Name: Aplicação do sistema de cultura Aorta-gônada-mesonephros explante na hematopoiese do desenvolvimento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Aprenda a usar o sistema de cultura de explante AGM para estudar a hematopoiese do desenvolvimento e identificar reguladores críticos das células-tronco hematopoéticas em mamíferos.

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Agradecemos Suwei Gao para ajudar na preparação de figura. Este trabalho foi apoiado por concessões do Nacional Natural Science Foundation da China (81530004, 31425016) e o Ministério da ciência e tecnologia da China (2016YFA0100500). J.L. realizou os experimentos e elaborou o manuscrito; F.L. editado o manuscrito. Ambos os autores ler e aprovaram o manuscrito final.

todos os procedimentos, incluindo assuntos animais foram aprovados pelo Comitê de revisão ética no Instituto de Zoologia, da Academia Chinesa de Ciências, Beijing, China.
 1. preparação de material <ol><li>esterilize a 0,65 µm filtros com ultravioleta raios produzidos sob o ultravioleta raio lâmpada no banco limpo para 4h e entregar os filtros após a marca de 2 h. 
	Nota: Ao trabalhar com luz UV, use proteção adequada.</li>
	<li>Esterilizar as malhas de aço inoxidável com o esterilizador autoclave a 121 ° C por 30 minutos. 
	Nota: Uma certa altura, de malha de aço inoxidável é necessário para suportar os filtros na interface ar-líquido, e isto pode ser realizado com o fio sobre a malha de aço ( Figura 1 A).</li>
	<li>Fluoxetine diluir para uma concentração final de 10 µM em longo prazo o M5300 cultura médio e mistura uniformente. 
	Nota: Para uma placa de seis, meio de cultura a longo prazo 2 mL M5300 é apropriado para cada poço. Hidrocortisona em 10 -6 M pode ser seletivamente diluída no meio de.</li>
	<li>Transferir o suplementado com fluoxetina em 10 µM em placas boas seis ou pratos e coloque as malhas de inox esterilizados no meio de.</li>
	<li>Lavar os filtros de 0,65 µm com água a ferver duas vezes por 3 minutos cada vez que a placa de cultura de células de vidro para esterilização. Depois de cada lavagem, colocar os filtros em tampão fosfato salino (PBS) para 2 min. e lugar molhado filtros para o aço inoxidável malhas permanente na interface ar-líquido, como mostrado na Figura 1 A [esquemático no centro]. 
	Nota: A água a ferver pode ser gerada com o esterilizador autoclave para alcançar a assepsia e equipamento deve ser retirado esterilizador autoclave em tempo hábil para evitar uma diminuição na temperatura.</li>
</ol> 2. Cultura de explantes AGM <ol><li>cuidadosamente separar regiões AGM os embriões no E10.5 ou E11 com fórceps.
	<ol><li>Tira o útero de ratos grávidas com a tesoura de dissecação e separar os embriões no útero.</li>
		<li>Limpe o saco vitelino, cordão umbilical e vísceras do corpo do embrião.</li>
		<li>Remover cuidadosamente o nervo dorsal tecidos e tecidos musculares circundantes.</li>
		<li>Corte fora os tecidos com a pinça no local dos membros anteriores e posteriores e separa a região AGM do corpo do embrião. figuras 1 B-C mostra a representação esquemática e morfologia de AGM dissecado.</li>
	</ol></li> <li>Explant as AGMs dissecados separadamente para os filtros na interface ar-líquido ( Figura 1 A) e cultura em 5% CO 2 a 37 ° C durante 2-3 dias. 
	Nota: Não coloque o AGM dissecado para o fio da malha aço e verifique se que os filtros estão na interface ar-líquido durante a cultura. Além da AGM, saco vitelino e fígado fetal também podem ser cultivados com este sistema 7.</li>
</ol> 3. Análises de expressão <ol><li>nível de mRNA <ol><li>recolher os AGMs cultivadas em 1 mL de PBS e centrifugar a 4 ° C, 310 x g, durante 6 min.</li>
		<li>Após a remoção do sobrenadante, o RNA total é extraído os AGMs coletados com uma solução monofásica de fenol, de acordo com o fabricante &#39; instruções de s.</li>
