Name: Lente livre de microscopia para a dinâmica e a análise quantitativa de cultura de células aderentes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Aprenda microscopia sem lente para analisar dinâmica de células aderentes em cultura. Este método permite acompanhar ciclos celulares de células HeLa por 2,7 dias com imagens em time-lapse diretamente na incubadora.

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Os autores não têm nada de reconhecer.

1. celular cultura monitoramento aquisição
<ol><li>Desenvolvem-se células HeLa em DMEM + glutamina (por exemplo, GlutaMAX) suplementado com 10% (v/v) bezerro fetal-inactivados por calor, soro e 1% penicilina e estreptomicina.</li>
	<li>Revestimento de placas de cultura de fundo de vidro 6-poços com fibronectina (25 µ g/mL) por 1h. Então as sementes 2 x 104 células por poço.</li>
	<li>Durante a aquisição, mude o meio em 3 dias.</li>
	<li>Para a aquisição de lapso de tempo, use o vídeo livre de lente microscópio (comercialmente disponível). Nota: Isto é baseado na técnica de imagem livre de lente computacional, conforme descrito por Ozcan et al 16 que foi modificado para realizar o monitoramento contínuo em uma incubadora a uma temperatura controlada de 37 ° C12,15. Possui um sensor de imagem complementares de óxido metálico semicondutor (CMOS) com uma densidade de pixel de 1,67 µm e uma área de imagem de 6,4 x 4,6 mm2. Iluminação múltipla do comprimento de onda é fornecida por um multichip luz emitindo diodo (LEDs) dispositivo, que proporciona iluminação vermelha, verde e azul. Os comprimentos de onda são centralizados, em 636, 521 e 452 nm respectivamente, com uma largura de banda espectral de 25, 45 e 25 nm respectivamente. Os vermelho-verde-azul (RGB) LEDs estão localizados acima um 150 µm pinhole a uma distância de aproximadamente 5 cm, a partir das células. A potência de luz medida perto o LED é tão baixa quanto 10 µW em cada comprimento de onda e o tempo de iluminação é apenas de um segundo por aquisição. Portanto, sem problemas de foto-toxicidade são esperados quando culturas de células são observadas ao microscópio lente livre de.</li>
	<li>Colocar o recipiente de cultura celular colocar em contato com o sensor CMOS (Figura 1). Utilize um recipiente com uma lamela de vidro na parte inferior, o que é importante para a qualidade da lente-livre aquisição. Recipientes de plástico também podem ser usados, mas a lente livre aquisição será degradada devido à pobre qualidade óptica destes recipientes.</li>
	<li>Controle o vídeo livre de lente microscópio com o software de aquisição (comercialmente disponível), que executa tanto a lapso de tempo aquisição e reconstrução holográfica. Os parâmetros que precisam ser digitados pelo usuário na interface do software são a taxa de quadros, a duração do experimento e o tipo de cultura de células, ou seja, aderente nas células ou flutuante.</li>
	<li>Defina os parâmetros de entrada do software aquisição. Defina a taxa de quadro definido para a aquisição de um a cada 10 minutos e defina o tipo de cultura celular de «aderentes». Nota: Uma taxa de quadros de uma aquisição em 10 minutos é um bom compromisso, pois garante uma célula confiável de rastreamento enquanto o tamanho do conjunto de dados resultante a ser analisado é ainda razoável. A mais rápida taxa de quadros realizável com esta configuração de lente-free microscopia é uma aquisição cada 5 minutos. Aumentando ainda mais o framerate resulta em um aquecimento excessivo do sensor CMOS que pode afetar a viabilidade das células em cultura.</li>
	<li>Iniciar a aquisição de lapso de tempo, e o algoritmo de reconstrução holográfica (comercialmente disponível) processará automaticamente a aquisição livre de lente para obter a imagem da fase da cultura de pilha. O algoritmo de reconstrução holográfica é baseado em um comprimento de onda multi fase recuperação algoritmo17 e fornece uma imagem RGB fase reconstruído no intervalo de [-π, + π] para cada célula única ao longo de um grande campo de visão de 29,4 mm2. O princípio da holografia lente livre em linha é iluminar uma amostra fina (z = 0) com uma onda de avião (de amplitude 1 após normalização) e para detectar em um sensor CMOS a imagem de intensidade de difração subsequentes em uma curta distância z = Z, tipicamente de 1 mm após o amostra. Em nossa configuração, a iluminação é sequencialmente mudou-se para 3 comprimentos de onda (λ1= 0.450 µm, λ2= 0.540 µm, λ3= 0.647 µm) para medir três padrões de difração da mesma amostra.</li>
</ol>2. análise de dados de cultura de célula
