Name: Se movendo para cima: Um simples e flexível em Vitro invasão tridimensional protocolo do ensaio (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Aprenda o ensaio de invasão vertical invertido para quantificar migração e invasão de células raras e sensíveis em ambiente 3D. Este método preserva o microambiente celular e auxilia na pesquisa do câncer.

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Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (NIMHD-G12MD007581), através do RCMI-centro de saúde ambiental da Universidade de estado de Jackson e o departamento E.U. de defesa, prêmio Idea 11-1-0205.

Nota: Este protocolo é descrito no McArdle et al . 11. um cronograma é fornecido na Figura 1.
1. preparação da placa de cultura
<ol><li>Lave o prato de 35mm cultura contendo um vidro de 10 mm-fundo bem com 1 mL de ácido clorídrico de 1 M (HCl) por 15 min abaixar a hidrofobicidade do vidro-fundo.</li>
	<li>Lave a placa de cultura duas vezes com 1 mL de solução salina tampão de fosfato (PBS) para se livrar de todo o HCl.</li>
	<li>Lave a placa de cultura duas vezes com 1 mL de etanol a 70%.</li>
	<li>Lave a placa de cultura com 1 mL de meio de cultura celular específica (aqui, uso α-MEM suplementado com 10% de calor inativada FBS e 1% não aminoácidos essenciais). Nota: A placa de cultura tratada contendo meio de cultura pode ser armazenada a incubadora de CO2 com um humidificador a 37 ° C até o dia seguinte.</li>
	<li>Crescem as células (MSCs e cultura co MCF-7) em vidro-fundo tratado bem do prato 35mm cultura a confluência de 100%. Co cultura 35.000 células MSC e 75.000 de células MCF7 por 24 h.</li>
</ol>2. preparação do gel de colágeno
<ol><li>Armazene as pontas de micropipeta usadas para pipetar o gel de colágeno no congelador para evitar a polimerização do colágeno em cima do contato. Nota: Este é o passo mais crítico.</li>
	<li>Determinar um volume de colágeno de cauda de rato eu deve ser usado com base na concentração do estoque de colágeno. Prepare-se 100 µ l de gel de colágeno para este ensaio. Nota: Alta concentração de colágeno de cauda de rato que armazeno funciona melhor. Determine o volume de 10 x meio modificado águia de Dulbecco a ser usado para diluir o colágeno em conformidade.</li>
	<li>Combine, colágeno de cauda de rato gelo I (3.8 µ g/mL caldo), médio modificado águia de 10 x Dulbecco e 1 x celular cultura suplementado com 2% de soro fetal bovino e o apropriado quimiotático para uma concentração final de colágeno de 2,4 mg/mL.</li>
	<li>Adicione à mistura 4.5% da solução de bicarbonato de sódio para neutralizar o gel de colágeno. Nota: O volume de solução de bicarbonato de sódio adicionado pode variar de acordo com o pH exato dos outros reagentes. É melhor para testar a mistura com tiras de pH para garantir solução neutra, ou usar um indicador de pH do meio de cultura.</li>
	<li>Disponha as células dentro do vidro-fundo bem do prato cultura 80 µ l da mistura de colágeno.</li>
	<li>Permitir que o gel de colágeno polimerizar durante 30 min numa incubadora de CO2 com um humidificador a 37 ° C.</li>
	<li>Cubra o gel de colágeno com 2 mL de meio de celular com soro reduzido (2%) e incube as celulas a 37 ° C, uma incubadora de CO2 com um umidificador para 24, 48 ou 72 h. Atenção: A placa deve ser manipulada com cuidado para evitar que o gel de colágeno desanexação da parte inferior do vidro.</li>
</ol>3. exemplo de preparação de colágeno gel usando um estoque de colágeno de cauda de rato de 3.8 µ g /mL
<ol><li>No gelo, combine 114.5 µ l de colágeno de cauda de rato, 16,6 µ l de 10 x DMEM e 33,1 µ l de meio de cultura contendo o quimiotático.</li>
	<li>Neutralize a mistura de colágeno com 14,0 µ l de bicarbonato de sódio.</li>
	<li>Continue como na etapa 2.5.</li>
</ol>4. imagem latente das células
<ol><li>Remova cuidadosamente a mídia do prato.</li>
	<li>Lave suavemente o gel com 1 mL de PBS.</li>
	<li>Fixe as células com 1 mL de paraformaldeído 4% por 15 min.</li>
	<li>Lave as células duas vezes com 1 mL de PBS.</li>
	<li>Manche as células com solução DAPI (100 ng/mL) por 20 min em temperatura ambiente.</li>
	<li>As células usando um microscópio confocal em locais diferentes e tomar 400 µm z-pilha imagens de cada local em 16 µm passos da imagem. O microscópio usado tem um disco de unidade que permite que a imagem latente confocal usando uma luz branca, fonte de excitação do arco de digitalização. Use um 20 X lente utilizada com abertura numérica de 0,75.</li>
	<li>Imagens de reconstituir.<ol>