		<li>RNA total (2 µ g) Então é reverso transcrito usando M-MLV reverse transcriptase para obter o cDNA como modelo. Os ensaios PCR quantitativos em tempo real são executados com SYBR Green e Gapdh é usado como o controle interno.</li>
	</ol></li> <li>Nível de proteína <ol><li>recolher o AGM cultivada conforme descrito acima na etapa 3.1.1.</li>
		<li>Preparar a proteína de AGM cultivada com a lise celular (10 mM Tris-HCl 10 mM NaCl e 0,5% NP-40) contendo inibidor da protease e uso para a mancha ocidental para detectar o nível de proteína, como anteriormente descrito 13.</li>
	</ol></li></ol> 4. Unidades formadoras de colônia no ensaio de cultura (CFU-C) <ol><li>após 2-3 dias de cultivo, coletar as regiões AGM em 1ml tamponado fosfato salino (PBS) e centrifugar a 4 ° C, 310 x g, durante 6 minutos e dissociar com colagenase de 200 µ l (0,1% em PBS) em 37 ° C. 
	Nota: O tempo necessário para colagenase gerar única-suspensões celulares é cerca de 20 minutos. Agitando o tubo contendo AGM cada 5 mins pode acelerar o processo de digestão. Colagenase de 0.1% 200 µ l é usado para cada AGM e 200 µ l de soro de 10% é usado para parar a reação.</li>
	<li>Cultura única-suspensões celulares em meio de M3434 em placas de 24 poços fixação ultra baixo. 
	Nota: Para evitar contaminação, solução de penicilina-estreptomicina pode ser seletivamente adicionada no meio de. Porque o meio de M3434 é viscoso, uma 1,0 cc seringa sem agulha é usada para misturar as células e o meio.</li>
	<li>Após 7 - 10 dias de cultivo em 37 ° C em 5% CO 2, o número para cada tipo de colônias, incluindo o estouro formando unidade - eritroide (BFU-E), CFU-granulo-monócitos (CFU-GM) e CFU-granulócitos, eritrócitos, macrófagos, megacariócito (CFU-GEMM) são distinguidos com base na morfologia e marcou com um microscópio invertido ( Figura 2 C).</li>
</ol> 5. Na Vivo Ensaio de transplante <ol><li>formadoras de Colônia (CFU-S) unidades-baço ensaio <ol><li>após 2 - 3 dias de cultivo de explante, coletar os AGMs e preparar única célula-suspensões incubando com colagenase de 200 µ l (0,1% em PBS) por 20 min.</li>
		<li>Realizar irradiação letal (9 Gy de raios-x) de 8 a 10 - semana de idade camundongos C57BL/6 machos 4-5h antes da injeção celular.</li>
		<li>Colocar o mouse irradiado em uma retenção restringir sua atividade.</li>
		<li>Limpar o rabo usando um cotonete de algodão embebido em álcool 75% para promover vasodilatação da veia.</li>
		<li>Injetar 0,5 equivalente de embrião (ee) ou 1 ee único-suspensões celulares de AGM por via intravenosa na veia da cauda do rato irradiado com uma seringa de 1,0 ml. 
		Nota: As células são suspensos com PBS e 0,5 mL de PBS por destinatário é um volume adequado. Uma agulha de calibre 25 ou 26 gauge tamanho é usada para a injeção com uma 1,0 cc seringa. Sem ar pode ser introduzido para a seringa. Pressione o local da injeção com um cotonete anti-séptico para parar o sangramento.</li>
		<li>Onze dias pós transplante, recolher e corrigir os baços dos ratos destinatários em Bouin &#39; s solução (solução aquosa de ácido pícrico de 1,22% saturado de 15 mL, 2 mL de metanol de 40% e 1 mL de ácido acético) por 1-2 dias e lave-a com 80% de álcool por mais 1-2 dias. Contar as colônias visíveis no baço macroscopicamente e determinar o número de colónias por ee. 
		&#8203; Nota: Bouin &#39; fixador de s, desgaste de proteção apropriado.</li>
	</ol></li> <li>Ensaio a longo prazo do transplante <ol><li>após 2-3 dias de explantes de cultivo, coletar os AGMs e preparar única célula-suspensões incubando com colagenase de 200 µ l (0,1% em PBS) por 20 min.</li>
		<li>Realizar irradiação letal (9 Gy de raios-x) de 8 a 10 - semana de idade camundongos C57BL/6 machos 4-5 hrs antes da injeção celular.</li>
		<li>Colocar o mouse irradiado em uma retenção restringir sua atividade.</li>
		<li>Limpar o rabo usando um cotonete de algodão embebido em álcool 75% para promover vasodilatação da veia.</li>