<ol><li>Para rastreamento de celular, use o algoritmo de Trackmate, um plugin de Fiji de código aberto para o monitoramento automatizado de partículas única18. Pelo primeiro, carregar a aquisição completa lapso de tempo em Fiji (comando de sequência de imagem de carga). Devido ao grande tamanho dos conjuntos de dados, que caracteriza tipicamente 400 quadros RGB de 29,7 Mb, é mais rápido para carregá-los no formato de 8 bits. Em seguida o plugin Trackmate Fiji orienta o usuário através de vários estágios do algoritmo de rastreamento de celular, ou seja um palco de deteção de célula, um palco de rastreador de celular e vários filtros aplicados para as detecções de célula e as faixas computadas. Em cada estágio, os algoritmos de configurar e exibir os resultados imediatamente de modo que, se necessário, um pode facilmente navegar e para trás para ajustar as configurações. Os vários menus da interface do Trackmate são mostrados na Figura 2 com as configurações reais utilizadas para o experimento de células HeLa.</li>
	<li>Defina os parâmetros de entrada do software aquisição como a seguir (ver Figura 2). Defina o diâmetro estimado blob para 15 pixels, o limiar de detector de 0,25, a distância máxima vinculação de 15 pixels, a distância máxima de abertura-fechamento para 15 pixels e o número de pontos nas faixas de 3,5. Nota: Essas configurações serão obviamente diferente de um experimento para o outro, especialmente o 'blob estimado diâmetro' que corresponde ao tamanho da célula (aqui, dado em pixels de 1,67 µm). A mesma observação aplica-se para a 'distância máxima vinculação' que representam a distância máxima percorrida por uma célula em dois quadros consecutivos (aqui, dado em pixels de 1,67 µm). Seu valor ideal depende na motilidade celular, mas também na densidade celular.</li>
	<li>No final do processo de rastreamento de celular, gerar os resultados sob a forma de três arquivos de texto ('Análise' botão, ver Figura 2). O arquivo mais útil, chamado 'Spots nas estatísticas de faixas', consiste em uma tabela listando todos detectadas células com suas posições respectivas (x, y) na aquisição, o número do quadro e seu número da faixa. Com base neste dados, executar a segmentação da célula e detectar divisões celulares usando algoritmos dedicados (ver arquivos de código complementar). Os outros dois arquivos são nomeados 'Links estatísticas faixas' e 'Track estatísticas' e incluir todos os resultados, lidando com as faixas, por exemplo, a faixa durações, número de lacunas detectadas, rastrear o frame inicial, etc.</li>
	<li>Use o algoritmo de segmentação de célula (ver arquivo de código suplementar) para extrair automaticamente várias métricas, descrevendo a morfologia celular da imagem reconstruída fase. Essas métricas são a área de superfície de célula (S), o comprimento do eixo principal de célula (L), o comprimento do eixo menor célula (l) e a relação de aspecto de célula (L/l). A fase recuperada de microscopia livre de lente é proporcional a densidade e a espessura da camada de amostra, conforme discutido anteriormente,15.</li>
	<li>Além das características morfológicas da célula, extrair as medições do (CDM) de massa secas célula quantitativa do reconstruído fase13,19,20 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56580/56580eq1v3.jpg">EQ. (1) onde φ(x,y) é a fase reconstruído turno19, λ o comprimento de onda e α = 1,8 x 10-4 m3/kg índice de refração específico que relaciona a variação do índice de refração para secar massa1, 19.</li>
	<li>Avalie a espessura de célula, usando uma estimativa da diferença entre o índice de refração de célula e que os meios de cultura. A relação entre a célula de espessura h(x,y) e a mudança de fase medidos, é dado por20: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56580/56580eq2v3.jpg">EQ. (2.1) <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56580/56580eq3v3.jpg">EQ. (2.2) com Δn(x,y) = ncélula (x,y) - médio de n (x,y), a diferença de índice de refração entre a célula e o meio de cultura. A seguir, assumir um valor constante de Δn = 0,025, que é estimado a partir do índice de refração, medido em núcleos de células HeLa (n = 1.35511) e de meios de cultura de tampão fosfato salino (PBS) (n = 1,33). Embora o valor de espessura da célula é apenas indicativo, como é baseado em uma suposição, suas variações relativas são significativas e podem ser exploradas para detectar células divisórias.</li>
	<li>Usar o algoritmo dedicado (ver arquivo de código complementar) para detectar a ocorrência de divisões celulares e, em seguida, extrair faixas de células que estão associadas às divisões celulares detectados, a fim de detectar uma divisão celular, células com uma espessura medida maior do que 8 µm são primeiramente identificados, em seguida, verifique se uma nova célula aparece estreitamente em espaço e tempo. Desta forma, a detecção de divisões celulares baseia-se em dois critérios robustos. Alternativa e mais elaborados métodos para detecção de divisão celular podem ser aplicados a lensfree aquisição de lapso de tempo21,22,23.</li>
</ol>