<li>Abrir imagens para um determinado gel (aproximadamente 25 imagens) e criar uma pilha de imagem clicando em imagem → pilhas → imagens de pilha. A primeira imagem que correspondia à parte inferior do gel (z = 0 µm), a segunda imagem correspondeu à primeira etapa na direção z (z = 16 µm), a terceira imagem correspondia à segunda etapa na direção z (z = 32 µm). Avaliar cada núcleo em cada profundidade de imagem e designar a profundidade na qual o núcleo foi em foco mais nítido como a profundidade de invasão para essa célula específica.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Friedl, P., Brocker, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+cell+locomotion+within+three-dimensional+extracellular+matric%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matric.</a> Cell Mol Life Sci. 57, 41-64 (2000).</li>
<li>Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+architecture%3A+the+ultimate+regulator+of+breast+epithelial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function.</a> Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).</li>
<li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-cell+invasion+and+migration%3A+diversity+and+escape+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nat Rev Cancer. 3, 362-374 (2003).</li>
<li>Yarrow, J. C., Perlman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+cell+migration+assay+using+scratch+wound+healing%2C+a+comparison+of+image-based+readout+methods%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparison of image-based readout methods.</a> BMC Biotechnol. 4, 21(2004).</li>
<li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensation+mechanism+in+tumor+cell+migration%3A+mesenchymal-amoeboid+transition+after+blocking+of+pericellular+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis.</a> J Cell Biol. 160, 267-277 (2003).</li>
<li>Sahai, E., Marshall, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differing+modes+of+tumour+cell+invasion+have+distinct+requirements+for+Rho%2FROCK+signalling+and+extracellular+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differing modes of tumour cell invasion have distinct requirements for Rho/ROCK signalling and extracellular proteolysis.</a> Nat Cell Biol. 5, 711-719 (2003).</li>
<li>Kam, Y., Guess, C., Estrada, L., Weidow, B., Quaranta, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+circular+invasion+assay+mimics+in+vivo+invasive+behavior+of+cancer+cell+lines+and+distinguishes+single-cell+motility+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">A novel circular invasion assay mimics in vivo invasive behavior of cancer cell lines and distinguishes single-cell motility in vitro.</a> BMC Cancer. 8, 198(2008).</li>
<li>Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+analysis+of+current+in+vitro+and+in+vivo+angiogenesis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays.</a> Int J Exp Pathol. 90, 195-221 (2009).</li>
<li>Poujade, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+migration+of+an+epithelial+monolayer+in+response+to+a+model+wound%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 15988-15993 (2007).</li>
<li>Noubissi, F. K., Harkness, T., Alexander, C. M., Ogle, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis-induced+cancer+cell+fusion%3A+a+mechanism+of+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Apoptosis-induced cancer cell fusion: a mechanism of breast cancer metastasis.</a> FASEB J. 29, 4036-4045 (2015).</li>
<li>McArdle, T. J., Ogle, B. M., Noubissi, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+In+Vitro+Inverted+Vertical+Invasion+Assay+to+Avoid+Manipulation+of+Rare+or+Sensitive+Cell+Types%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cancer%22%5BJournal%5D)">An In Vitro Inverted Vertical Invasion Assay to Avoid Manipulation of Rare or Sensitive Cell Types.</a> J Cancer. 7, 2333-2340 (2016).</li>
<li>Noubissi, F. K., Ogle, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+Cell+Fusion%3A+Mechanisms+Slowly+Unravel%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Cancer Cell Fusion: Mechanisms Slowly Unravel.</a> Int J Mol Sci. 17, (2016).</li>
<li>Meyvantsson, I., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+models+in+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Cell culture models in microfluidic systems.</a> Annu Rev Anal Chem. 1, 423-449 (2008).</li>
<li>Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+migration+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+In+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Tumor cell migration in three dimensions.</a> Methods In Enzymol. 406, 625-643 (2006).</li>
<li>Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+memory+and+dosing+influence+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Materials%22%5BJournal%5D)">Mechanical memory and dosing influence stem cell fate.</a> Nat Materials. 13, 645-652 (2014).</li>
</ol>