		< lEu > injetar 0,5 embrião equivalente (ee) ou 1 ee única suspensões celulares de AGM por via intravenosa na veia de cauda de um rato irradiado com uma seringa de 1,0 ml. AGM são injetados na dose de 1 ee por destinatário com 2 × 10 5 células da medula óssea (fundo CD45.1). 
		Nota: Falta de ar pode ser introduzido para a seringa. Pressione o local da injeção com um cotonete anti-séptico para parar o sangramento.</li>
		<li>Pós-transplante de quatro meses, coletar a medula óssea do receptor e usá-lo para o ensaio de reconstituição por FACS. Apenas os destinatários com &#8805; quimerismo doador-derivado de 10% são considerados a exibir reconstituição bem-sucedida.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cells+derive+directly+from+aortic+endothelium+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development.</a> Nature. 464, 108-111 (2010).</li>
<li>Boisset, J. C., Robin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+founder+of+adult+hematopoiesis+in+the+mouse+embryo+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">Imaging the founder of adult hematopoiesis in the mouse embryo aorta.</a> Cell cycle. 9, 2489-2490 (2010).</li>
<li>Kissa, K., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+stem+cells+emerge+from+aortic+endothelium+by+a+novel+type+of+cell+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition.</a> Nature. 464, 112-115 (2010).</li>
<li>Zovein, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+tracing+reveals+the+endothelial+origin+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 625-636 (2008).</li>
<li>Kumaravelu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+developmental+anatomy+of+definitive+haematopoietic+stem+cells+long-term+repopulating+units+%28HSC%2FRUs%29%3A+role+of+the+aorta-gonad-mesonephros+%28AGM%29+region+and+the+yolk+sac+in+colonisation+of+the+mouse+embryonic+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver.</a> Development. 129, 4891-4899 (2002).</li>
<li>Orkin, S. H., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoiesis%3A+an+evolving+paradigm+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology.</a> Cell. 132, 631-644 (2008).</li>
<li>Medvinsky, A., Dzierzak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definitive+hematopoiesis+is+autonomously+initiated+by+the+AGM+region%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region.</a> Cell. 86, 897-906 (1996).</li>
<li>Peeters, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventral+embryonic+tissues+and+Hedgehog+proteins+induce+early+AGM+hematopoietic+stem+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ventral embryonic tissues and Hedgehog proteins induce early AGM hematopoietic stem cell development.</a> Development. 136, 2613-2621 (2009).</li>
<li>Taoudi, S., Medvinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+identification+of+the+hematopoietic+stem+cell+niche+in+the+ventral+domain+of+the+embryonic+dorsal+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Functional identification of the hematopoietic stem cell niche in the ventral domain of the embryonic dorsal aorta.</a> PNAS. 104, 9399-9403 (2007).</li>
<li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+and+Hedgehog+Regulate+Distinct+AGM+Hematopoietic+Stem+Cells+Ex+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">BMP and Hedgehog Regulate Distinct AGM Hematopoietic Stem Cells Ex Vivo.</a> Stem Cell Reports. 6, 383-395 (2016).</li>
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<li>Fleury, M., Petit-Cocault, L., Clay, D., Souyri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mpl+receptor+defect+leads+to+earlier+appearance+of+hematopoietic+cells%2Fhematopoietic+stem+cells+in+the+Aorta-Gonad-Mesonephros+region%2C+with+increased+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mpl receptor defect leads to earlier appearance of hematopoietic cells/hematopoietic stem cells in the Aorta-Gonad-Mesonephros region, with increased apoptosis.</a> Int J Dev Biol. 54, 1067-1074 (2010).</li>