<ol><li>Zangle, T. A., Teitell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+mass+profiling%3A+an+emerging+approach+in+quantitative+biophysics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell mass profiling: an emerging approach in quantitative biophysics.</a> Nat Methods. 11 (12), 1221-1228 (2014).</li>
<li>Popescu, G., Park, K., Mir, M., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+technologies+for+measuring+single+cell+mass%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">New technologies for measuring single cell mass.</a> Lab Chip. 14 (4), 646-652 (2014).</li>
<li>Reed, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+massively+parallel+single-cell+drug+response+measurements+via+live+cell+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Rapid, massively parallel single-cell drug response measurements via live cell interferometry.</a> Biophys J. 101 (5), 1025-1031 (2011).</li>
<li>Mir, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+measurement+of+cycle-dependent+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Optical measurement of cycle-dependent cell growth.</a> Proc Natl Acad Sci. USA. 108 (32), 13124-13129 (2011).</li>
<li>Girshovitz, P., Shaked, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalized+cell+morphological+parameters+based+on+interferometric+phase+microscopy+and+their+application+to+cell+life+cycle+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Generalized cell morphological parameters based on interferometric phase microscopy and their application to cell life cycle characterization.</a> Biomed Opt Express. 3 (8), 1757-1773 (2012).</li>
<li>Kemper, B., Bauwens, A., Vollmer, A., Ketelhut, S., Langehanenberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+quantitative+cell+division+monitoring+of+endothelial+cells+by+digital+holographic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Label-free quantitative cell division monitoring of endothelial cells by digital holographic microscopy.</a> J Biomed Opt. 15 (3), (2010).</li>
<li>Mir, M., Bergamaschi, A., Katzenellenbogen, B. S., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+quantitative+imaging+for+monitoring+single+cancer+cell+growth+kinetics+and+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive quantitative imaging for monitoring single cancer cell growth kinetics and drug response.</a> PLoS One. 9 (2), 1-8 (2014).</li>
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<li>Cotte, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marker-free+phase+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">Marker-free phase nanoscopy.</a> Nature Photonics. 7 (2), 113-117 (2013).</li>
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<li>Pushkarsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+single-cell+motility+analysis+on+a+chip+using+lensfree+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Automated single-cell motility analysis on a chip using lensfree microscopy.</a> Sci Rep. 4, 4717(2014).</li>
<li>Allier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+dense+cell+cultures+by+multiwavelength+lens-free+video+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytom+Part+A%22%5BJournal%5D)">Imaging of dense cell cultures by multiwavelength lens-free video microscopy.</a> Cytom Part A. 91 (5), 1-10 (2017).</li>
<li>Su, T. -W., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+lensfree+imaging+and+characterization+of+a+heterogeneous+cell+solution+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">High-throughput lensfree imaging and characterization of a heterogeneous cell solution on a chip.</a> Biotechnol Bioeng. 102 (3), 856-868 (2009).</li>
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<li>Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+cell+mass+and+growth+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of cell mass and growth dynamics.</a> Am J Physiol Physiol. 295 (2), 538-544 (2008).</li>
<li>Liu, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+refractive+index+for+cell+biology+and+disease+diagnosis%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Cell refractive index for cell biology and disease diagnosis: past, present and future.</a> Lab Chip. 16, 634-644 (2016).</li>