Os autores declararam que nenhum interesse de concorrente existe.

Aqui, descrevemos um ensaio simples invasão vertical invertida que é conveniente para uma variedade de tipos de células, incluindo células que são raras e/ou dependente seu microambiente. Neste ensaio 3D invasão, as células permanecem em seu microambiente original em são cobertas pelo gel de colágeno contendo um quimiotático. As células então migram e invadem em colágeno. Neste ensaio, as células podem ser manchadas e facilmente monitoradas dentro do gel. A simplicidade e a reprodutibilidade deste teste o torna uma ferra...

Motilidade celular é um processo fisiológico e de desenvolvimento normal das células. No entanto, as mudanças no padrão e a capacidade das células para migrar e invadir estão associadas com condições patológicas, incluindo doenças inflamatórias e câncer metástase1,2,3. Metástase é, sem dúvida, o aspecto mais mal compreendido em câncer. Para metástase, as células cancerosas deve degradar a matriz extracelular (ECM), invadir o tecido local e intravasate. Uma vez em circulação, as células cancerosas vão divulgar o site distante, extravasate e formar tumores secundários. Portanto, a capacidade das células para degradar o ECM, para migrar e invadir está relacionada ao seu potencial metastático. Diferentes abordagens têm sido desenvolvidos para analisar e quantificar os recursos de migração e invasão de células. As abordagens mais utilizadas incluem a ferida cura ensaio, microscopia de lapso de tempo e o ensaio de câmara Boyden. A ferida cura ensaio4 e tempo lapso microscopia são ensaios simples e convenientes que dariam preliminar insight sobre migração celular. No entanto, ambos são ensaios 2D que não refletem o ambiente 3D, no qual existem células em vivo. Estudos têm mostrado que as células respondem de forma diferente para um ambiente 3D em comparação com um 2D5,6. Além disso, ensaios de cura ferida são difíceis de reproduzir e produzir resultados quantitativos7,8,9. O ensaio da zona de exclusão de célula, que é uma modificação 3D da ferida do ensaio de cura, é um ensaio mais fisiologicamente relevante, mas não é apropriado para células baixas no número como células híbridas resultantes de célula fusão eventos10,11 .
O ensaio de câmara Boyden é um ensaio 3-dimensional que fornece o microambiente relevantes para estudos celulares. No entanto, requer células para ser removido de seu microambiente original e depositados na câmara superior do sistema de ensaio de Boyden, migrar e invadir para baixo em direção a médio contendo quimiotático. Esta abordagem 3D não é apropriada ao analisar a capacidade de migração e invasão de células vulneráveis ao seu microambiente e/ou limitada em número de11,de10,12. É uma abordagem mais recente para analisar a invasão e a migração celular gradiente câmara microfluidic ensaio13. Embora adequados e fiáveis em estudos de migração e invasão, este ensaio é mais caro e pode ser tecnicamente desafiador para um laboratório típico. Descrevemos aqui um ensaio de invasão vertical invertida simples que é compatível com muitos tipos de células, incluindo células sensíveis ao seu microambiente e/ou limitados em número. Este ensaio foi adaptado a partir do protocolo proposto pela Hooper et al 14. neste ensaio, as células permanecem na sua original microambiente e sua migração e invasão é monitorado como eles se movem para cima no gel de colágeno contendo um quimiotático11. Este ensaio é reprodutível e foi otimizado e validado no prato 35mm cultura. Isso pode ser adaptado às condições de ensaio diferentes incluindo tamanhos de cultura de células diferentes, diferentes matrizes ou força de adesão e diferentes quimioatraentes. Este ensaio poderia servir como uma plataforma em vitro para triagem inicial no processo de descoberta de drogas.