<li>Lv, J., Wang, L., Gao, Y., Ding, Y. Q., Liu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-hydroxytryptamine+synthesized+in+the+aorta-gonad-mesonephros+regulates+hematopoietic+stem+and+progenitor+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">5-hydroxytryptamine synthesized in the aorta-gonad-mesonephros regulates hematopoietic stem and progenitor cell survival.</a> J Exp Med. 214, 529-545 (2017).</li>
<li>Souilhol, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inductive+interactions+mediated+by+interplay+of+asymmetric+signalling+underlie+development+of+adult+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Inductive interactions mediated by interplay of asymmetric signalling underlie development of adult haematopoietic stem cells.</a> Nature communications. 7, 10784(2016).</li>
<li>Fitch, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+from+the+sympathetic+nervous+system+regulates+hematopoietic+stem+cell+emergence+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Signaling from the sympathetic nervous system regulates hematopoietic stem cell emergence during embryogenesis.</a> Cell Stem Cell. 11, 554-566 (2012).</li>
<li>Bianchi, M., Moser, C., Lazzarini, C., Vecchiato, E., Crespi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forced+swimming+test+and+fluoxetine+treatment%3A+in+vivo+evidence+that+peripheral+5-HT+in+rat+platelet-rich+plasma+mirrors+cerebral+extracellular+5-HT+levels%2C+whilst+5-HT+in+isolated+platelets+mirrors+neuronal+5-HT+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Forced swimming test and fluoxetine treatment: in vivo evidence that peripheral 5-HT in rat platelet-rich plasma mirrors cerebral extracellular 5-HT levels, whilst 5-HT in isolated platelets mirrors neuronal 5-HT changes.</a> Exp Brain Res. 143, 191-197 (2002).</li>
<li>Ortiz, J., Artigas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+monoamine+uptake+inhibitors+on+extracellular+and+platelet+5-hydroxytryptamine+in+rat+blood%3A+different+effects+of+clomipramine+and+fluoxetine%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Effects of monoamine uptake inhibitors on extracellular and platelet 5-hydroxytryptamine in rat blood: different effects of clomipramine and fluoxetine.</a> Br J Pharmacol. 105, 941-946 (1992).</li>
<li>Wong, D. T., Horng, J. S., Bymaster, F. P., Hauser, K. L., Molloy, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+selective+inhibitor+of+serotonin+uptake%3A+Lilly+110140%2C+3-%28p-trifluoromethylphenoxy%29-N-methyl-3-phenylpropylamine%5BTitle%5D)+AND+%22Life+sciences%22%5BJournal%5D)">A selective inhibitor of serotonin uptake: Lilly 110140, 3-(p-trifluoromethylphenoxy)-N-methyl-3-phenylpropylamine.</a> Life sciences. 15, 471-479 (1974).</li>
<li>Chen, M. J., Yokomizo, T., Zeigler, B. M., Dzierzak, E., Speck, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Runx1+is+required+for+the+endothelial+to+haematopoietic+cell+transition+but+not+thereafter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Runx1 is required for the endothelial to haematopoietic cell transition but not thereafter.</a> Nature. 457, 887-891 (2009).</li>
<li>Rybtsov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+organization+and+early+hematopoietic+specification+of+the+developing+HSC+lineage+in+the+AGM+region%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region.</a> J Exp Med. 208, 1305-1315 (2011).</li>
<li>Muthuswamy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bringing+together+the+organoid+field%3A+from+early+beginnings+to+the+road+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Bringing together the organoid field: from early beginnings to the road ahead.</a> Development. 144, 963-967 (2017).</li>
</ol>

