CSH.
Métodos Utilizados
- Técnicas de cultura de explantes de AGM.
- Análise de expressão de DNA para verificação de fatores regulatórios.
- Ensaios de formação de colônias para avaliar a capacidade de HSC.
- Estudos de reconstituição de longo prazo.
Resultados Principais
- Identificação dos principais fatores regulatórios que afetam o desenvolvimento de HSC.
- Verificação dos fatores por meio de análise de expressão de DNA.
- Demonstração bem-sucedida da capacidade de formação de colônias em HSC cultivadas.
- Informações sobre as vias de sinalização envolvidas na biologia de HSC.
Conclusões
- O sistema de cultura AGM é eficaz para o estudo do desenvolvimento de HSC.
- Compreender os fatores regulatórios pode orientar estratégias terapêuticas.
- Este método fornece uma plataforma para pesquisas futuras em hematopoiese.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O sistema de cultura de explantes de AGM resolve um gargalo fundamental na pesquisa de células-tronco hematopoiéticas (HSC) ao permitir estudos mecanicistas sem a necessidade de modelos com derrubamento germinativo. Essa abordagem apoia a validação de alvos e a redução de riscos na fase inicial de descoberta, possibilitando experimentos de resgate farmacológico ou genético em um nicho embrionário fisiologicamente relevante. Ele aumenta a confiança preditiva na identificação de reguladores essenciais do desenvolvimento de HSC, orientando decisões de portfólio em áreas terapêuticas focadas na hematopoiese.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da verificação do envolvimento de fatores na regulação de HSC por experimentos de resgate em linhagens com genes nulos (KO).
- Valor Operacional: Oferece um sistema reprodutível para verificar alterações na expressão de DNA e resultados funcionais, como formação de colônias, reduzindo a dependência de modelos in vivo custosos.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos mecanicistas ao associar perturbações moleculares a resultados funcionais de HSC, como a capacidade de reconstituição.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera leituras quantitativas e multicelulares, incluindo colônias CFU-E, CFU-GM e megacariócitos, para avaliar os efeitos do composto na diferenciação de HSC.
- Valor Operacional: Padroniza a avaliação funcional de HSC por meio da contagem de unidades formadoras de colônias após 7–10 dias, permitindo a ampliação do ensaio em bibliotecas de compostos.
- Valor Traducional: Prepara populações validadas de HSC para estudos downstream de transplante, conectando a descoberta à validação pré-clínica.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Mantém a relevância para a doença ao preservar o nicho hematopoiético embrionário, permitindo o estudo dos mecanismos de desenvolvimento de HSCs em mamíferos.
- Valor Operacional: Apoia a continuidade do descobrimento ao trabalho pré-clínico ao gerar HSCs transplantáveis com potencial de reconstituição comprovado em receptores irradiados.
- Mitigação de Riscos: Permite a validação funcional de alvos antes de estudos in vivo custosos, melhorando a confiança nas decisões de prosseguimento ou interrupção.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O cultivo de explantes de AGM insere-se no continuum de descoberta, desde a identificação de alvos até a otimização de compostos líderes e a validação pré-clínica, especialmente para programas de hematopoiese e medicina regenerativa.
- Biologia da Descoberta: Facilita a testagem de hipóteses sobre vias de sinalização e reguladores transcricionais que afetam o surgimento e a expansão de HSC.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos baseados em fluorescência ou microscopia que apoiam a análise de resposta à dose e a confirmação de alvos positivos.
- Análises: Permite avaliação multiparamétrica por meio da expressão de mRNA/proteína (por exemplo, Runx1), morfologia de colônias e unidades de repovoamento in vivo.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas mecanicistas à continuidade pré-clínica por meio da reconstituição de longo prazo demonstrada em modelos de transplante competitivo.
- Reutilização Empresarial: Atua como uma plataforma reutilizável para validação iterativa de alvos em múltiplos projetos nas áreas terapêuticas de células-tronco e distúrbios sanguíneos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança no alvo ao vincular intervenções moleculares a fenótipos funcionais de HSC em um sistema desenvolvimentalmente preciso.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade por meio de protocolos padronizados de isolamento, cultura e dissociação de explantes, reduzindo a variabilidade em ensaios funcionais.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir a redução de riscos em estágios iniciais de alvos de HSC, minimizando falhas tardias decorrentes da falta de compreensão mecanicista.
- Impacto na Carteira: Apoia a priorização ajustada ao risco ao fornecer dados funcionais sobre a capacidade de autorrenovação e diferenciação de HSC para classificação de alvos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em dissecação embrionária e técnicas microcirúrgicas para isolar a região AGM sem contaminação por tecidos adjacentes.
- Depende de infraestrutura estéril para cultivo celular, incluindo incubadoras de CO2, placas com superfície não aderente e filtração estéril para meio e reagentes.
- Necessita padronização entre equipes quanto ao posicionamento dos explantes, tempo de digestão com colagenase e critérios de contagem de colônias para garantir comparabilidade dos dados.
- A adaptação a modelos não murinos pode ser limitada pelo tempo embrionário e pela acessibilidade tecidual específicos de cada espécie, exigindo validação em cada sistema.
- As limitações práticas incluem a janela embrionária estreita (E10,5–E11,5 em camundongos) para o isolamento da AGM, o que afeta a produtividade e o planejamento em campanhas de descoberta.
