Name: Desenvolvimento de um Biosensor eletroquímico do DNA para detectar um patógeno de origem alimentar (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 17 min 16 s
Description: Aprenda a desenvolver um biosensor eletroquímico de DNA para detectar Vibrio parahaemolyticus usando nanopartículas de ouro estabilizadas com ácido polilático. Este método oferece detecção rápida e prática para segurança alimentar.

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Os autores gostaria de agradecer o apoio da Universiti Putra Malaysia.

Nota: Todos os reagentes químicos e bioquímicos para ser usado devem ser de qualidade analítica e usado sem mais purificação. Prepare todas as soluções usando água deionizada estéril. Autoclave todos os produtos vidreiros antes da esterilização.
Atenção: Por favor, use todas as práticas de segurança adequadas ao realizar atividades de laboratório, incluindo o uso de controles (coifa, porta-luvas) de engenharia e equipamentos de proteção individual (óculos de segurança, luvas, jaleco, calça comprida, fechados sapatos).
1. fabricação e caracterização de modificado eletrodo usando PLA-AuNPs
<ol><li>
Preparação e caracterização de PLA-AuNPs
	<ol>
<li>Rapidamente, adicionar 10 mL de solução de citrato de sódio (38,8 mM) para 100 mL de solução de Ácido cloroáurico aquosa (1 mM) a ferver e esfriar até a temperatura ambiente. Observe as alterações na cor da solução de AuNPs preparado, que começa como amarelo, alterações enegrecido e finalmente termina como vermelho rubi escuro.</li>
		<li>Coloque as bolinhas PLA em um molde de aço inoxidável para o processo de fusão e pré-aqueça-os a uma temperatura de 190 ° C por 10 min. siga com o procedimento de prensagem: colocá-los sob uma pressão de 2,2 MPa para 1 min como parte da preparação de folha PLA. A folha PLA estará pronta para uso após arrefecimento para cerca de 3 h.</li>
		<li>Mexendo vigorosamente, dissolva 0,68 mg das folhas de PLA em 5 mL de clorofórmio à temperatura ambiente. Misture o PLA dissolvido com 10 mL da solução de AuNPs previamente preparada e homogênea, misture-o à temperatura ambiente. As misturas homogéneas podem então ser denotadas como PLA-AuNPs e caracteriza-se usando o UV-Vis, XRD, temperatura e FESEM com EDX.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação e caracterização de eletrodos modificados carbono serigrafado Nota: A SPCE utilizado neste estudo é composto por um sistema do três-elétrodo: um contador elétrodo, um carbono trabalho e um eletrodo de referência Ag/AgCl.<ol>
<li>Rapidamente, Pipetar 25 µ l da solução homogênea de PLA-AuNPs para a SPCE e, em seguida, ar secá-la por 24 h antes da utilização.</li>
		<li>Eletroquimicamente caracterizam os eletrodos modificados, SPCE/PLA-AuNPs, em cianeto de potássio ferro (K3[Fe(CN)6]-3/4 -) para medir a área de superfície ativa, espectroscopia de impedância eletroquímica, repetibilidade, reprodutibilidade e estabilidade30.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. desenvolvimento do Biosensor eletroquímico DNA
<ol><li>
Preparação de sonda Nota: As sequências do DNA complementar e ssDNA sonda foram escolhidas com base na informação do centro nacional para o banco de dados Biotechnology Information (NCBI).<ol>
<li>Compra oligonucleotides sintéticos (20-mer ssDNA sonda, DNA complementar mer-20, 20-mer incompatível DNA e DNA não-complementar 21-mer) como pó liofilizado de laboratórios comerciais, com base na seguintes sequências: thiolated ssDNA sonda: 5 ' - / 5ThioMC6-D/CGGATTATGCAGAAGCACTG - 3 ' DNA complementar: 3 ' 5 ' - CAGTGCTTCTGCATAATCCG - um-base DNA incompatível: 3 ' 5 ' - CAGTGCTTCTGC ṪTAATCCG - três bases DNA incompatível: 3 ' 5 ' - CAGTGCTTCT Ċ ṪṪTAATCCG - DNA não-complementar: 3 ' 5 ' - CGCACAAGGCTCGACGGCTGA -</li>
		<li>Prepare as soluções de todos os oligonucleotides (100 µM) usando uma solução estéril e TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5), dividida em parcelas analíticas. Manter a-4 ° C e então fazer as diluições apropriadas apenas antes de usar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Otimização de imobilização e hibridação Nota: Um SPCE modificado com PLA-AuNPs, denotado como SPCE/PLA-AuNPs, foi usado para este estudo e um método de fundição gota foi usado para a imobilização de DNA e a hibridação.<ol>
<li>Primeiro, imobilizar 25 µ l de thiolated ssDNA sonda sobre a SPCE/PLA-AuNPs e então ar secar por 24 horas à temperatura ambiente, depois que ele vai ser finalmente denotado como SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA. Determinar a otimização da condição imobilização por meio de três fatores: a concentração do ssDNA (variando de 0,2 a 1,4 µM), tempo (variando de 30 a 210 min) e temperatura (variando de 25 a 75 ° C).</li>