Os autores têm sem conflitos de interesses financeiros.

É sabido que linfócitos maduros na medula óssea podem repovoar o sistema sanguíneo de destinatários irradiados. Ao contrário destes linfócitos funcionais, os linfócitos emergentes em assembleia geral de embriões do rato são imaturos. Resultados de transplante direto mostraram esse tipo eu (VE-cad+ CD45– CD41+) e tipo II (VE-+ CD45 cad+) pré-linfócitos possuem nenhuma capacidade de reconstituição20. Aproveitando o sistema de cultura de explant ...

Células-tronco hematopoiéticas (linfócitos) são células-tronco tecido-específica adultas que possuem potencial multilineage incluindo eritroide, mieloide e células linfoides, bem como a capacidade de se renovar. Estudos recentes têm mostrado que os primeiros linfócitos surgiram de uma população endotelial especializada, conhecida como endotélio hemogenic (ele), através o endotelial de transição hematopoiética (EHT) na parede ventral da aorta dorsal1,2 ,3,4. Uma vez formado na aorta-gônada-mesonephros (AGM) região de embrionária (E) 10.5 para E12.5 do embrião de rato, linfócitos irão migrar para o fígado fetal para expansão e finalmente colonizar a medula óssea para manter a hematopoiese adulta ao longo da vida do indivíduo 5 , 6. embora isto tem sido estudado por muitos anos, os mecanismos subjacentes de HSC surgimento e desenvolvimento permanecem incompletamente compreendidos.
Ao contrário de fertilização in vitro e desenvolvimento de embriões de peixe-zebra, desenvolvimento intra-uterino de embriões do rato torna o estudo da hematopoiese definitivo durante a embriogênese muito mais inconveniente. Apesar de experiências genéticas usando camundongos nocaute (KO) são comumente utilizadas, a falta de alguns ratos KO também limita a sua utilização no campo de pesquisa hematopoiéticas. Além disso, na vivo experiências de resgate não são facilmente realizadas em camundongos KO. Desde 1996, a cultura de explant AGM foi desenvolvida para estudos hematopoiéticos pelos pioneiros no campo7. Com a ajuda deste sistema de cultura, tecidos ventrais da região AGM foram identificados para promover a atividade HSC, enquanto tecidos dorsais exercem um oposto efeito8,9. O sistema de cultura de explant AGM também foi aplicado para determinar as funções da serotonina, Mpl, SCF, BMP e ouriço sinalização em HSC desenvolvimento10,11,12,13, 14. importante, é também um método popular usado para resgatar hematopoiéticos defeitos em embriões mutantes13,15.

<table><tbody><tr><td>durapore 0,65 &micro; filtros</td><td>Millipore</td><td>R5BA63787</td><td>AGM explante cultura</td></tr><tr><td>M5300 meio de cultura de longo prazo</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5300</td><td>AGM explante cultura</td></tr><tr><td>Trizol&nbsp;</td><td>Tiangen</td><td>5829</td><td>extração de RNA</td></tr><tr><td>M-MLV transcriptase reversa</td><td>Promega</td><td>90694</td><td>transcrição reversa</td></tr><tr><td>SYBR Green</td><td>Qiagen</td><td>A6002</td> quantitativo PCR em <td>tempo real</td></tr><tr><td>inibidor de protease</td><td>Roche</td><td>55622</td><td>Extração de</td></tr><tr><td>proteínas colagenase</td><td>Sigma</td><td>C2674</td><td>digestão de tecidos AGM</td></tr><tr><td>MethoCult GF M3434 médio</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>3434</td><td>Ensaio CFU-C</td></tr> fixação <tr><td>ultrabaixa Placas de 24 poços</td><td>Costar</td><td>3473</td><td>Ensaio CFU-C</td></tr><tr><td>Camundongos C57BL/6 CD45.2</td><td>Pequim HFK Bioscience Co. Ltd</td><td></td><td>Ensaio CFU-S</td></tr><tr><td>C57BL/6 CD45.1 camundongos</td><td>Pequim HFK Bioscience Co. Ltd</td><td></td><td>Transplante de longo prazo</td></tr><tr><td>fosfato tamponado solução salina</td><td>Life Technologines</td><td>Coleção 8115284</td><td>AGM</td></tr><tr><td>Solução de penicilina-estreptomicina</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td>AGM explante cultura</td></tr><tr><td>anti-CD45.2-PE-CY7</td><td>eBioscience</td><td>25-0454-80</td><td>Transplante de longo prazo</td></tr><tr><td>anti-CD45-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0451-81</td><td>Lâmpada UV de transplante de longo prazo</td></tr><tr><td></td><td>Beijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD</td><td>039-14402</td><td>potência: 30W</td></tr><tr><td>malha de aço inoxidável</td><td>AS ONE SHANGHAI Corporation</td><td>2-9817-10&nbsp;</td><td>Diâmetro da abertura: 2,5 mm</td></tr><tr><td>hidrocortisona</td><td>Sigma</td><td>H0396</td><td>seletivamente diluída em meio M5300</td></tr></tbody></table>

aplicação do sistema de cultura aorta-gônada-mesonephros explante na hematopoiese do desenvolvimento

