Desenvolvimento de um Biosensor eletroquímico do DNA para detectar um patógeno de origem alimentar

Os patógenos transmitidos por alimentos contribuem para uma grande proporção dos problemas de saúde pública em todo o mundo, o que afeta significativamente a taxa de mortalidade e morbidade humana. Os métodos convencionais para a detecção de patógenos transmitidos por alimentos exigem manuseio complicado de amostras e são demorados. Recentemente, os biossensores provaram ser um método de detecção promissor e abrangente, com as vantagens de detecção rápida e praticidade.

O desenvolvimento de biossensores é baseado em eletrodo modificado com nanopartículas de ouro estabilizadas com ácido polilático. O eletrodo de carbono impresso em tela foi modificado para aumentar a área de superfície ativa do eletrodo de trabalho. O azul de metileno usado como complexo redox tem uma forte ligação com o DNA de fita simples do DNA da sonda imobilizada.

Esta relação de alta afinidade representada por uma corrente de pico alta. A hibridização do DNA de fita simples com sua sequência complementar substitui as moléculas de azul de metileno ligadas, o que reduz a corrente da voltametria de pulso diferencial. Isso pode ter sido devido a uma menor quantidade de azul de metileno reunido na superfície do eletrodo modificado com DNA de fita dupla complementar, que foi causado pela interação inalcançável entre as bases guanina.

A cor das soluções preparadas muda começando de amarelo para enegrecido e, finalmente, para vermelho rubi escuro. Isso indicou que o sal de ouro foi reduzido pelos íons citrato. O ácido polilático dissolvido foi misturado com a solução de nanopartículas de ouro previamente preparada e, em seguida, homogeneamente agitado à temperatura ambiente, que então denotado como nanopartículas de ouro estabilizadas com ácido polilático.

Espectroscopia ultravioleta visível, difração de raios X, microscopia eletrônica de transmissão e microscopia eletrônica de varredura por emissão de campo com espectrometria de raios X por energia dispersiva foram utilizadas para caracterizar as nanopartículas de ouro estabilizadas com ácido polilático. Cerca de 25 microlitros da solução homogênea de nanopartículas de ouro estabilizadas com ácido polilático foram rapidamente pipetados no eletrodo de carbono impresso em tela e secos ao ar por 24 horas antes do uso. Os eletrodos modificados foram então caracterizados eletroquimicamente em ferrocianeto de potássio para medir a área de superfície ativa, espectroscopia de impedância eletroquímica, repetibilidade, reprodutibilidade e estabilidade.

A otimização da condição de imobilização foi determinada usando três fatores, a concentração de DNA de fita simples variando de 0,2 a 1,4 micromolar, o tempo variando de 30 a 220 minutos e a temperatura variando de 25 a 75 graus Celsius. Por outro lado, a otimização da condição de hibridização foi determinada por meio de dois fatores, que são o tempo variando de cinco a 35 minutos e a temperatura variando de 25 a 75 graus Celsius. Os eletrodos modificados tratados foram posteriormente imersos em azul de metileno 20 micromolares por 30 minutos.

O DNA não especificamente absorvido e o excesso de azul de metileno foram removidos por lavagem com tampão acetato salino pH 4,5 e depois enxaguados com água deionizada. A corrente de pico de redução do azul de metileno foi medida usando a técnica de voltametria de pulso diferencial. A medição da voltametria de pulso diferencial foi executada usando tampão fosfato com solução salina pH 7,0 que não continha indicador.

Procedimento semelhante foi realizado para todas as interações. Vibrio parahaemolyticus como cepas de referência e oito outras cepas bacterianas, a saber, Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritis, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli O157:H7, Bacillus cereus e Vibrio alginolyticus do patógeno comum de origem alimentar foram empregadas para a validação do biossensor eletroquímico de DNA neste estudo. Um subcultivo de rotina de cepas bacterianas em seu respectivo ágar foi realizado a cada duas semanas para manter sua viabilidade.

A quantidade de células de Vibrio parahaemolyticus foi determinada usando uma técnica de placa espalhada. Um milímetro da cultura de células da bactéria foi transferido para nove milímetros de caldo de soja tripticase contendo cloreto de sódio a 3% para obter um fator de diluição de 10. Em seguida, 0,1 mililitro de cada fator de diluição a partir de um fator de diluição de 10 a 10 vezes o fator de diluição de 10 foi espalhado em uma placa de CHROMagar Vibrio para contagem de colônias, respectivamente.

As amêijoas foram obtidas no mercado úmido e rapidamente levadas ao laboratório em uma caixa frigorífica para análise. As amêijoas foram divididas em dois grupos, a saber, o grupo tratado e o grupo não tratado, com o pressuposto de que as amêijoas foram colhidas uniformemente desde o início da colheita até à sua colocação em câmara frigorífica no mercado. As amêijoas no grupo tratado foram pré-tratadas armazenando-as a menos 20 graus Celsius por 24 horas, seguidas de exposição à luz ultravioleta a 20 graus Celsius por quatro horas antes da extração do DNA.

