Lente livre de microscopia para a dinâmica e a análise quantitativa de cultura de células aderentes

O objetivo geral desta metodologia é adquirir e analisar a dinâmica da grande população de células aderentes monitoradas por meio de microscopia de vídeo sem lente. Então, achamos que essa técnica é interessante em muitos campos da biologia e para estudar a proliferação celular ou cistite celular ou triagem de drogas, ou monitoramento de diferentes processos biológicos. Portanto, essa técnica é livre de rótulos e é muito simples.

Mas é muito eficaz no estudo de grandes populações de células. Que ideia para este método, quando mudamos do campo da detecção de bactérias para o campo da imagem de células de mamíferos. Então foi útil que o biólogo, eles precisarão de aquisição de lapso de tempo do circuito diretamente na incubadora.

Em seguida, construímos um microscópio de vídeo sem lentes personalizado que é compatível com a incubadora e desenvolvemos um algoritmo de reconstrução holográfica para obter a imagem de milhares de células que estão presentes no campo de visão muito grande. Comece este procedimento revestindo uma placa de fundo de vidro de 6 poços com fibronectina em temperatura ambiente por 1 hora. Após 1 hora, remova o excesso de fibronectina e enxágue a placa de fundo de vidro de 6 poços com PBS.

Células Hela, cultivadas em DMEM, mais meio de glutamina, suplementado com 10% de calor no soro fetal ativado da panturrilha, e 1% de penicilina e estreptomicina são usadas nesta demonstração. Semear vinte mil células por placa de cultura. É importante usar um recipiente com fundo de vidro.

Pela qualidade da aquisição sem lentes. Coloque a placa de cultura na incubadora em cima do microscópio de vídeo sem lente. O microscópio de vídeo sem lentes usado para esta aquisição de lapso de tempo está disponível comercialmente.

Possui um sensor de imagem semicondutor de óxido metálico com uma área de imagem de 29,4 milímetros quadrados e uma densidade de pixels de 1,67 micrômetros. A iluminação de comprimento de onda múltipla é fornecida por um dispositivo de diodo emissor de luz multichip localizado acima de um orifício de 150 micrômetros a uma distância de aproximadamente 5 centímetros das células. Antes de iniciar a aquisição de lapso de tempo, é importante verificar se não há condensação na placa de cobertura.

Porque a condensação degradará a qualidade da imagem da aquisição. Se tiver ocorrido condensação na tampa da placa de cultura, limpe a tampa. Controle o microscópio sem lentes de vídeo com um software de aquisição disponível comercialmente.

Que executa tanto a aquisição de lapso de tempo quanto a reconstrução holográfica. Insira os parâmetros de entrada necessários na interface do software. Defina a taxa de quadros para 1 aquisição a cada 10 minutos, o tipo de cultura de células como aderente e a duração do experimento para 3 dias.

Inicie a aquisição de lapso de tempo. Esta imagem mostra um exemplo do campo de visão completo de uma aquisição bruta no canal azul em uma área de 29,4 milímetros quadrados em um quadro. O painel B é o detalhe do painel A e o painel C é o detalhe do painel B. O algoritmo de reconstrução holográfica processará automaticamente a aquisição sem lentes para obter a imagem de fase da cultura de células.

Uma imagem de exemplo de células antes do desempacotamento de fase é mostrada, seguida por uma imagem após o desempacotamento de fase. O rastreamento de células é realizado usando o algoritmo TrackMate, um plug-in Fiji de código aberto para o rastreamento automatizado de partículas únicas. Após o carregamento, a aquisição de lapso de tempo completo em Fiji e a configuração dos algoritmos conforme descrito no protocolo de texto, defina os parâmetros de entrada.

Defina o diâmetro estimado da bolha como 15 pixels, o limite do detector como 0,25, a distância máxima de vinculação como 15 pixels, a distância máxima de fechamento da lacuna como 15 pixels e o número de pontos na trilha como 3,5. O primeiro passo no algoritmo de rastreamento de células é a detecção de células na aquisição sem lente. Os resultados do algoritmo de rastreamento de células são mostrados, com todos os rastreamentos de células mostrados em cinquenta quadros, ou cerca de 8 horas.

Com um código de cores correspondente à velocidade mediana. O painel inferior é uma imagem detalhada do retângulo amarelo do painel superior. Um videoclipe representativo do rastreamento de celular é mostrado aqui.

No final do processo de rastreamento de células, selecione o botão de análise para gerar os resultados na forma de 3 arquivos de texto. Com base nesses dados, execute a segmentação celular e detecte divisões celulares usando algoritmos dedicados, conforme detalhado no protocolo de texto e nos arquivos de código suplementares. A compilação de todas as medições de célula única durante a aquisição de lapso de tempo total produz gráficos de dispersão de várias métricas em função do tempo.

O número total de células no campo de visão total aumenta de duas mil para quinze mil em 2,7 dias. Multiplicado pelo número de pontos de tempo, isso leva a um grande conjunto de dados de células detectadas. Cada um caracterizado por suas coordenadas e características morfológicas, como massa seca, área, espessura média, maior comprimento de acesso e proporção.

A combinação de algoritmos de rastreamento e segmentação celular permite medições cinéticas no nível de célula única. Este exemplo mostra a análise do rastro celular com duração de cerca de sessenta e seis horas e exibindo 4 divisões celulares nos pontos de tempo circulados em amarelo. Várias métricas foram calculadas em função do tempo: área de superfície celular, massa seca, espessura média e motilidade celular.

A distribuição da duração do ciclo celular para observação de 2,7 dias foi próxima à agouziana. Com uma média de 16,5 horas. Os comprimentos dos ciclos celulares, medidos automaticamente, estão bem correlacionados com os medidos manualmente.

Outros parâmetros também foram examinados, como a massa seca inicial da célula, a massa seca final e a taxa média de crescimento durante o ciclo celular. Uma vez dominada, a análise completa dos dados da aquisição de lapso de tempo, pode ser feita em poucas horas, dependendo da configuração da CPU e do desempenho do hardware. Ao tentar este procedimento, é muito importante ter cuidado com a concentração celular inicial.

Se a concentração inicial da célula for muito grande, o algoritmo de rastreamento de células falhará em definir corretamente as trajetórias da célula. Mas, se a concentração celular for muito baixa, as estatísticas da análise completa também serão muito baixas. Seguindo este procedimento, análises automatizadas de rastreamento de células podem ser realizadas para responder a outras perguntas nas áreas de: biologia, biologia fundamental ou quimiotaxia.

Esta nova técnica também abre caminho para o monitoramento da linhagem celular que, esperançosamente, trará uma visão interessante para estudar o ciclo celular. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como conduzir a aquisição de lapso de tempo por meio de microscopia de vídeo sem lentes e como analisar uma grande população de células.