<li>Rapoport, D. H., Becker, T., Mamlouk, A. M., Schicktanz, S., Kruse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+validation+algorithm+allows+for+automated+cell+tracking+and+the+extraction+of+biologically+meaningful+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel validation algorithm allows for automated cell tracking and the extraction of biologically meaningful parameters.</a> PLoS One. 6 (11), e27315(2011).</li>
<li>Al-Kofahi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+cell+lineage+construction%3A+A+rapid+method+to+analyze+clonal+development+established+with+murine+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Automated cell lineage construction: A rapid method to analyze clonal development established with murine neural progenitor cells.</a> Cell Cycle. 5 (3), 327-335 (2006).</li>
<li>Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I., van Cappellen, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+in+cell+and+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracking in cell and developmental biology.</a> Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 894-902 (2009).</li>
<li>Posakony, J. W., England, J. M., Attardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+growth+and+division+during+the+cell+cycle+in+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial growth and division during the cell cycle in HeLa cells.</a> J Cell Biol. 74 (2), 468-491 (1977).</li>
<li>Zocchi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+CD38+Increases+Intracellular+Calcium+Concentration+and+Reduces+Doubling+Time+in+HeLa+and+3T3+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Expression of CD38 Increases Intracellular Calcium Concentration and Reduces Doubling Time in HeLa and 3T3 Cells.</a> J Biol Chem. 273 (14), 8017-8024 (1979).</li>
<li>Reitzer, L. J., Wice, B. M., Kennell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+glutamine%2C+not+sugar%2C+is+the+major+energy+source+for+cultured+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Evidence that glutamine, not sugar, is the major energy source for cultured HeLa cells.</a> J Biol Chem. 254 (8), 2669-2676 (1979).</li>
<li>Benedetti, A. D. E., Joshi-barve, S., Rinker-Schaeffer, C., Rhoads, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Antisense+RNA+against+Initiation+Factor+eIF-4E+mRNA+in+HeLa+Cells+Results+in+Lengthened+Cell+Division+Times%2C+Diminished+Translation+Rates%2C+and+Reduced+Levels+of+Both+eIF-4E+and+the+p220+Component+of+eIF-4F%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of Antisense RNA against Initiation Factor eIF-4E mRNA in HeLa Cells Results in Lengthened Cell Division Times, Diminished Translation Rates, and Reduced Levels of Both eIF-4E and the p220 Component of eIF-4F.</a> Mol Cell Biol. 11 (11), 5435-5445 (1991).</li>
<li>Kumei, Y., Nakajima, T., Sato, A., Kamata, N., Enomoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+G1+phase+duration+and+enhancement+of+c-myc+gene+expression+in+HeLa+cells+at+hypergravity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Reduction of G1 phase duration and enhancement of c-myc gene expression in HeLa cells at hypergravity.</a> J Cell Sci. 93 (2), 221-226 (1989).</li>
<li>Ginzberg, M. B., Kafri, R., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+being+the+right+%28cell%29+size%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">On being the right (cell) size.</a> Science. 348 (6236), 1245075(2015).</li>
<li>Mathieu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+lens-free+imaging+of+cell+migration+in+diverse+physical+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Time-lapse lens-free imaging of cell migration in diverse physical microenvironments.</a> Lab Chip. 16 (17), 3304-3316 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Neste trabalho, mostramos que essa lente livre de microscopia pode ser usada dentro de uma incubadora para capturar a cinética de milhares de células. A fim de descrever a metodologia global, que nós explicamos como uma aquisição de lapso de tempo dia 2,7 de células HeLa em cultura pode ser analisada com algoritmos de controle de célula padrão. O resultado é um conjunto de dados com 2,2 x 106 medidas de célula e 10.584 faixas do ciclo celular. As aquisições foram realizadas sobre uma cultura de células Hela co...