Esperava-se que a temperatura de congelamento e a exposição ultravioleta usadas para o grupo de controle o matassem ou pelo menos limitassem os patógenos transmitidos por alimentos que se acumulam naturalmente nas amêijoas. Um regime de pasteurização mais alto de 70 graus Celsius não foi aplicado, pois o objetivo da condição controlada neste estudo era mimetizar a situação real das amêijoas frescas. Enquanto isso, as amostras do grupo não tratado foram analisadas diretamente sem qualquer pré-tratamento assim que chegaram ao laboratório.

As amêijoas foram lavadas em água destilada e limpas de sujeira antes da remoção dos tecidos das conchas usando uma pinça estéril e um gabinete de fluxo laminar. Cerca de 10 gramas de amostras de tecido de berbigão foram homogeneizadas com o homogeneizador em 19 mililitros de caldo de soja trypticase estéril contendo cloreto de sódio a 3% por 60 segundos. Uma quantidade conhecida de patógenos transmitidos por alimentos foi então adicionada a nove milímetros do caldo de amostra homogeneizado para as amostras enriquecidas.

As amostras não enriquecidas foram utilizadas como controle negativo. Cerca de um mililitro de amostras foram pipetadas em um tubo Eppendorf para extração de amostras de DNA, que seria usado para o ensaio de biossensor e reação em cadeia da polimerase. O DNA genômico do patógeno transmitido por alimentos foi então extraído das amostras enriquecidas e não enriquecidas.

O DNA genômico foi extraído após um procedimento de lise fervida modificado. O DNA genômico foi centrifugado a 12.000 rotações por minuto por três minutos a quatro graus Celsius para obter uma suspensão clara e o sobrenadante mantido a menos 20 graus Celsius para uso posterior. Um biofotômetro foi usado para determinar a concentração e pureza do DNA genômico extraído.

A identidade de todas as cepas foi então determinada usando ensaios bioquímicos padrão e verificada por sequenciamento de 16 genes de RNA SR. Finalmente, o DNA genômico foi desnaturado a 92 graus Celsius por dois minutos e rapidamente resfriado em água gelada antes da aplicação do biossensor. A confirmação adicional de patógenos transmitidos por alimentos foi feita usando a reação em cadeia da polimerase direcionada ao respectivo gene.

O produto amplificado e seus tamanhos foram determinados por eletroforese em gel de agarose 1,5%. As imagens em gel foram capturadas usando um sistema de documentação em gel. A geração de nanopartículas de ouro estabilizadas com ácido polilático foi confirmada a partir dos espectros ultravioleta visível, que o crescimento do plasma superficial e o pico de ressonância foram encontrados em torno de 540 nanômetros.

A formação e existência de nanopartículas de ouro estabilizadas com ácido polilático foi indicada em faixas de comprimento de onda de 500 a 600 nanômetros, dependendo do tamanho da partícula. Todos os picos de cristalito de nanopartículas de ouro estabilizadas com ácido polilático foram observados nos dois teatros nos graus 31,7, 38,2, 44,4, 64,7 e 77,7. As intensidades de pico de cristalito também aumentaram à medida que picos de difração mais amplos entraram em 31,7 graus, implicando que as nanopartículas frias estavam embutidas no ácido polilático e sugerindo a formação de nanoestruturas de ouro polifásica.

A partir da curva de distribuição de partículas de microscopia eletrônica de transmissão e imagens de nanopartículas de ouro estabilizadas com ácido polilático, pode-se ver que as nanopartículas de ouro são quase esféricas em forma. O tamanho das nanopartículas estava na faixa de cerca de 37 nanômetros, o que é um pouco maior do que o obtido a partir da fórmula de Scherrer, sugerindo uma natureza policristalina das nanopartículas sintetizadas. O tamanho principal das nanopartículas de ouro estabilizadas com ácido polilático foi calculado usando a equação de Sherrer, determinando a largura da reflexão de 100 Bragg.

A partir da tabela, o tamanho do cristalito das nanopartículas de ouro estabilizadas com ácido polilático foi calculado em 27 nanômetros. A partir das imagens de microscopia eletrônica de varredura por emissão de campo e com espectros de raios-x por energia dispersiva, o eletrodo de carbono impresso em tela modificada teve a maior porcentagem de peso de ouro, maior densidade e maior estrutura de cobertura de nanopartículas. O espectro de raios-x por dispersão de energia confirmou que as nanopartículas de ouro estabilizadas com ácido polilático produzidas eram compostas apenas de ouro e não exibiam nenhum outro elemento, exceto o pico correspondente a carbono e oxigênio.

Os potenciais de pico anódico e catódico foram consistentes em diferentes taxas de varredura, sugerindo que a reação eletroquímica foi reversível com base na separação de picos. A área de superfície ativa dos eletrodos modificados foi calculada como 0,26 centímetros quadrados e 0,41 centímetros quadrados para o eletrodo nu e o eletrodo modificado, respectivamente. Este resultado confirmou que a melhoria proporcionada pelas nanopartículas de ouro estabilizadas com ácido polilático na área de superfície ativa foi relativamente maior em comparação com o eletrodo nu.

