Um ensaio simples repórter baseado em fluorescência para identificar componentes celulares necessários para toxina ricina uma cadeia (RTA) o tráfico de levedura

O objetivo geral deste ensaio repórter simples baseado em fluorescência é rastrear os componentes celulares necessários para o tráfego adequado da toxina A da ricina ou da cadeia RTA no organismo modelo de levedura. Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre o transporte intercelular do ribossomo na ativação de uma toxina B. Em nosso caso, a subunidade citotóxica da toxina simples ricina da membrana plasmática para o citossomo.

A principal vantagem deste ensaio é a oportunidade de analisar o efeito de um gene de levedura individual no transporte de RTA de forma rápida e barata. Comece este protocolo com a transformação da célula, conforme detalhado no protocolo de texto. Inocular cinco mililitros de meio LB canamicina com células contendo plasmídeo de expressão RTA ou o vetor vazio.

Incube as células a 37 graus Celsius e 220 RPM por 24 horas. Suplemente um litro de meio LB canamicina com cinco mililitros de pré-cultivo. Em seguida, incube as células a 37 graus Celsius e 220 RPM até que as células atinjam uma densidade óptica de 600 nanômetros de 0,8 a 1,0.

Depois disso, reduza a temperatura da cultura para 28 graus Celsius. Induzir a expressão de E.Coli por RTA adicionando IPTG a uma concentração final de um milimolar. Após 3,5 horas a 28 graus Celsius e 220 RPM, colher as células por centrifugação a 10.000 g e quatro graus Celsius por 10 minutos.

Em seguida, lave o pellet com cinco mililitros de tampão de ligação e pellet a 10.000 g e quatro graus Celsius por 10 minutos. Depois de repetir a lavagem uma vez, suspenda novamente o pellet em cinco mililitros de tampão de ligação. Sonicar as células no gelo usando cinco ciclos de um pulso de 15 segundos e uma pausa de 30 segundos.

Depois de centrifugar o licado celular a 21 000 g e quatro graus Celsius durante 15 minutos, filtrar o sobrenadante utilizando um sistema de filtro de seringa estéril. Use um sistema de purificação automatizado, equipado com uma coluna de afinidade à base de níquel de cinco mililitros para purificar a fração RTA marcada com HIS do sobrenadante de E.Coli filtrado estéril. Em geral, use uma velocidade de alusão de um mililitro por minuto e resfrie todo o sistema de purificação para evitar a ligação não eficiente da toxina e a perda da atividade da toxina.

Equilibre brevemente a coluna de afinidade com 20 mililitros de buffer de ligação para remover o buffer de armazenamento. Em seguida, aplique o sobrenadante estéril e filtrado na coluna de afinidade usando uma seringa. Lave a coluna com 25 a 35 mililitros de tampão de ligação para remover as proteínas não ligadas da coluna.

Execute a etapa de lavagem até que os absorventes de UV a 280 nanômetros estejam próximos do valor inicial de UV. Em seguida, eluir a fração RTA ligada com 20 a 35 mililitros de tampão de eluição e manter a amostra congelada. É importante iniciar a amostragem da fração RTA logo após o aumento do valor UV, 280 e interromper a amostragem da fração RTA quando atingir a linha de base original novamente.

Para dessalinizar a fração RTA evasiva, substitua a coluna de afinidade do sistema de purificação pela coluna de dessalinização e equilibre a coluna com 20 mililitros de sorbitol 0,8 molar. Aplicar a fração de ATR iludida à coluna através de uma seringa. Lavar a coluna com 100 mililitros de sorbitol 0,8 molar e diluir a fração RTA dessalinizada num tubo de 15 mililitros assim que a absorção UV começar a aumentar.

Para evitar a contaminação por sal, pare na fração de amostragem diretamente quando a condutância aumentar. Armazene a fração RTA iludida a quatro graus Celsius. Depois de transformar a levedura conforme descrito no protocolo de texto, escolha três clones de levedura diferentes de cada placa.

Inocular os clones em 100 mililitros de meio rafinose de lucina a 220 RPM e 30 graus Celsius a uma densidade óptica de 600 nanômetros de 1,0 a 2,0. Centrifugar as células a 25 graus Celsius durante cinco minutos a 10 000 g. Depois de lavar as células duas vezes com cinco mililitros de água estéril, ressuspenda as células em 50 mililitros de tampão de esferoplaste.

Incube a cultura de 50 mililitros a 100 RPM e 30 graus Celsius por 90 minutos. Após centrifugação a 400 g e quatro graus Celsius por 10 minutos, lave as células duas vezes com cinco mililitros de meio de rafinose estabilizado com lucina. Em seguida, ressuspenda as células em cinco mililitros do mesmo meio para usar as células diretamente para as medições do ensaio repórter GFP.

Semeie os esferoplastos das células de levedura em placas de 96 poços. A cada poço, adicionar 70 microlitros de meio de rafinose de lucina estabilizada, contendo o controle negativo, expressando o vetor vazio ou RTA purificado em uma concentração final de RTA de cinco micromolares. Adicione 70 microlitros de meio de gota de lucina estabilizado a cada um dos poços restantes para elevar seu volume total para 270 microlitros.

Para um controle positivo da inibição de proteínas, adicione 70 microlitros de solução G418 estabilizada com sorbitol 0,8 molar, pois o G418 impede a expressão de GFP em leveduras. Adicione imediatamente 30 microlitros de solução de galactose estabilizada para induzir a expressão de GFP. Prepare um controle negativo adicional adicionando 30 microlitros de meio de rafinose estabilizado em vez de 30% de galactose.

Depois de terminar a preparação da amostra, coloque a placa de 96 poços em um leitor de fluorescência e prepare-se para a medição usando o conjunto de filtros de 475.509 nanômetros necessário para a detecção de fluorescência GFP. Realize medições a 30 graus Celsius, 120 RPM e um diâmetro de agitação de um milímetro em uma janela de tempo de 20 horas com intervalos de medição de 10 minutos. Aqui é mostrado um gráfico de purificação representativo da cromatografia de afinidade da RTA e do controle de vetor vazio.

O pico azul na caixa preta representa a fração RTA vinculada. Como mostrado na caixa preta, nenhuma proteína é escapada da coluna no controle negativo. Aqui é mostrado um diagrama de dessalinização de uma fração RTA purificada por afinidade.

O diagrama mostra a separação da fração de proteína RTA e da fração de sal. Os resultados da coloração de Coomassie após purificação e dessalinização bem-sucedidas mostram lisado celular ou amostras purificadas de diferentes variantes de ATR. A ATR não modificada foi utilizada neste estudo.

Para validar o ensaio repórter espaçado por fluorescência, a fluorescência relativa de GFP de esferoplastos de levedura do tipo selvagem foi medida sob condições induzidas e não induzidas após 20 horas de indução de GFP. A fluorescência relativa da GFP também foi analisada na presença de ATR, G418 ou controle negativo. A fluorescência relativa de GFP também foi medida para mutantes selecionados nos quais as proteínas correspondentes são conhecidas por estarem envolvidas e não envolvidas no tráfego de RTA em leveduras.

A linha pontilhada representou um limite de significância. Uma vez que a expressão e purificação do RTA são dominadas, os resultados do ensaio do relatório de fluorescência podem ser recebidos em um dia. Além disso, este método abre caminho para pesquisadores no campo da inativação de ribossomos de toxinas B estudarem suas raízes de intoxicação em uma levedura de organismo modelo eucariótico.