		<li>Pipete 25 µ l do DNA complementar sobre a superfície da SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA para realizar o evento de hibridação, após o qual pode ser finalmente denotada como SPCE/PLA-AuNPs/dsDNA. Determine a otimização da condição da hibridação através de dois fatores de tempo (variando de 5 a 30 min) e temperatura (variando de 25 a 75 ° C).</li>
		<li>Mergulhe o imobilizado e eletrodos hibridizados em 20 µM MB por 30 min. remover o DNA não-especificamente adsorvido e excesso MB por lavagem com 0,5 M ABS/20 mM NaCl (pH 4.5) e em seguida enxaguar com água desionizada. Medida da corrente de pico de redução MB usando a técnica DPV. Executar a medição de DPV usando PBS 0,1 M (pH 7) não contendo nenhum indicador.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Caracterização do biosensor DNA fabricado
	<ol>
<li>Mergulhe a SPCE/PLA-AuNPs em µM de 20 MB por 30 min, lavar com 0,5 M de ABS/20 mM NaCl (pH 4.5) e em seguida enxaguar com água desionizada antes da medição. Segui um procedimento semelhante para todas as interações, incluindo a sonda DNA, DNA complementar, DNA incompatível e amostras de DNA não-complementares.</li>
		<li>Medir a redução eletroquímica. Nota: Nós medimos DPV usando um Autolab comercialmente fabricado com software de interface. As medições de DPV da redução eletroquímica MB realizada em um potencial que varia de -0,5 V a 0,25 V, com um potencial de passo de 0.005 V, amplitude de modulação de 0,05 V e uma taxa de varredura de 7,73 mVs-1 em PBS 0,1 M (pH 7), não contendo nenhum indicador. A seletividade, sensibilidade, reprodutibilidade e estabilidade térmica do biosensor DNA fabricado foram mais estudados. Resultados relatados foram apresentados como média de valor de medições em três repetições.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. validação do Biosensor DNA fabricado usando amostras reais
<ol><li>Preparação de cepas bacterianas
	<ol>
<li>Selecione amostras bacterianas baseadas sua contaminação significativa de frutos do mar31,32 . Nota: V. parahaemolyticus como cepas de referência e 8 outras estirpes bacterianas (Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, enterite de Salmonella, Klebsiella pneumonia, Escherichia coli O157: H7, Bacillus cereuse Vibrio alginolyticus) da origem alimentar comum patógeno foram empregados para a validação de biosensor eletroquímica do DNA neste estudo.</li>
		<li>Realizar uma rotina sub-cultura de estirpes bacterianas em seu respectivo agar quinzenalmente para manter a sua viabilidade, consulte a tabela 1 para condições de cultura.</li>
		<li>Manter a preservação a longo prazo das cepas bacterianas em seus respectivos caldos crescentes contendo 20% (v/v) glicerol a-80 ° C, como glicerol protege bactérias, impedindo a formação de cristais de gelo que podem danificá-los durante o processo de congelamento. Em seguida, inocule um loop da cultura de pilha bacteriana conservados em estoque de glicerol para os respectivos caldos. Incube os caldos de acordo com seu respectivo crescimento tempo e temperatura, quando precisar de reviver as bactérias.</li>
		<li>Determine a quantidade de V. parahaemolyticus células usando uma placa de expansão técnica33, um padrão e um método conhecido para enumerar derivados de uma série de diluições de microorganismos.<ol>
<li>Cultura V. parahaemolyticus trypcase soja caldo (TSB + 3% NaCl) a 37 ° C, num estado de agitação 140-rpm. Em seguida, transferir 1 mL de cultura de células de bactérias para 9ml de TSB + 3% NaCl para obter um fator de diluição 10-1 .</li>
		</ol>
</li>
		<li>Repita essa etapa nove vezes para obter uma série completa de factor de diluição até 10-10 . Em seguida, espalhe 0,1 mL de cada fator de diluição (a partir de 10-1 a 10-10) na placa de ágar seletivo do Vibrio uma colônia contando, respectivamente. Incube as placas incubadas a 37 ° C por 24 h.</li>
		<li>Use um contador de colônia para contagem das colónias individuais e depois volta-calcular (contagem a quantidade CFU/pipetado x fator de diluição) para obter uma unidade formadoras de colônia por mililitro densidade (CFU mL-1). Derive a concentração da colônia formando unidades (CFUs) nas suspensões celulares de bactérias do terreno de calibração do UFC mL-1 contra absorvância.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação do ensaio do PCR
	<ol>
<li>Extrair DNA genômico seguindo uma modificada fervido lise procedimento34. Primeira, raia uma bacterianas individuais Coe em meios de ágar e inoculá-lo na mídia de caldo, seguida por incubando-lo em sua condição de crescimento relativo, um 140 rpm tremendo condição.</li>
		<li>Pipete uma cultura de 1 mL de caldo de carne para um tubo de centrífuga de micro. Centrifugar-isto a 4830 x g e 4 ° C, durante 1 min obter Pelotas. Use cerca de 500 µ l de tampão estéril de TE para re-suspensão com a pelota. Segure a suspensão resultante durante 10 minutos no 98 ± 2 ° C em um bloco de aquecimento e chill-lo imediatamente a-18 ° C por 10 min lisar as células e liberar o DNA.</li>