<table><tbody><tr><td>MatTek P35G-1.5-10C</td><td>MatTek Corporation, Ashland, MA</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td>pratos de fundo de vidro fosco</td></tr><tr><td>Colágeno de cauda de rato I</td><td>Corning, Corning, NY, EUA</td><td>354236</td><td>Gel de colágeno</td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 EUA</td><td>H1758</td><td>HCl</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, EUA</td><td>10010023</td><td>Pbs</td></tr><tr><td>10X Dulbecco's Modified Eagle's Medium</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA</td><td>D2429</td><td>10X DMEM</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA</td><td>S5761</td><td>NaHCO3</td></tr><tr><td>Microscópio Fluorescente Confocal</td><td>Olympus America, Center Valley, PA, USA</td><td>Olympus IX81</td><td>Confocal</td></tr> microscópio <tr><td>Soro</td> <td>Fetal Bovino DefinidoGE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, EUA</td><td>SH30070.03</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Ti:Microscópio de varredura a laser multifóton Sapphire</td><td>Prarie Technologies, Sioux Falls, SD, EUA</td><td>40x NA 0.8 objetiva</td><td>MPLSM</td></tr><tr><td>Imaris software</td><td>Bitplane Inc. Zurique, CH</td><td>Imaris 7.5.2</td><td>Software Imaris</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, EUA</td><td>D9542</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, EUA</td><td>50980487</td><td>PFA</td></tr><tr><td>&alfa;-meio essencial mínimo</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, EUA</td><td>M0894</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>ATCC; Manassas, VA, EUA</td><td>HBT-22</td><td></td></tr><tr><td>MSC</td><td>Trivedi e Hematti, lente 20X 2007</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UPLAPO</td><td>Olympus America, Center Valley, PA, USA</td><td>36-064</td><td>Olympus UPLSAPO 20X Objetiva</td></tr></tbody></table>

se movendo para cima: um simples e flexível em vitro invasão tridimensional protocolo do ensaio

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Embora a invasão 3D ensaios têm sido desenvolvidos, persiste o desafio de estudar células sem afetar a integridade do seu microambiente. Ensaios de 3D tradicionais tais como a câmara de Boyden exigem que as células são deslocadas do local cultura original e mudou-se para um novo ambiente. Não só faz isso atrapalhar os processos celulares que são intrínsecos para o microambiente, mas muitas vezes resulta em uma perda de células. Estes problemas são especialmente desafiadoras quando se lida com as células que são raros ou extremamente sensível ao seu microambiente. Aqui, descrevemos o desenvolvimento de um ensaio de invasão 3D que evita as duas preocupações. Neste ensaio, as células são banhadas dentro de um pequeno bem e uma matriz de ECM contendo um quimiotático é colocada no topo das células. Isto requer nenhum deslocamento de célula e permite que as células invadir para cima dentro da matrix. Neste ensaio, invasão da célula, bem como a morfologia da célula pode ser avaliada dentro do gel de colágeno. Usando este teste, podemos caracterizar a capacidade invasiva das células de raras e sensíveis; as células híbridas resultantes da fusão entre células de câncer de mama MCF7 e mesenquimais/multipotentes haste/estroma células (MSCs).

Nós usamos um prato de cultura 35mm com um vidro inferior e rato cauda de colágeno para desenvolver e otimizar uma invasão 3D em vitro ensaio protocolo. Usando este ensaio, nós mostramos aquele peito de células cancerosas MCF7 e MSC células poderiam invadir para o gel de colágeno a uma distância média de 0,04 ± 1,8 µm e 41,3 ± 76.0 µm respectivamente, após 48 h quando IGF1 (18.6 ng/mL) foi usado como quimiotático (Figura 2). Mais importante, nós most...

Este protocolo descreve um ensaio de invasão vertical invertida que poderia ser usado para quantificar os recursos de migração e invasão de células em uma configuração tridimensional, preservando o microambiente celular. Este ensaio é adequado para células raras e/ou sensíveis.