Células de mamíferos cultivadas ao longo de vários ciclos de célula de monitoramento e medição com precisão de pilha tamanho e célula massa seca é uma tarefa desafiadora. Várias técnicas de etiqueta livre ópticas são capazes de realizar esta tarefa1,2: fase de mudança interferometria3, microscopia holográfica digital (DHM)4,5,6, 7, quadriwave lateral corte interferometria8,9 e de10,de tomografia computadorizada quantitativa fase11. Esses métodos têm levado a muitos novos insights sobre a compreensão do ciclo celular de células de mamíferos. No entanto, eles raramente são acoplados com célula automática de algoritmos de controle e sua taxa de transferência permanece limitada, quando a medição da pilha trajetórias massa1 (N < 20 em respectivamente3,4,5 , 6). daí um método óptico romance é necessário medir trajetórias de massa celular com estatísticas grandes (N > 1000).
Neste trabalho, podemos demonstrar a capacidade da lente livre de microscopia imagem simultaneamente milhares de células diretamente dentro da incubadora, e então quantificar métricas de célula única ao longo de milhares de faixas individuais ciclo celular. Microscopia de lente-livre é uma fase quantitativa de imagem técnica que permite a aquisição de imagem da fase de células densamente em um grande campo de visão (tipicamente de várias dezenas de mm2, aqui 29,4 mm2)12,13 de14, ,15. Várias métricas no nível da célula única são determinadas, por exemplo, área de célula, massa seca, célula espessura, comprimento do eixo principal de célula de célula e12,de proporção15, de cada imagem de célula. Então, aplicando um algoritmo de rastreamento de celular, estas características podem ser plotadas para cada célula em função do tempo experimento14,15. Além disso, ao detectar a ocorrência de divisões celulares em faixas a célula, é possível extrair outras informações importantes, tais como a célula inicial secar massa (logo após a divisão celular), a massa seca celular final (antes da divisão celular) e a célula ciclo de duração, ou seja, o tempo entre duas divisões consecutivas15. Todas estas medidas podem ser computadas com muito boas estatísticas (N > 1000) desde que o grande campo de visão normalmente permitiria a análise de 200 a 10.000 células em uma única lente livre aquisição.
Para explicar esta metodologia baseada na lente livre de microscopia, descrevemos o protocolo para monitorar e quantificar uma cultura de célula HeLa 2,7 dias. Análise de dados é um processo de quatro etapas, com base em múltiplos de comprimento de onda reconstrução holográfica, rastreamento de celular, segmentação de célula e algoritmos de divisão celular. Aqui é mostrado que a resolução espacial e a taxa de quadros relativamente rápida (uma aquisição a cada 10 minutos), obtidos com esta configuração de lente livre de microscopia é compatível com algoritmos de controle de célula padrão. A análise completa deste dataset resulta na medição de 10.584 célula faixas sobre ciclos completos de célula.
Para resumir, a lente livre de microscopia é uma ferramenta poderosa para monitorar automaticamente milhares de sem rótulo, não sincronizado e células não modificadas por experiência; cada célula sendo controlada ao longo de vários ciclos de célula. Nossas medições, portanto, fornecem o valor médio dos vários parâmetros de célula, mas mais importante, a variabilidade inter celular sobre uma grande população de células.