		<li>Centrifugar o DNA genômico a 4830 x g e 4 ° C por 3 min obter uma suspensão clara e manter o sobrenadante a-20 ° C para utilização posterior. Use uma medida de biophotometer com absorção de UV no comprimento de onda de 260 nm (como os ácidos nucleicos absorver comprimento de onda de luz) e também no comprimento de onda de 280 nm (como as proteínas de absorção de luz de comprimento de onda) para determinar a concentração e pureza do extraído DNA genômico e então identificar todas as estirpes utilizando ensaios bioquímicos padrão35 e verificá-los por 16S rRNA gene sequenciamento36. Finalmente, desnaturar o DNA genômico a 92 ° C por 2 min e resfriá-lo rapidamente em água gelada antes da aplicação para o biosensor.</li>
		<li>Confirmar a presença de V. parahaemolyticus usando PCR para o gene toxR-alvo. Execute esse procedimento em um thermocycler usando um par de primer (5'-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3' e 5'-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3'). Otimize a amplificação por PCR em um volume total de reação de 25 μL, consistindo de água esterilizada (15,5 µ l), tampão (5 µ l), primeira demão (1 µ l, 10 µM), dNTP mix (1 µ l), modelo de DNA (2 µ l) e Taq DNA polimerase (0,2 µ l, 10x).</li>
		<li>Misture os componentes bem e organizar a amplificação por PCR da sequência de destino em um thermocycler programado para 30 ciclos de amplificação. Em nosso estudo, cada ciclo consistiu em três etapas de reações , ou seja,., desnaturação inicial (94 ° C, 3 min), seguido de 30 ciclos de desnaturação (94 ° C, 1 min), recozimento (63 ° C, 1,5 min) e extensão (72 ° C, 1,5 min), seguido pela extensão final (72 ° C, 7 min).</li>
		<li>Determine os produtos amplificados e seus tamanhos através de electroforese em gel de agarose 1,5%. Capture as imagens de gel com um sistema de gel-documentação produzidos comercialmente.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de amostras de berbigão
	<ol>
<li>Obter amostras frescas. Nota: Nosso berbigão fresco (Anadara granosa) foram obtido a partir do mercado molhado em Serdang, Selangor e rapidamente trazido para o laboratório em uma caixa de gelo mais fresca para análise. Divida as amostras em 2 grupos, ou seja, o grupo tratado e não tratado, assumindo que o berbigão foram colhida uniformemente desde o início da safra até colocá-los em armazenamento frio.</li>
		<li>Pré-tratamento berbigão no grupo tratado, armazenando-os em-20 ° C por 24 h, seguido de exposição à luz UV, a 20 ° C, por 4h antes da extração de DNA. Nota: A temperatura de congelamento e exposição aos raios UV, usado para a controlada grupo mata ou pelo menos limita a naturalmente acumular V. parahaemolyticus nas amêijoas. Não aplica um regime mais elevado de pasteurização de 70 ° C como o objetivo da condição controlada neste estudo é imitar a situação real das amêijoas frescas. Entretanto, analise amostras diretamente do grupo não tratado sem qualquer tratamento prévio, assim que eles chegam no laboratório.</li>
		<li>Subcultura de uma estirpe de V. parahaemolyticus ATCC 17802 em TSB (3% NaCl). Determinar o nível de células viáveis em inóculo através de chapeamento de diluições apropriadas de TSB (3% NaCl) na CA a fim de obter um inóculo de 104 UFC mL-1 de V. parahaemolyticus. Lavar cada berbigão em água destilada e esfrega-lo livre de sujeira antes de usar a pinça estéril em um fluxo laminar para remover os tecidos da casca.</li>
		<li>Homogeneizar a cerca de 10 g de amostras de tecido de berbigão com um homogeneizador em 90 mL de TSB estéril (3% NaCl) por 60 s. adicionar uma quantidade conhecida de V. parahaemolyticus para 9 mL do caldo para as amostras cravados de amostra homogeneizada. Use as amostras bilirrrubina como controlo negativo. Estimar a contagem de células de V. parahaemolyticus cravado para as amostras de berbigão por chapeamento 0,1 mL das amostras na CA, e posteriormente, Pipetar 1 mL de amostras em um tubo de microcentrifugadora de DNA da amostra extração, para ser usado na biosensor e ensaio PCR.</li>
		<li>Extrai o DNA genômico do V. parahaemolyticus das amostras cravadas e bilirrrubina seguindo um modificado de fervido lise procedimento36. Finalmente, determinar a concentração de DNA e pureza, usando uma medição do Fotômetro de bio com absorção UV no comprimento de onda de 260 nm (como os ácidos nucleicos absorver comprimento de onda de luz) e também no comprimento de onda de 280 nm (como as comprimento de onda de absorção de proteínas).</li>
	</ol></li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Os passos críticos em um quadro para o desenvolvimento bem sucedido deste tipo de biosensor eletroquímico são a seleção de elementos de reconhecimento biológico adequado para o transdutor (ácido nucleico ou DNA aqui); abordagem de química para a construção de camada de sensoriamento do transdutor; material de transdução; otimização de imobilização de DNA e hibridação; e validação do biosensor desenvolvido usando amostras reais.