Se movendo para cima: Um simples e flexível em Vitro invasão tridimensional protocolo do ensaio

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

O objetivo geral deste ensaio de invasão é quantificar as capacidades migratórias e invasivas de células raras e sensíveis em um ambiente 3D sem desalojar as células de seu microambiente. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de pesquisa do câncer sobre a capacidade de invasão de eventos sensíveis e artificiais, como o produto de fusão de células cancerígenas. A principal vantagem dessa técnica é que as células são analisadas em seu microambiente original usando uma configuração 3D.As implicações dessa técnica se estendem à terapia do câncer, pois pode ser usada para rastrear agentes farmacológicos capazes de inibir a invasão e metástase de células cancerígenas. A demonstração visual dessa técnica é crítica. A aspiração na temperatura e no pH da mistura de colágeno afeta sua polimerização e o manuseio brusco faz com que o gel se desprenda.Comece tratando uma placa de cultura de 35 milímetros com um fundo de vidro de 10 milímetros com um mililitro de ácido clorídrico molar para diminuir a hidrofobicidade do vidro. Após 15 minutos, lave a placa duas vezes com um mililitro de PBS por lavagem, seguida de uma lavagem com um mililitro de etanol a 70%. Em seguida, enxágue a placa com um mililitro de meio de cultura específico para as células de interesse a serem usadas.E semeie o prato com as células de interesse. Em seguida, coloque a placa em uma incubadora de cultura de células. Quando as células atingirem 100% de confluência, combine 114,5 microlitros de colágeno de cauda de rato recém-preparado, 16,6 microlitros de meio 10 X DMEM e 33,1 microlitros de meio de cultura suplementado com quimio atrativo de interesse em um tubo de microcentrífuga no gelo.Neutralize a mistura de colágeno com 14 microlitros de bicarbonato de sódio e cubra as células com 80 microlitros de gel. Deixe o colágeno polimerizar em uma incubadora umidificada de 37 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono por 30 minutos. Em seguida, coloque dois mililitros de meio de cultura de células séricas reduzido a dois por cento sobre o gel e retorne cuidadosamente as células à incubadora pelo período de tempo experimental apropriado sem desalojar o colágeno.No final da incubação, remova suavemente o meio e enxágue cuidadosamente o gel com um mililitro de PBS. Fixe as células com um mililitro de paraformaldeído a quatro por cento por 15 minutos, seguido de duas lavagens em um mililitro de PBS por lavagem. Em seguida, marque as células com solução de DAPI por 20 minutos em temperatura ambiente e obtenha imagens da invasão tridimensional de colágeno in vitro por microscopia confocal.Aqui, é mostrada a quantificação da invasão do gel de colágeno por uma linhagem celular de câncer de mama e produtos de fusão de células de câncer de mama em resposta a um atrativo de quimioterapia durante um período de migração de 48 horas. Notavelmente, a migração de produtos raros de fusão de células de câncer de mama para o gel de colágeno em resposta ao atrativo de quimioterapia também foi observada. As células permanecem saudáveis durante todo o experimento do gel de colágeno, como evidenciado pela manutenção de números celulares robustos e sua morfologia 48 horas após a polimerização do gel.Este ensaio vertical de gel de colágeno também permite que a cinética da migração celular na invasão, seja analisada por imagem da migração celular na série Z, bem como a morfologia das células migratórias a serem capturadas in situ. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar uma placa de cultura compatível com o seu microscópio. Após este procedimento, outras variáveis, como modificar a força do colágeno ou usar diferentes atrativos de quimioterapia, podem ser introduzidas para responder a perguntas adicionais sobre os efeitos do envolvimento da ECM na invasão celular ou de diferentes atrativos de quimioterapia na invasão celular, respectivamente.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia e do câncer rastrearem inibidores farmacológicos de metástases, bem como explorarem a cicatrização de feridas em todas as respostas inflamatórias in vivo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como avaliar a capacidade migratória e invasiva de células raras e sensíveis, em um ambiente 3D, sem distorcer as células no micro envolvimento. Não se esqueça de que andar com células cancerígenas humanas, ácido clorídrico, paraformaldeído e DAPI pode ser extremamente perigoso e que precauções, como usar um gabinete bio-séptico número dois e uma retenção de fumaça, devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.

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Cancer Research

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Este vídeo demonstra como medir a invasão celular por meio de inserções de cultura celular utilizando uma metodologia baseada em fluorescência.