<table><tbody><tr><td>Microscópio de vídeo sem lentes Cytonote&nbsp;</td>Software <td>de aquisição Iprasense</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Horus</td> Placas de cultura de fundo de vidro <td>Iprasense</td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>6 poços</td><td>MatTek corporation</td><td>Parte No: P06G-0-14-F&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Meio DMEM + GlutaMAX&nbsp;</td><td>Soro</td> fetal de bezerro inativado por calor Gibco<td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Penicilina e estreptomicina Eurobio</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab, caixa de ferramentas de processamento de imagem&nbsp;</td><td>Obras matemáticas</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

lente livre de microscopia para a dinâmica e a análise quantitativa de cultura de células aderentes

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Aqui, demonstramos a lente livre vídeo microscopia nos permite capturar simultaneamente a cinética de milhares de células diretamente dentro da incubadora, e que é possível monitorar e quantificar células únicas ao longo de vários ciclos de célula. Descrevemos o protocolo completo usado para monitorar e quantificar uma cultura de célula HeLa 2,7 dias. Primeiro, aquisição de cultura de células é realizada com um microscópio lente livre de e, em seguida, os dados são analisados seguindo um processo de quatro etapas: comprimento de onda multi reconstrução holográfica, rastreamento de celular, celular segmentação e divisão celular deteção algoritmos. Como resultado, mostramos que é possível reunir um conjunto de dados apresentando mais de 10.000 faixas do ciclo celular e mais de 2 x 106 células morfológica medições.

Para o processo de reconstrução holográfica, o campo de luz é descrito por um campo escalar um (onde <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56580/56580eq4v3.jpg"> é o valor complexo de A no avião em distância z da posição de amostra e lateral <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56580/56580eq5v3.jpg"> e no comprimento de onda λ). Propagação de luz é modelada pela teoria de Huygens-Fresnel, que fornece um kernel propagador <img alt="Equation 6" src=...

Lente livre de microscopia nos permite monitorar culturas celulares diretamente dentro da incubadora. Aqui descrevemos o protocolo completo usado para adquirir e analisar uma aquisição de 2,7 dia longo de culturas de células de HeLa, levando a um conjunto de dados de 2,2 x 106 medições de morfologia de célula individual e 10584 ciclo celular rastreia.

Lente livre de microscopia para a dinâmica e a análise quantitativa de cultura de células aderentes

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

O objetivo geral desta metodologia é adquirir e analisar a dinâmica da grande população de células aderentes monitoradas por meio de microscopia de vídeo sem lente. Então, achamos que essa técnica é interessante em muitos campos da biologia e para estudar a proliferação celular ou cistite celular ou triagem de drogas, ou monitoramento de diferentes processos biológicos. Portanto, essa técnica é livre de rótulos e é muito simples.Mas é muito eficaz no estudo de grandes populações de células. Que ideia para este método, quando mudamos do campo da detecção de bactérias para o campo da imagem de células de mamíferos. Então foi útil que o biólogo, eles precisarão de aquisição de lapso de tempo do circuito diretamente na incubadora.Em seguida, construímos um microscópio de vídeo sem lentes personalizado que é compatível com a incubadora e desenvolvemos um algoritmo de reconstrução holográfica para obter a imagem de milhares de células que estão presentes no campo de visão muito grande. Comece este procedimento revestindo uma placa de fundo de vidro de 6 poços com fibronectina em temperatura ambiente por 1 hora. Após 1 hora, remova o excesso de fibronectina e enxágue a placa de fundo de v

lens-free-video-microscopy-for-dynamic-quantitative-analysis-adherent

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Lensfree imagens on-chip e caracterização de células é ilustrada. Esta abordagem on-chip imagens de células fornece uma ferramenta compacta e cost-effective para diagnósticos médicos e de alto rendimento aplicações de biologia celular, tornando-o especialmente adequado para locais de poucos recursos.

Imagem On-chip sem lente de Células fornece uma nova ferramenta de alta capacidade: Biologia Celular e Diagnóstico Médico

Este método permite a monitorização de células em tempo real e as medições quantitativas de parâmetros diferentes de células, tais como a velocidade de migração, o deslocamento, e velocidade. Ao contrário dos métodos tradicionais, esta abordagem em tempo real não se baseia em medições quantitativas de terminais de migração, em vez disso ele permite o monitoramento e cálculo dos parâmetros diferentes continuamente.

Análise Quantitativa de Migração aleatória de células usando microscopia de lapso de tempo vídeo

Autophagy é um processo ubíquo que permite que as células para se degradarem e reciclar proteínas e organelas. Aplicamos microscopia de fluorescência para visualizar avançada e quantificar o pequeno, mas, alterações físicas essenciais associados com a indução de autofagia, incluindo a formação e distribuição de autofagossomas e lisossomas, e sua fusão em autolysosomes.