Núcleo para o desenvolvimento bem sucedido de um biosensor eletroq...

Um importante tópico de debate público e científico nos últimos anos, a intoxicação alimentar é principalmente associada com 3 agentes: microorganismos1, produtos químicos2e parasitas3. Alimentos contaminados podem causar consequências graves para a saúde nos seres humanos, especialmente no grupo de risco mais elevado das pessoas com fraco sistema imunológico, a mulheres grávidas, idosas, bebês e crianças pequenas4. Com mais de 1 milhão de casos de diarreia aguda, ocorrendo anualmente em crianças menores de 5 anos de idade na África, Ásia e América Latina, a intoxicação alimentar é das principais doenças global5,6 e estabeleceu-se a Organização Mundial da saúde microorganismos como o mais importante contribuinte7. Vibrio parahaemolyticus destaca-se entre as cepas virulentas mais amplamente reconhecidas. Geralmente encontrado em ambientes costeiros, estuarinos e marinhos8, é uma bactéria Gram-negativa, que se torna ativo em ambientes de sal elevados e provoca grave gastroenterite humana quando comidos em marine inadequadamente cozida, maltratado ou cru produtos9. Além disso, condições médicas existentes em algumas pessoas tornem propenso a ferida infecção, septicemia ou orelha infecção decorrentes de V. parahaemolyticus10. Os fatores de virulência de V. parahaemolyticus hemolisinas são divididos em dois tipos, que contribuem para a patogênese da doença: thermostable hemolisina directa (TDH) codificadas por genes tdh e hemolisina TDH-relacionados, codificadas por genes de trh11. Os marcadores de virulência (genes tdh e trh) de V. parahaemolyticus são normalmente encontrados em amostras clínicas em vez de amostras ambientais.
V. parahaemolyticus possui a habilidade de sobreviver em uma ampla gama de condições, responder rapidamente às mudanças ambientais12. Seu mecanismo de proliferação se agrava seu potencial de risco à medida que sua toxicidade aumenta em paralelo com a célula em massa13. Pior ainda, mudança climática está fornecendo estas bactérias com amplas condições para acelerar sua de crescimento de população celular14. Devido à sua alta frequência, V. parahaemolyticus necessita de ser acompanhada ao longo da cadeia de abastecimento alimentar, particularmente no comércio e na produção de frutos do mar, desde que esses produtos sejam onde eles são encontrados em quantidades enormes de15,16 em todo o mundo. Atualmente, as bactérias são identificadas e isolados, usando uma variedade de métodos, incluindo testes bioquímicos, enriquecimento e meios selectivos17, enzima-lig Fima adsorvente do ensaio (ELISA)18, eletroforese em gel de pulso-campo (PFGE) 19, testes de aglutinação de látex e de testes de reação em cadeia (PCR) polimerase20. Esses métodos normalmente requerem pessoal qualificado, instrumentos sofisticados e técnicas laboriosas que não fornecem informações sobre contaminação imediatamente. Isto limita severamente a probabilidade de detectar prontamente contaminação prejudicial e aplicações no local. Ferramentas de detecção rápida permanecem um desafio excepcional.
Biosensing está emergindo como uma opção promissora para a detecção de agentes patogénicos de origem alimentar, porque oferece uma economia de tempo, econômico, prático e em tempo real de análise método21,22,23,24 . No entanto, embora tenha havido muitos resultados positivos de detecção de analito em amostras cravadas e solução padrão usando biosensores, ainda há uma falta de pesquisa aplicada a amostras reais em misturas aquosas ou extractos orgânicos25. Recentemente, biosensores eletroquímicos detecção direta ou indireta de Ácido desoxirribonucleico (DNA) têm recebido atenção crescente entre os cientistas, devido a sua detecção específica do alvo complementar através de uma hibridização evento26 , 27 , 28 , 29. essas abordagens únicas são mais estáveis em comparação com biossensores enzimáticos, oferecendo assim uma tecnologia promissora para a miniaturização e comercialização. O alvo do estudo relatado aqui é construir uma ferramenta rápida que pode detectar V. parahaemolyticus com alta seletividade, sensibilidade e praticidade, baseada-se a especificidade de sequência de DNA durante a hibridação. Estratégias de identificação envolvem a combinação de polilático nanopartículas de ouro ácido-estabilizado (PLA-AuNPs)30 e os elétrodos do carbono serigrafado (SPCEs) na presença do indicador de hibridação, azul de metileno (MB). O potencial de construção de deteção desenvolvidos é mais explorado usando amostras de berbigão fresco e lisado de DNA de bactérias.