Um In vitro FluoroBlok Assay invasão tumoral

Modelos de invasão das células tumorais em três dimensões da matriz extracelular melhor refletir...

Modelagem e imagem 3-Dimensional Invasion cela coletiva

Comumente usado, são descritos métodos altamente acessíveis para analisar a migração celular e invasão in vitro. O primeiro método é o ensaio de encerramento de feridas de células que mede a mobilidade celular. O segundo método é o ensaio de migração e invasão transwell que avalia o quimiotáctica e capacidade invasiva de células.

Na migração celular in vitro e invasão Ensaios

Este artigo proporciona metodologias detalhadas para a utilização de ensaios tridimensionais (3D), para quantificar a invasão das células do cancro da mama. Especificamente, vamos discutir os procedimentos necessários para a criação de tais ensaios, quantificação e análise de dados, bem como métodos para analisar a perda da integridade da membrana que ocorre quando as células invadem.

Quantificação de cancro da mama invasiva das células usando um modelo (3D) tridimensional

A invasão dos tecidos normais circundantes é uma característica definidora dos tumores malignos. Fornecemos aqui um ensaio simples e semi-automatizado de microplacas de invasão em uma biomatriz 3D natural que foi exemplificada com vários modelos de cânceres humanos avançados.

Tridimensional (3D) Tumor Esferóide Invasion Assay

Este método avalia a invasão de células cancerígenas de esferóides em uma matriz 3D circundante.  Os esferoides são gerados através do método de cultura de gota suspensa e, em seguida, incorporados em uma matriz composta de materiais de membrana basal e colágeno tipo I.  A invasão dos esferóides é posteriormente monitorada.

A Cancer Cell Spheroid Ensaio para avaliar a invasão em um ambiente 3D

A transição epitelial para mesenquimal (EMT) permite que os cânceres se tornem invasivos. Para investigar a EMT, é descrito um modelo in vitro baseado em células-tronco neurais (NSC) desprovido de soro e enzimas. Este sistema padronizado permite a avaliação quantitativa e qualitativa da migração celular, expressão gênica e proteica. O modelo é adequado para a descoberta de medicamentos.

Um Modelo de enzimas e Cultura de Células-Tronco Neural Serum-livre para EMT Investigation Adequado para Drug Discovery

Os processos que regem a invasão do câncer de bexiga representam oportunidades para o desenvolvimento de terapêutico e biomarcador. Aqui nós apresentamos um modelo de invasão de câncer de bexiga que incorpora a cultura 3D de esferoides de tumor, imagem latente de lapso de tempo e microscopia confocal. Essa técnica é útil para definir as características do processo invasivo e para a seleção de agentes terapêuticos.

Sistema de cultura de células 3D para estudar a invasão e avaliação terapêutica em câncer de bexiga

O atual protocolo descreve um método integrado, investigando a migração de células de câncer e invasão em uma única plataforma em tempo real, fornecendo uma opção facilmente reproduzível e tempo-eficiente para estudar a morfologia e mobilidade celular.

Um fluxo de trabalho simples migração/invasão usando um automatizado Imager viver-pilha

Este ensaio utiliza células-tronco embrionárias de camundongos diferenciadas em corpos embrionários cultivadas em gel de colágeno 3D para analisar os processos biológicos que controlam a angiogênese brotada in vitro. A técnica pode ser aplicada para testar drogas, modelar doenças e estudar genes específicos no contexto de deleções embrionariamente letais.

In vitro Ensaio Tridimensional de Angiogênese Utilizando Células-Tronco Embrionárias de Camundongos para Modelagem de Doenças Vasculares e Testes de Fármacos

A invasão é um fenômeno biológico importante no desenvolvimento e progressão do câncer. Esse processo é influenciado por células não neoplásicas e componentes do microambiente tumoral. O objetivo deste estudo é descrever um método alternativo para análise da invasão de células tumorais in vitro usando culturas tridimensionais (3D).

Estratégia alternativa para analisar a invasão celular in vitro de culturas 3D

Aprenda o ensaio de invasão vertical invertido para quantificar migração e invasão de células raras e sensíveis em ambiente 3D. Este método preserva o microambiente celular e auxilia na pesquisa do câncer.

Se movendo para cima: Um simples e flexível em Vitro invasão tridimensional protocolo do ensaio

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