Application of Aorta-gonad-mesonephros Explant Culture System in Developmental Hematopoiesis

A limitação do uso de embriões do rato para estudos de hematopoiese é o inconveniente adicional nas operações, que é em grande parte devido ao desenvolvimento intra-uterino do embrião. Embora os dados genéticos de camundongos nocaute (KO) são convincentes, não é realista para gerar camundongos KO para todos os genes, conforme necessário. Além disso, realizando na vivo resgate experiências para consolidar os dados obtidos de camundongos KO não é conveniente. Para superar essas limitações, a cultura de explante de Aorta-gônada-Mesonephros (AGM) foi desenvolvida como um sistema adequado para estudar o desenvolvimento de células-tronco hematopoiéticas (HSC). Especialmente para as experiências de resgate, ele pode ser usado para recuperar a hematopoiese prejudicada em camundongos KO. Adicionando os produtos químicos apropriados entram no meio, a sinalização deficiente pode ser reactivada ou vias acima-regulada podem ser inibidas. Com o uso desse método, muitos experimentos pode ser realizada para identificar os reguladores críticos de desenvolvimento do HSC, incluindo HSC relacionados a expressão gênica em níveis de mRNA e proteína, capacidade de formação de colônia e capacidade de reconstituição. Esta série de experimentos seria útil na definição dos mecanismos subjacentes essenciais para o desenvolvimento de HSC em mamíferos.

Uma publicação recente relatado serotonina derivado de células endotelial promove a sobrevivência de linfócitos inibindo o caminho pro-apoptotic no AGM13. Para confirmar o efeito de promoção de serotonina no desenvolvimento de HSC, fluoxetina foi incluída. Como um inibidor de recaptação de serotonina (ISRS), fluoxetina foi demonstrada para inibir a reabsorção de serotonina em tecidos periféricos16,17,<...

Este protocolo descreve o uso culto Aorta-gônada-Mesonephros para análises de expressão, unidades formadoras de colônia, na cultura e baço e reconstituição de longo prazo para determinar o efeito de fatores regulatórios e vias de sinalização no tronco hematopoiético desenvolvimento da célula. Isto foi demonstrado como um sistema eficaz para estudar a função e biologia de células-tronco hematopoiéticas.

Aplicação do sistema de cultura Aorta-gônada-mesonephros explante na hematopoiese do desenvolvimento

The limitation of using mouse embryos for hematopoiesis studies is the added inconvenience in operations, which is largely due to the intrauterine ...

O objetivo geral deste experimento é usar uma cultura de explante aorta-gônada-mesonefros para investigar os reguladores críticos do desenvolvimento de células-tronco hematopoiéticas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na biologia das HSCs e nos campos de função sobre como identificar os fatores envolvidos na regulação do desenvolvimento das HSC em mamíferos. A principal vantagem desta técnica é que esses reguladores podem ser verificados através da análise da expressão de DNA e da capacidade de formação de colônias e da capacidade de reconstituição do HSC.Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque a separação precisa da AGM dos tecidos circundantes na região do tronco requer prática para dominar. Antes de iniciar o procedimento, coloque malhas de aço inoxidável em poços individuais de uma placa de seis poços contendo dois mililitros de meio suplementado com fluoxetina recém-preparado por poço. Coloque um filtro de 0,65 microlitro esterilizado por UV por poço experimental em uma placa de cultura de células de vidro contendo água fervente fresca por duas lavagens de três minutos, imergindo os filtros em um recipiente de PBS em temperatur

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

mStrawberry OP9 células permitir uma avaliação completa de todos os descendentes ES-derivados de co-cultura.

Modificado ES / OP9 Co-Protocol Cultura Fornece Caracterização melhorada de Progênie Hematopoiéticas

Um sistema de cultura de 3D para a hematopoiese é descrito usando sangue do cordão umbilical humano e células de medula óssea leucémicas. O método baseia-se na utilização de um poliuretano poroso sintético andaime revestido com proteínas da matriz extracelular. Este andaime é adaptável para acomodar uma grande variedade de células.