<table><tbody><tr><td>Ácido acético</td><td>Merck</td><td>100056</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Merck</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>Diaminoetano ácido tetracético</td><td>Promega</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Hidrogenofosfato dissódico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255793</td><td></td></tr><tr><td>Etanol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16368</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de ouro (III) trihidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>520918</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Merck</td><td>100317</td><td></td></tr><tr><td>Azul de metileno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M44907</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monobásico, monohidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3522</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5119</td><td></td></tr><tr><td>Resina de poli(ácido lático), grau comercial 4042D</td><td>NatureWorks</td><td>4042D</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>R& M Chemicals</td><td>59435</td><td></td></tr><tr><td>Di-hidrogenofosfato de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Hexacianoferrato de potássio III</td><td>R& M Chemicals</td><td>208019</td><td></td></tr><tr><td>Sal anidro de acetato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Citrato trissódico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>Tris (hidroximetil) aminometano</td><td>Fisher Scientific</td><td>T395-100</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>2X PCR Master Mix com Dual-Dye</td><td>Norgen Biotek</td><td>28240</td><td></td></tr><tr><td>Gel de agarose</td><td>Merck</td><td>101236</td><td></td></tr><tr><td>Bolton Agar</td><td>Merck</td><td>100079</td><td></td></tr><tr><td>Bolton Broth</td><td>Merck</td><td>100079</td><td></td></tr><tr><td>CHROMagar Vibrio</td><td>CHROMagar</td><td>VB910</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Promega</td><td>U1511</td><td></td></tr><tr><td>Água sem nuclease</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0581</td><td></td></tr><tr><td>Ágar azul de metileno de eosina&nbsp;</td><td>Merck</td><td>101347</td><td></td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Biotium</td><td>41001</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Merck</td><td>104092</td><td></td></tr><tr><td>Go Taq Buffer</td><td>Promega</td><td>M7911</td><td></td></tr><tr><td>Corante de carregamento 100 bp DNA ladder</td><td>Promega</td><td>G2101</td><td></td></tr><tr><td>Carregamento de corante 1kb DNA ladder</td><td>Promega</td><td>G5711</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Promega</td><td>91176</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol gema de ovo ágar polimixina</td><td>Merck</td><td>105267</td><td></td></tr><tr><td>McConkey Agar</td><td>Merck</td><td>105465</td><td></td></tr><tr><td>Caldo nutriente</td><td>Merck</td><td>105443</td><td></td></tr><tr><td>Taq polimerase</td><td>Merck</td><td>71003</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de soja tripticase</td><td>Merck</td><td>105459</td><td></td></tr><tr><td>Ágar tripticase soja</td><td>Merck</td><td>105458</td><td></td></tr></tbody></table>

desenvolvimento de um biosensor eletroquímico do dna para detectar um patógeno de origem alimentar

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) é um patógeno comum de intoxicação alimentar que contribui para uma grande parte dos problemas de saúde pública no mundo, afetando significativamente a taxa de morbidade e mortalidade humana. Métodos convencionais para a detecção de V. parahaemolyticus como métodos baseados em cultura, testes imunológicos e moleculares com base em métodos requerem manipulação de amostra complicado e são caro, demorado e tedioso. Recentemente, biosensores tem provado para ser um método de deteção promissora e abrangente com as vantagens da detecção rápida, custo-efetividade e praticidade. Esta pesquisa se concentra no desenvolvimento de um método rápido de detectar V. parahaemolyticus com alta seletividade e sensibilidade usando os princípios de hibridização de DNA. No trabalho, caracterização de nanopartículas ouro sintetizado polilático ácido-estabilizado (PLA-AuNPs) foi conseguida usando a difração de raios x (XRD), espectroscopia de ultravioleta-visível (UV-Vis), microscopia eletrônica de transmissão (TEM), de emissão de campo Microscopia eletrônica (FESEM) e voltametria cíclica (CV). Também realizamos ensaios de estabilidade, sensibilidade e reprodutibilidade do PLA-AuNPs. Nós achamos que o PLA-AuNPs formou uma estrutura sólida de nanopartículas estabilizadas em solução aquosa. Observou-se também que a sensibilidade melhorada como resultado o valor de resistência (Rct) de transferência de carga menor e um aumento da área de superfície ativa (0,41 cm2). O desenvolvimento da nossa biosensor DNA baseou-se na modificação de um eletrodo de carbono serigrafado (SPCE) com PLA-AuNPs e usando azul de metileno (MB) como indicador redox. Foram avaliados os eventos de imobilização e hibridação por voltametria de pulso diferencial (DPV). Descobrimos que complementar, não-complementares, e oligonucleotides incompatíveis especificamente foram distinguidos pelo biosensor fabricado. Também mostrou que confiantemente sensível deteção em estudos de reatividade cruzada contra vários patógenos de origem alimentar e na identificação de V. parahaemolyticus em berbigões frescos.

Formação de AuNPs foi revelada através da mudança na cor da solução aquosa com citrato de sódio presente. Isto causou a cor mudar de amarelo claro para um vermelho rubi profundo. A geração de PLA-AuNPs foi confirmada de espectros de UV-vis (Figura 1), onde o crescimento do pico de ressonância (SPR) do plasmon de superfície foi encontrado a cerca de 540 nm. A formação e a existência de PLA-AuNPs foi indicado em intervalos de comprimento de onda 500-600 nm, dep...

