Se movendo para cima: Um simples e flexível em Vitro invasão tridimensional protocolo do ensaio
12 de março de 2018
Este protocolo descreve um ensaio de invasão vertical invertida que poderia ser usado para quantificar os recursos de migração e invasão de células em uma configuração tridimensional, preservando o microambiente celular. Este ensaio é adequado para células raras e/ou sensíveis.
O objetivo geral deste ensaio de invasão é quantificar as capacidades migratórias e invasivas de células raras e sensíveis em um ambiente 3D sem desalojar as células de seu microambiente. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de pesquisa do câncer sobre a capacidade de invasão de eventos sensíveis e artificiais, como o produto de fusão de células cancerígenas. A principal vantagem dessa técnica é que as células são analisadas em seu microambiente original usando uma configuração 3D.
As implicações dessa técnica se estendem à terapia do câncer, pois pode ser usada para rastrear agentes farmacológicos capazes de inibir a invasão e metástase de células cancerígenas. A demonstração visual dessa técnica é crítica. A aspiração na temperatura e no pH da mistura de colágeno afeta sua polimerização e o manuseio brusco faz com que o gel se desprenda.
Comece tratando uma placa de cultura de 35 milímetros com um fundo de vidro de 10 milímetros com um mililitro de ácido clorídrico molar para diminuir a hidrofobicidade do vidro. Após 15 minutos, lave a placa duas vezes com um mililitro de PBS por lavagem, seguida de uma lavagem com um mililitro de etanol a 70%. Em seguida, enxágue a placa com um mililitro de meio de cultura específico para as células de interesse a serem usadas.
E semeie o prato com as células de interesse. Em seguida, coloque a placa em uma incubadora de cultura de células. Quando as células atingirem 100% de confluência, combine 114,5 microlitros de colágeno de cauda de rato recém-preparado, 16,6 microlitros de meio 10 X DMEM e 33,1 microlitros de meio de cultura suplementado com quimio atrativo de interesse em um tubo de microcentrífuga no gelo.
Neutralize a mistura de colágeno com 14 microlitros de bicarbonato de sódio e cubra as células com 80 microlitros de gel. Deixe o colágeno polimerizar em uma incubadora umidificada de 37 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono por 30 minutos. Em seguida, coloque dois mililitros de meio de cultura de células séricas reduzido a dois por cento sobre o gel e retorne cuidadosamente as células à incubadora pelo período de tempo experimental apropriado sem desalojar o colágeno.
No final da incubação, remova suavemente o meio e enxágue cuidadosamente o gel com um mililitro de PBS. Fixe as células com um mililitro de paraformaldeído a quatro por cento por 15 minutos, seguido de duas lavagens em um mililitro de PBS por lavagem. Em seguida, marque as células com solução de DAPI por 20 minutos em temperatura ambiente e obtenha imagens da invasão tridimensional de colágeno in vitro por microscopia confocal.
Aqui, é mostrada a quantificação da invasão do gel de colágeno por uma linhagem celular de câncer de mama e produtos de fusão de células de câncer de mama em resposta a um atrativo de quimioterapia durante um período de migração de 48 horas. Notavelmente, a migração de produtos raros de fusão de células de câncer de mama para o gel de colágeno em resposta ao atrativo de quimioterapia também foi observada. As células permanecem saudáveis durante todo o experimento do gel de colágeno, como evidenciado pela manutenção de números celulares robustos e sua morfologia 48 horas após a polimerização do gel.
Este ensaio vertical de gel de colágeno também permite que a cinética da migração celular na invasão, seja analisada por imagem da migração celular na série Z, bem como a morfologia das células migratórias a serem capturadas in situ. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar uma placa de cultura compatível com o seu microscópio. Após este procedimento, outras variáveis, como modificar a força do colágeno ou usar diferentes atrativos de quimioterapia, podem ser introduzidas para responder a perguntas adicionais sobre os efeitos do envolvimento da ECM na invasão celular ou de diferentes atrativos de quimioterapia na invasão celular, respectivamente.
Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia e do câncer rastrearem inibidores farmacológicos de metástases, bem como explorarem a cicatrização de feridas em todas as respostas inflamatórias in vivo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como avaliar a capacidade migratória e invasiva de células raras e sensíveis, em um ambiente 3D, sem distorcer as células no micro envolvimento. Não se esqueça de que andar com células cancerígenas humanas, ácido clorídrico, paraformaldeído e DAPI pode ser extremamente perigoso e que precauções, como usar um gabinete bio-séptico número dois e uma retenção de fumaça, devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um ensaio de invasão vertical invertido que quantifica as capacidades de migração e invasão de células raras e sensíveis em um ambiente tridimensional, preservando o microambiente celular. Este método é particularmente relevante na pesquisa do câncer.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Migração celular
- Pesquisa sobre câncer
- Ensaios de invasão
Contexto
- O ensaio permite a análise de células em seu microambiente original.
- Ele foi desenvolvido para células raras e sensíveis.
- Compreender a invasão celular é essencial para o desenvolvimento de terapias contra o câncer.
- A demonstração visual da técnica é fundamental para sua execução correta.
Objetivo do Estudo
- Quantificar as capacidades migratórias e invasivas de células.