Análise Quantitativa de Autophagy usando microscopia de fluorescência avançada 3D

Nós demonstramos um ensaio baseado em microfluídica para medir a escala de tempo para que as células de trânsito através de uma seqüência de constrições em escala mícron.

A técnica de microfluídica para sondar Deformabilidade celular

Um microscópio avançado que permitem rápida e de alta resolução de imagem de ambos, a membrana plasmática isolada e o volume intracelular circundante, será apresentado. A integração de giro do disco e total microscopia de fluorescência de reflexão interna em uma configuração permite experiências de imagens ao vivo em taxas de aquisição elevado até 3.5 s por pilha de imagem.

Visualizando a formação de adesão em células por meio de avançados girando a reflexão interna Total disco microscopia de fluorescência

Devido à relação sinal-ruído inerente (SNR) de sensores baseados em transferência de energia de ressonância (FRET) Fӧrster, a medição dos sinais cAMP tem sido desafiadora, especialmente em três dimensões espaciais. Aqui, descrevemos uma metodologia hiperespectral de imagem e análise de FRET que permite a medição da distribuição cAMP em três dimensões espaciais.

Medição de distribuições 3-dimensionales cAMP em células vivas usando imagens e análises hiperespectrais de FRET 4-Dimensional (x, y, z e λ) Hiperespectrais

A plataforma Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals (iTACS) automatiza o processo de medição simultânea de uma grande variedade de sinais químicos e mecânicos em células aderentes. O iTACS foi projetado para facilitar o desenvolvimento orientado pela comunidade e permitir que os pesquisadores usem todos os recursos da plataforma, independentemente de sua formação educacional.

Kit de ferramentas integrativas para analisar sinais celulares: forças, movimento, morfologia e fluorescência

Este manuscrito descreve o desenho e o funcionamento de um microscópio microtensiômetro/confocal para fazer medições simultâneas de tensão interfacial e reologia dilatacional superficial enquanto visualiza a morfologia interfacial. Isso proporciona a construção em tempo real das relações estrutura-propriedade de interfaces importantes em tecnologia e fisiologia.

Microtensiometer para Visualização de Microscopia Confocal de Interfaces Dinâmicas

O protocolo apresentado descreve o desenvolvimento e o uso de uma técnica de coloração de actina filamentosa à base de faloidina com microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) para visualizar a estrutura da camada celular aderente em canais de cultura dinâmica microfluídica e câmaras tradicionais de cultura estática de poço fixo. Essa abordagem auxilia na avaliação da confluência da camada celular, da formação da monocamada e da uniformidade da espessura da camada.

Preparação e avaliação estrutural de monocamadas de células epiteliais em um dispositivo de cultura microfluídica de tamanho fisiológico

Os protocolos descritos são novos métodos de visualização de estruturas periféricas na lente ocular com métodos de quantificação de imagens. Estes protocolos podem ser utilizados em estudos para melhor compreender a relação entre as estruturas da microescala do cristalino e o desenvolvimento/função do cristalino.

Imagens de montagem completa para visualizar e quantificar a estrutura da lente periférica, a morfologia e a organização da célula

Aqui, descrevemos diferentes métodos de formação de esferóides multicelulares para realizar microscopia de células vivas multiparâmetros de acompanhamento. Usando microscopia de imagem de fluorescência (FLIM), autofluorescência celular, corantes de coloração e nanopartículas, é demonstrada a abordagem para análise do metabolismo celular, hipóxia e morte celular em câncer tridimensional (3D) vivo e esferoides derivados de células-tronco.

Produção e Microscopia de Imagem de Tempo de Vida de Fluorescência de Células Vivas Multiparâmetros (FLIM) de Esferoides Multicelulares

Aprenda microscopia sem lente para analisar dinâmica de células aderentes em cultura. Este método permite acompanhar ciclos celulares de células HeLa por 2,7 dias com imagens em time-lapse diretamente na incubadora.

Lente livre de microscopia para a dinâmica e a análise quantitativa de cultura de células aderentes

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