Um protocolo para o desenvolvimento de um biosensor eletroquímico de DNA composta por um eletrodo de carbono ácido-estável, ouro de nanopartículas-modificado, serigrafado polilático para detectar o Vibrio parahaemolyticus é apresentado.

Desenvolvimento de um Biosensor eletroquímico do DNA para detectar um patógeno de origem alimentar

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

Os patógenos transmitidos por alimentos contribuem para uma grande proporção dos problemas de saúde pública em todo o mundo, o que afeta significativamente a taxa de mortalidade e morbidade humana. Os métodos convencionais para a detecção de patógenos transmitidos por alimentos exigem manuseio complicado de amostras e são demorados. Recentemente, os biossensores provaram ser um método de detecção promissor e abrangente, com as vantagens de detecção rápida e praticidade.O desenvolvimento de biossensores é baseado em eletrodo modificado com nanopartículas de ouro estabilizadas com ácido polilático. O eletrodo de carbono impresso em tela foi modificado para aumentar a área de superfície ativa do eletrodo de trabalho. O azul de metileno usado como complexo redox tem uma forte ligação com o DNA de fita simples do DNA da sonda imobilizada.Esta relação de alta afinidade representada por uma corrente de pico alta. A hibridização do DNA de fita simples com sua sequência complementar substitui as moléculas de azul de metileno ligadas, o que reduz a corrente da voltametria de pulso diferencial. Isso pode ter sido devido a uma menor quantidade de azul de metileno reunido na superfície do eletrodo modificado com DNA de fita dupla complementar, que foi causado pela interação inalcançável entre as bases guanina.A cor das soluções preparadas muda começando de amarelo para enegrecido e, finalmente, para vermelho rubi escuro. Isso indicou que o sal de ouro foi reduzido pelos íons citrato. O ácido polilático dissolvido foi misturado com a solução de nanopartículas de ouro previamente preparada e, em seguida, homogeneamente agitado à temperatura ambiente, que então denotado como nanopartículas de ouro estabilizadas com ácido polilático.Espectroscopia ultravioleta visível, difração de raios X, microscopia eletrônica de transmissão e microscopia eletrônica de varredura por emissão de campo com espectrometria de raios X por energia dispersiva foram utilizadas para caracterizar as nanopartículas de ouro estabilizadas com ácido polilático. Cerca de 25 microlitros da solução homogênea de nanopartículas de ouro estabilizadas com ácido polilático foram rapidamente pipetados no eletrodo de carbono impresso em tela e secos ao ar por 24 horas antes do uso. Os eletrodos modificados foram então caracterizados eletroquimicamente em ferrocianeto de potássio para medir a área de superfície ativa, espectroscopia de impedância eletroquímica, repetibilidade, reprodutibilidade e estabilidade.A otimização da condição de imobilização foi determinada usando três fatores, a concentração de DNA de fita simples variando de 0,2 a 1,4 micromolar, o tempo variando de 30 a 220 minutos e a temperatura variando de 25 a 75 graus Celsius. Por outro lado, a otimização da condição de hibridização foi determinada por meio de dois fatores, que são o tempo variando de cinco a 35 minutos e a temperatura variando de 25 a 75 graus Celsius. Os eletrodos modificados tratados foram posteriormente imersos em azul de metileno 20 micromolares por 30 minutos.O DNA não especificamente absorvido e o excesso de azul de metileno foram removidos por lavagem com tampão acetato salino pH 4,5 e depois enxaguados com água deionizada. A corrente de pico de redução do azul de metileno foi medida usando a técnica de voltametria de pulso diferencial. A medição da voltametria de pulso diferencial foi executada usando tampão fosfato com solução salina pH 7,0 que não continha indicador.Procedimento semelhante foi realizado para todas as interações. Vibrio parahaemolyticus como cepas de referência e oito outras cepas bacterianas, a saber, Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritis, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli O157:H7, Bacillus cereus e Vibrio alginolyticus do patógeno comum de origem alimentar foram empregadas para a validação do biossensor eletroquímico de DNA neste estudo. Um subcultivo de rotina de cepas bacterianas em seu respectivo ágar foi realizado a cada duas semanas para manter sua viabilidade.A quantidade de células de Vibrio parahaemolyticus foi determinada usando uma técnica de placa espalhada. Um milímetro da cultura de células da bactéria foi transferido para nove milímetros de caldo de soja tripticase contendo cloreto de sódio a 3% para obter um fator de diluição de 10. Em seguida, 0,1 mililitro de cada fator de diluição a partir de um fator de diluição de 10 a 10 vezes o fator de diluição de 10 foi espalhado em uma placa de CHROMagar Vibrio para contagem de colônias, respectivamente.As amêijoas foram obtidas no mercado úmido e rapidamente levadas ao laboratório em uma caixa frigorífica para análise. As amêijoas foram divididas em dois grupos, a saber, o grupo tratado e o grupo não tratado, com o pressuposto de que