Ex vivo Mimetismo de normal e anormal Hematopoese Humanos

Este protocolo descreve a dissecção do anlagen da tireoide embrionária de camundongo e a cultura de explantes em filtros semiporosos ou em lâminas plásticas de microscopia. Este sistema é ideal para estudar eventos morfogenéticos ou de diferenciação que ocorrem durante o desenvolvimento da tireoide de embriões selvagens ou knockout, e é passível de experimentos de ganho e perda de função.

Uma<em&gt; Ex vivo</em&gt; Sistema Cultura para estudar o desenvolvimento da tireóide

A cultura de gotículas verticais ex vivo é uma alternativa às técnicas experimentais atuais in vitro e in vivo. Este protocolo é fácil de executar e requer quantidades menores de reagente, ao mesmo tempo em que permite a capacidade de manipular e estudar a vascularização, morfogênese e organogênese fetal.

Usando<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culturas Vertical Gota de toda fetais Órgãos para estudar processos de desenvolvimento durante Rato Organogenesis

Este protocolo descreve um método para isolar e cultivar rudimentos metanefricos de embriões de ratinho.

Dissecção e cultura do rim embrionário do rato

Protocolos para o estudo da aorta murino embrionária e perinatal usando na vivo clonal análise e mapeamento de destino, explantes aórtica e isolado músculo liso, células são detalhadas aqui. Essas diversas abordagens facilitam a investigação sobre a morfogênese da aorta no normal desenvolvimento embrionária e perinatal e a patogênese na doença.

Usando In Vivo e tecido e célula explante abordagens para estudar a morfogênese e a patogênese da Aorta embrionária e Perinatal

Aqui apresentamos a metodologia para a análise clonal de precursores de células-tronco hematopoéticas durante o desenvolvimento embrionário murino. Combinamos que o índice de classificação de células únicas da região de aorta-gônada-mesonephros embrionária com co-cultura de células endoteliais e transplante para caracterizar as propriedades fenotípicas e potencial de enxertia de precursores hematopoiéticos único.

Análise clonal de precursores embrionárias células-tronco hematopoiéticas usando índice de célula única classificação combinada com células endoteliais nicho co-cultura

Este artigo fornece uma abordagem atualizada para o sistema de Quimera de codorna-galinha clássica para estudar a formação do órgão, combinando procedimentos experimentais in vitro e in ovo romance.

Abordagem em duas fases para explorar e tarde-estágios iniciais de formação do órgão no modelo aviária: O Timo e glândulas paratireoides organogênese paradigma

Este trabalho descreve dois métodos para estudar o desenvolvimento de órgãos, uma melhor configuração de xenotransplante na membrana corioallantoica (CAM) a partir de embriões aviários que permite a vascularização de órgãos e organóides embrionários cultivados e uma nova direção fixa z método de cultura de órgãos com condições experimentais modificadas que permite imagens confocais de lapso de tempo de alta resolução.

Otimização da Cultura Organóide Renal e Organotípica para Vascularização, Desenvolvimento Estendido e Imagem Microscopia Aprimorada

Aqui, são descritos quatro métodos para a geração de organoides testiculares testiculares de células testiculares neonatais primárias, ou seja, matriz extracelular (ECM) e ambientes de cultura 2D e 3D livres de ECM. Essas técnicas possuem múltiplas aplicações de pesquisa e são especialmente úteis para estudar desenvolvimento testicular e fisiologia in vitro.

Geração extra-baseada em matriz celular e extra-celular livre de organoides testiculares de murina

Aqui, estabelecemos osteo-organoides in vivo desencadeados por andaimes de gelatina carregados com proteína 2 morfogenética óssea para colher células-tronco / progenitoras hematopoiéticas terapêuticas para a reconstrução de um sistema hematopoiético e imunológico danificado. No geral, essa abordagem pode fornecer uma fonte celular promissora para terapias celulares.

Abordagem osteoorganoide in vivo para coleta de células-tronco/progenitoras hematopoiéticas terapêuticas

Aprenda a usar o sistema de cultura de explante AGM para estudar a hematopoiese do desenvolvimento e identificar reguladores críticos das células-tronco hematopoéticas em mamíferos.

Aplicação do sistema de cultura Aorta-gônada-mesonephros explante na hematopoiese do desenvolvimento

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