O valor da resistência de transferência de carga para o eletrodo nu foi de 1.932 ohms, enquanto o eletrodo modificado diminuiu para 1.444 ohms. A diminuição do valor da resistência de transferência de carga no eletrodo modificado pode ter resultado de uma diminuição na constante dielétrica local e/ou um aumento na espessura da dupla camada elétrica, sugerindo que o ferrocianeto de potássio funcionou por absorção na interface metal ou solução. As correntes de pico aumentaram progressivamente com a modificação do eletrodo nu usando nanopartículas de ouro estabilizadas com ácido polilático, o que mostrou que uma maior sensibilidade era o inverso da menor resistência à transferência de carga.

O desvio padrão relativo do eletrodo modificado foi derivado como 4,26% O eletrodo com modificação de nanopartículas de ouro estabilizado com ácido polilático deu melhor desvio padrão relativo após várias medições. Valores de desvio padrão relativo de 4,05% para eletrodo modificado indicando melhor reprodutibilidade da fabricação do eletrodo para nanopartículas de ouro estabilizadas com ácido polilático. A concentração otimizada do DNA foi de 1,2 DNA de fita simples micromolar.

O tempo ideal de imobilização do DNA de fita simples foi selecionado como 180 minutos. A temperatura ideal de imobilização do DNA de fita simples foi selecionada como 55 graus Celsius. O tempo ideal de hibridização do DNA de fita dupla foi selecionado como 10 minutos.

A temperatura ideal de hibridização do DNA de fita dupla foi selecionada como 35 graus Celsius. O DNA complementar exibiu a menor corrente de pico de 0,73 microampere entre o DNA sondado, o DNA não complementar, o DNA incompatível de três bases e o DNA incompatível de uma base. É óbvio que a alta corrente do DNA que foi alvo é menor do que a corrente das outras sequências de oligonucleotídeos.

Esse resultado indicou que o biossensor poderia ser usado para discriminar com alta sensibilidade e especificidade. O biossensor de DNA construído tinha uma seletividade de detecção de hibridização via DNA de sonda imobilizado na superfície do eletrodo modificado. A diminuição contínua na corrente de pico de voltametria de pulso diferencial de azul de metileno no eletrodo modificado foi desencadeada como resultado de um aumento na concentração de DNA complementar.

Uma correlação linear entre o log de várias concentrações de DNA alvo de 0,2 picomolar a 0,02 milimolar e o log da corrente de pico de redução do azul de metileno é representada com um coeficiente de regressão linear de 0,96. A porcentagem de recuperação do biossensor de DNA fabricado diminuiu lentamente para não menos de 80% de seu sinal inicial após seis meses de armazenamento, indicando que a sonda de DNA de fita simples na superfície do eletrodo modificado é altamente estável. Uma boa estabilidade a longo prazo a uma temperatura abaixo de 45 graus Celsius pode ser a razão para a forte reação entre nanopartículas de ouro estabilizadas com ácido polilático e DNA de fita simples.

Os produtos de amplificação da reação em cadeia da polimerase para nove espécies diferentes de bactérias, que foram Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni, Escherichia coli, Vibrio alginolyticus, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritis, Klebsiella pneumoniae e Vibrio parahaemolyticus foram rastreados. A corrente de pico de voltametria de pulso diferencial obtida após uma avaliação de reatividade cruzada mostra uma detecção muito clara de Vibrio parahaemolyticus em comparação com outras espécies de bactérias. Pode ser visto diminuindo o número de pares de bases, o sinal de voltametria de pulso diferencial observado aumenta.

Isso está relacionado à maior quantidade de moléculas de azul de metileno até as sondas. A partir da análise da reação em cadeia da polimerase, o Vibrio parahaemolyticus foi encontrado nas amostras enriquecidas tratadas e não tratadas, conforme mostrado pelas pistas sete, oito, nove, 10, 11 e 12. Considerando que as amostras não enriquecidas tratadas e não tratadas nas pistas um, dois, três, quatro, cinco e seis eram desprovidas de Vibrio parahaemolyticus.

Os resultados da detecção usando o biossensor de DNA desenvolvido que determinou com sucesso a presença de Vibrio parahaemolyticus no grupo tratado consistindo de amostras enriquecidas e não enriquecidas. Esses resultados se correlacionam positivamente com os resultados da reação em cadeia da polimerase discutidos anteriormente. A aplicação de nanopartículas de ouro estabilizadas com ácido polilático tem um grande potencial de aplicação como uma modificação para maior senso de fabricação.

Uma alta seletividade pode ser alcançada quando o complexo redox se liga mais fortemente à molécula de biorreconhecimento não hibridizada, o que pode ser uma inovação que vale a pena acompanhar.