as amêijoas foram colhidas uniformemente desde o início da colheita até à sua colocação em câmara frigorífica no mercado. As amêijoas no grupo tratado foram pré-tratadas armazenando-as a menos 20 graus Celsius por 24 horas, seguidas de exposição à luz ultravioleta a 20 graus Celsius por quatro horas antes da extração do DNA.Esperava-se que a temperatura de congelamento e a exposição ultravioleta usadas para o grupo de controle o matassem ou pelo menos limitassem os patógenos transmitidos por alimentos que se acumulam naturalmente nas amêijoas. Um regime de pasteurização mais alto de 70 graus Celsius não foi aplicado, pois o objetivo da condição controlada neste estudo era mimetizar a situação real das amêijoas frescas. Enquanto isso, as amostras do grupo não tratado foram analisadas diretamente sem qualquer pré-tratamento assim que chegaram ao laboratório.As amêijoas foram lavadas em água destilada e limpas de sujeira antes da remoção dos tecidos das conchas usando uma pinça estéril e um gabinete de fluxo laminar. Cerca de 10 gramas de amostras de tecido de berbigão foram homogeneizadas com o homogeneizador em 19 mililitros de caldo de soja trypticase estéril contendo cloreto de sódio a 3% por 60 segundos. Uma quantidade conhecida de patógenos transmitidos por alimentos foi então adicionada a nove milímetros do caldo de amostra homogeneizado para as amostras enriquecidas.As amostras não enriquecidas foram utilizadas como controle negativo. Cerca de um mililitro de amostras foram pipetadas em um tubo Eppendorf para extração de amostras de DNA, que seria usado para o ensaio de biossensor e reação em cadeia da polimerase. O DNA genômico do patógeno transmitido por alimentos foi então extraído das amostras enriquecidas e não enriquecidas.O DNA genômico foi extraído após um procedimento de lise fervida modificado. O DNA genômico foi centrifugado a 12.000 rotações por minuto por três minutos a quatro graus Celsius para obter uma suspensão clara e o sobrenadante mantido a menos 20 graus Celsius para uso posterior. Um biofotômetro foi usado para determinar a concentração e pureza do DNA genômico extraído.A identidade de todas as cepas foi então determinada usando ensaios bioquímicos padrão e verificada por sequenciamento de 16 genes de RNA SR. Finalmente, o DNA genômico foi desnaturado a 92 graus Celsius por dois minutos e rapidamente resfriado em água gelada antes da aplicação do biossensor. A confirmação adicional de patógenos transmitidos por alimentos foi feita usando a reação em cadeia da polimerase direcionada ao respectivo gene.O produto amplificado e seus tamanhos foram determinados por eletroforese em gel de agarose 1,5%. As imagens em gel foram capturadas usando um sistema de documentação em gel. A geração de nanopartículas de ouro estabilizadas com ácido polilático foi confirmada a partir dos espectros ultravioleta visível, que o crescimento do plasma superficial e o pico de ressonância foram encontrados em torno de 540 nanômetros.A formação e existência de nanopartículas de ouro estabilizadas com ácido polilático foi indicada em faixas de comprimento de onda de 500 a 600 nanômetros, dependendo do tamanho da partícula. Todos os picos de cristalito de nanopartículas de ouro estabilizadas com ácido polilático foram observados nos dois teatros nos graus 31,7, 38,2, 44,4, 64,7 e 77,7. As intensidades de pico de cristalito também aumentaram à medida que picos de difração mais amplos entraram em 31,7 graus, implicando que as nanopartículas frias estavam embutidas no ácido polilático e sugerindo a formação de nanoestruturas de ouro polifásica.A partir da curva de distribuição de partículas de microscopia eletrônica de transmissão e imagens de nanopartículas de ouro estabilizadas com ácido polilático, pode-se ver que as nanopartículas de ouro são quase esféricas em forma. O tamanho das nanopartículas estava na faixa de cerca de 37 nanômetros, o que é um pouco maior do que o obtido a partir da fórmula de Scherrer, sugerindo uma natureza policristalina das nanopartículas sintetizadas. O tamanho principal das nanopartículas de ouro estabilizadas com ácido polilático foi calculado usando a equação de Sherrer, determinando a largura da reflexão de 100 Bragg.A partir da tabela, o tamanho do cristalito das nanopartículas de ouro estabilizadas com ácido polilático foi calculado em 27 nanômetros. A partir das imagens de microscopia eletrônica de varredura por emissão de campo e com espectros de raios-x por energia dispersiva, o eletrodo de carbono impresso em tela modificada teve a maior porcentagem de peso de ouro, maior densidade e maior estrutura de cobertura de nanopartículas. O espectro de raios-x por dispersão de energia confirmou que as nanopartículas de ouro estabilizadas com ácido polilático produzidas eram compostas apenas de ouro e não exibiam nenhum outro elemento, exceto o pico correspondente a carbono e oxigênio.Os potenciais de pico anódico e catódico foram consistentes em diferentes taxas de varredura, sugerindo que a reação eletroquímica foi reversível com base na separação de picos. A área de superfície ativa dos eletrodos modificados foi calculada como 0,26 centímetros