À procura de caminhos de Driver do adquiriu resistência à terapia-alvo: geração de Subclone resistentes aos medicamentos e sensibilidade restaurando pelo Gene Knock-down

O objetivo geral desta plataforma pré-clínica é fornecer um procedimento padrão para identificar e caracterizar os mecanismos que impulsionam a resistência adquirida a terapias direcionadas. Este método pode ajudar a implementar a condução do genoma em oncologia, em particular, abordar questões-chave sobre a heterogeneidade do tumor e os múltiplos mecanismos responsáveis pela resistência adquirida à terapia direcionada. A principal vantagem dessa técnica é a abordagem econômica e de tempo que permite a investigação in vitro dos mecanismos de resistência à terapia direcionada.

A implicação dessa técnica se estende à terapia do câncer, pois a resistência pulmonar ainda é um desafio para terapias direcionadas emergentes. Este método pode fornecer informações sobre o mecanismo envolvido na resistência à terapia direcionada, mas também pode ser usado para estudar a eficácia dos agentes quimioterápicos convencionais. Geralmente, os operadores que usam esse método cambaleiam com uma geração de subclones resistentes a medicamentos, a etapa mais difícil de padronizar.

Concebemos a ideia para este método pela primeira vez quando caracterizamos o mecanismo de resistência adquirido ao trastuzumabe em linhagens celulares de câncer gástrico HER-positivo. A demonstração visual deste método é crítica, pois várias técnicas são necessárias para a geração e validação de modelos resistentes a medicamentos in vitro, incluindo a restauração da sensibilidade por knock-down de genes. Para iniciar este procedimento, semeie células NCI N87 em frascos de cultura de 25 centímetros quadrados.

Adicionar 10 microgramas por mililitro de trastuzumab ao meio de cultura em cada balão. Exponha as células a esta dose inicial até que voltem a crescer. Após o crescimento celular ter sido retomado em aproximadamente duas semanas, exponha as células a uma dose de concentração de cem microgramas por mililitro de trastuzumabe.

Continue aumentando gradualmente a concentração de trastuzumabe esperando até que as células retomem o crescimento antes de cada exposição, até que uma concentração de 400 microgramas por mililitro seja atingida. Uma linhagem celular pode exibir uma sensibilidade diferente a diferentes drogas. Uma solução para esse problema é expor as células a doses gradualmente crescentes de drogas, começando com uma dose de cerca de dez vezes a hora da concentração máxima do plasma até que as células continuem crescendo.

Em seguida, semeie as células em 24 placas de cultura de vários poços. Exponha as células semeadas a concentrações crescentes de inibidores da terapia-alvo de 100 microgramas por mililitro para 400 microgramas por mililitro. Incubar em uma incubadora de CO2 a 37 graus Celsius por 15 dias.

Depois disso, remova o meio e enxágue as células com 10 mililitros de PBS-1X. Remova o PBS-1X e adicione entre dois e três mililitros de solução de fixação. Após 20 minutos, remova a solução de fixação e adicione dois mililitros de solução violeta a 0,5% de cristal em cada poço.

Incubar à temperatura ambiente durante duas horas. Em seguida, use uma pipeta para aspirar cuidadosamente a solução de cristal violeta. Mergulhe as placas em água da torneira para enxaguar quaisquer resíduos restantes.

Seque ao ar em temperatura ambiente por até dois dias. Em seguida, use um microscópio invertido com ampliação de 4X para contar colônias contendo mais de 50 células. Calcule a relação IC50 da resistência relativa conforme descrito no protocolo de texto.

Para começar, prepare uma suspensão de célula única por tripsinização, conforme descrito no protocolo de texto. Usando um hemocitômetro e coloração com azul de tripano, conte as células. Em seguida, semeie 2,5 vezes 10 a cinco células em um frasco T-25 para cada condição.

Em seguida, dilua 12,5 microlitros de cada oligonucleotídeo siRNA direcionado ao gene ou oligonucleotídeo siRNA de controle negativo em meio de transfecção essencial mínimo. Adicione um reagente de transfecção de lipossomas catiônicos na proporção de 1:1 com os oligonucleotídeos. Incube em temperatura ambiente por 20 minutos.

Depois disso, adicione 700 microlitros da mistura de transfecção a cada frasco T-25. Incube a 37 graus Celsius por um a três dias. Use RT-PCR e análise de Western Blot para verificar o knock-down do gene.

Em seguida, semeie as células em 24 placas de cultura de vários poços. Exponha as células a concentrações crescentes de inibidor da terapia-alvo de 100 microgramas por mililitro para 400 microgramas por mililitro. Para a eficácia do knock-down de genes, os oligonucleotídeos de siRNA devem ser específicos para reduzir a expressão do alvo.

Ferramentas projetadas e a medida de siRNA foi o mesmo gene alvo são úteis para esse fim. Incubar em uma incubadora de CO2 a 37 graus Celsius por 15 dias. Remova o meio e enxágue as células com 10 mililitros de PBS-1X.

Depois de remover o PBS, adicione dois a três mililitros de solução de fixação. Em seguida, remova a solução de fixação e adicione 0,5% de solução violeta de cristal. Incubar à temperatura ambiente durante duas horas.

Usando uma pipeta, aspire cuidadosamente a solução de cristal violeta. Em seguida, mergulhe as placas em água da torneira. Seque ao ar em temperatura ambiente por até dois dias.

Depois disso, use um microscópio invertido com ampliação de 4X para contar as colônias contendo mais de 50 células. Neste estudo, três linhagens de células de câncer gástrico que expressam um alto nível de HER2 e são sensíveis ao trastuzumabe são cultivadas em um meio de cultura contendo os agentes terapêuticos direcionados. A partir disso, são obtidos três subclones caracterizados por um fenótipo resistente estável.

Dos subclones, HR NCI N87 é visto como o mais resistente, atingindo uma Resistência Relativa IC50 de 28,57. A análise da expressão de proteínas e genes apóia a hipótese de que o gene IQGAP1 desempenha um papel fundamental no fenótipo de resistência da sublinhagem HR NCI N87. Como mostrado aqui, o nível de proteína IQGAP1 é cinco vezes maior no subclone resistente do que nas células parentais.

E a expressão do gene IQGAP1 é 2,5 vezes maior na sub-linhagem HR NCI N87 do que no subclone original. O silenciamento do gene IQGAP1 é então realizado para avaliar seu papel no desenvolvimento do fenótipo de resistência ao trastuzumabe. Um ensaio clonogênico confirma ainda mais a hipótese da importância do IQGAP.

Como visto aqui, o silenciamento do gene restaura a sensibilidade da célula ao trastuzumabe, reduzindo o valor do IC50 para sete microgramas por mililitro. O que penso desse procedimento é importante ter em mente que geralmente não é fácil obter subclones de células resistentes a medicamentos. E que esse método apresenta um risco potencial de falha.

Através deste procedimento é possível obter várias células de clones caracterizadas por diferentes mecanismos que impulsionam a resistência adquirida às terapias-alvo. O desenvolvimento de um procedimento padrão para a modelagem in vitro da resistência à terapia-alvo deve permitir que um pesquisador de oncologia investigue novos alvos habilitados para medicamentos para superar a resistência aos medicamentos, que é a maior crítica às terapias de última geração.