- Explorar a capacidade invasiva de células sensíveis.
- Triar agentes farmacológicos que inibem a invasão e metástase de células cancerígenas.
Métodos Utilizados
- Ensaio de invasão vertical invertida
- Cultura celular tridimensional
- Análise de células em seu microambiente
- Avaliação dos efeitos da temperatura e do pH na polimerização do colágeno
Resultados Principais
- Demonstrou a capacidade de analisar o comportamento celular em um ambiente tridimensional.
- Destacou a importância de manter o microambiente celular.
- Forneceram informações sobre as capacidades invasivas das células cancerosas.
- Mostraram potencial para triagem de agentes terapêuticos.
Conclusões
- O ensaio é uma ferramenta valiosa para a pesquisa do câncer.
- Preserva o microambiente de células sensíveis.
- Pode auxiliar no desenvolvimento de terapias direcionadas à invasão e metástase do câncer.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este ensaio permite que equipes de P&D biofarmacêuticas avaliem o potencial invasivo de modelos celulares raros e sensíveis em um microambiente tridimensional fisiologicamente relevante, sem interromper as interações nativas entre células e a MEC. Ao preservar o nicho celular original, o método apoia a desmistificação mecanicista de alvos relacionados à metástase e melhora a confiança preditiva na validação precoce de alvos. Ele preenche uma lacuna crítica no triagem pré-clínica, onde ensaios tradicionais comprometem a integridade do microambiente, aumentando assim a continuidade translacional desde a descoberta até a otimização de compostos líderes.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a avaliação da invasão em modelos celulares raros ou derivados de fusão sob condições microambientais nativas.
- Valor Operacional: Reduz a variabilidade artefactual causada pelo deslocamento celular, melhorando a reprodutibilidade dos fenótipos de invasão entre experimentos.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos em alvos terapêuticos ao associar perturbações moleculares a desfechos funcionais de invasão em um contexto tridimensional.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prontidão do ensaio: Gera métricas padronizadas e quantitativas de invasão compatíveis com imagens de alto conteúdo e fluxos de trabalho de análise automatizada.
- Reprodutibilidade: Minimiza a variabilidade entre poços ao eliminar a disruptura mecânica das camadas celulares durante a preparação do ensaio.
- Escalabilidade: Compatível com diferentes concentrações de colágeno e quimioatraentes, permitindo estudos de relação estrutura-atividade (SAR) para inibidores de metástase.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Modela a invasão humana por câncer utilizando células híbridas fibroblasto-epiteliais que refletem as interações estroma-tumor in vivo.
- Continuidade Translacional: Conecta achados in vitro à validação pré-clínica ao manter sinais do microambiente essenciais para o comportamento invasivo.
- Decisões Ajustadas ao Risco: Fornece dados funcionais de invasão para priorizar alvos ou compostos com menor probabilidade de falha em estágios avançados devido à modelagem inadequada do microambiente.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio insere-se no continuum de descoberta, desde a validação inicial do alvo até a identificação de compostos líderes, oferecendo uma alternativa que preserva o microambiente aos sistemas de Câmara de Boyden ou transwell para programas relacionados à metástase.
- Biologia da Descoberta: Apoia testes baseados em hipóteses de vias de invasão ao permitir a aquisição de imagens em tempo real com empilhamento z da migração celular em géis fisiológicos de colágeno.
- Triagem: Fornece dados de ponto final de invasão adequados para triagem de bibliotecas de compostos, especialmente para agentes que visam a remodelação da MEC ou a sinalização quimiotática.
- Análises: Permite a quantificação do número de células invadidas e a análise morfométrica, fornecendo leituras multiparamétricas para correlação entre estrutura e função.
- Pesquisa Translacional: Modela a invasão mediada por estroma utilizando híbridos de MSC e câncer, apoiando estudos mecanicistas ligados a biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Adaptável entre diferentes tipos de câncer e cultivos co-culturais com estroma, promovendo a reutilização da plataforma em programas de metástase e cicatrização de feridas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança na validação de alvos ao reduzir falsos positivos decorrentes da perturbação do microambiente.
- Valor Operacional: Aprimora a robustez do ensaio por meio de protocolos padronizados de polimerização do gel e sobreposição.
- Valor Estratégico: Melhora a qualidade das decisões de prosseguir/interromper ao fornecer dados de invasão fisiologicamente relevantes no início da fase de desenvolvimento.
- Impacto no Portfólio: Permite o avanço estratificado por risco de inibidores de metástase com base em perfis funcionais de invasão em 3D.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura celular tridimensional e microscopia confocal para quantificação precisa da invasão.
- Depende do controle preciso de temperatura e pH durante o preparo do colágeno para garantir polimerização consistente do gel.
- Necessita de dosagem padronizada de quimioatraentes e condições de meio com redução de soro para respostas quimiotáticas reprodutíveis.
- A adaptação a proteínas alternativas da matriz extracelular (por exemplo, Matrigel, fibrina) pode exigir otimização da cinética de gelificação e da concentração.
- Limita-se a células aderentes ou semiaderentes capazes de invadir para cima através de uma sobreposição de gel; suspensões não aderentes podem exigir modificações.