quadrados e 0,41 centímetros quadrados para o eletrodo nu e o eletrodo modificado, respectivamente. Este resultado confirmou que a melhoria proporcionada pelas nanopartículas de ouro estabilizadas com ácido polilático na área de superfície ativa foi relativamente maior em comparação com o eletrodo nu.O valor da resistência de transferência de carga para o eletrodo nu foi de 1.932 ohms, enquanto o eletrodo modificado diminuiu para 1.444 ohms. A diminuição do valor da resistência de transferência de carga no eletrodo modificado pode ter resultado de uma diminuição na constante dielétrica local e/ou um aumento na espessura da dupla camada elétrica, sugerindo que o ferrocianeto de potássio funcionou por absorção na interface metal ou solução. As correntes de pico aumentaram progressivamente com a modificação do eletrodo nu usando nanopartículas de ouro estabilizadas com ácido polilático, o que mostrou que uma maior sensibilidade era o inverso da menor resistência à transferência de carga.O desvio padrão relativo do eletrodo modificado foi derivado como 4,26% O eletrodo com modificação de nanopartículas de ouro estabilizado com ácido polilático deu melhor desvio padrão relativo após várias medições. Valores de desvio padrão relativo de 4,05% para eletrodo modificado indicando melhor reprodutibilidade da fabricação do eletrodo para nanopartículas de ouro estabilizadas com ácido polilático. A concentração otimizada do DNA foi de 1,2 DNA de fita simples micromolar.O tempo ideal de imobilização do DNA de fita simples foi selecionado como 180 minutos. A temperatura ideal de imobilização do DNA de fita simples foi selecionada como 55 graus Celsius. O tempo ideal de hibridização do DNA de fita dupla foi selecionado como 10 minutos.A temperatura ideal de hibridização do DNA de fita dupla foi selecionada como 35 graus Celsius. O DNA complementar exibiu a menor corrente de pico de 0,73 microampere entre o DNA sondado, o DNA não complementar, o DNA incompatível de três bases e o DNA incompatível de uma base. É óbvio que a alta corrente do DNA que foi alvo é menor do que a corrente das outras sequências de oligonucleotídeos.Esse resultado indicou que o biossensor poderia ser usado para discriminar com alta sensibilidade e especificidade. O biossensor de DNA construído tinha uma seletividade de detecção de hibridização via DNA de sonda imobilizado na superfície do eletrodo modificado. A diminuição contínua na corrente de pico de voltametria de pulso diferencial de azul de metileno no eletrodo modificado foi desencadeada como resultado de um aumento na concentração de DNA complementar.Uma correlação linear entre o log de várias concentrações de DNA alvo de 0,2 picomolar a 0,02 milimolar e o log da corrente de pico de redução do azul de metileno é representada com um coeficiente de regressão linear de 0,96. A porcentagem de recuperação do biossensor de DNA fabricado diminuiu lentamente para não menos de 80% de seu sinal inicial após seis meses de armazenamento, indicando que a sonda de DNA de fita simples na superfície do eletrodo modificado é altamente estável. Uma boa estabilidade a longo prazo a uma temperatura abaixo de 45 graus Celsius pode ser a razão para a forte reação entre nanopartículas de ouro estabilizadas com ácido polilático e DNA de fita simples.Os produtos de amplificação da reação em cadeia da polimerase para nove espécies diferentes de bactérias, que foram Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni, Escherichia coli, Vibrio alginolyticus, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritis, Klebsiella pneumoniae e Vibrio parahaemolyticus foram rastreados. A corrente de pico de voltametria de pulso diferencial obtida após uma avaliação de reatividade cruzada mostra uma detecção muito clara de Vibrio parahaemolyticus em comparação com outras espécies de bactérias. Pode ser visto diminuindo o número de pares de bases, o sinal de voltametria de pulso diferencial observado aumenta.Isso está relacionado à maior quantidade de moléculas de azul de metileno até as sondas. A partir da análise da reação em cadeia da polimerase, o Vibrio parahaemolyticus foi encontrado nas amostras enriquecidas tratadas e não tratadas, conforme mostrado pelas pistas sete, oito, nove, 10, 11 e 12. Considerando que as amostras não enriquecidas tratadas e não tratadas nas pistas um, dois, três, quatro, cinco e seis eram desprovidas de Vibrio parahaemolyticus.Os resultados da detecção usando o biossensor de DNA desenvolvido que determinou com sucesso a presença de Vibrio parahaemolyticus no grupo tratado consistindo de amostras enriquecidas e não enriquecidas. Esses resultados se correlacionam positivamente com os resultados da reação em cadeia da polimerase discutidos anteriormente. A aplicação de nanopartículas de ouro estabilizadas com ácido polilático tem um grande potencial de aplicação como uma modificação para maior senso de fabricação.Uma alta seletividade pode ser alcançada quando o complexo redox se liga mais fortemente à molécula de biorreconhecimento não hibridizada, o que pode ser uma inovação que vale a pena acompanhar.

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