Analisando a comunicação entre monócitos e células de câncer primário da mama em uma matriz Extracellular extrair (ECME)-sistema tridimensional baseado em

O objetivo geral deste protocolo é estudar a comunicação direta e indireta entre células primárias de câncer de mama e monócitos em um sistema de co-cultura tridimensional. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no microambiente inflamatório do campo do câncer de mama, como como as células imunes são reavaliadas e ativadas, como essas células ajudam a sustentar o microambiente inflamatório do tumor e como esse microambiente facilita a invasão de células tumorais. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece uma alternativa acessível para estudar a comunicação intratumoral e ilustra o potencial dos sistemas de células 3D in vitro para interrogar características específicas da biologia tumoral.

Particularmente aqueles relacionados à agressão tumoral. Para começar, cultive duas vezes 10 elevado ao sexto monócitos U937 e THP1 em 10 mililitros de meio RPMI1640, suplementado com 10% de FBS e 1% de antibiótico antimicótico. Cultive também PMs frescos em meio DMEMF12 suplementado.

Incube as células a 37 graus Celsius em um ambiente umidificado de cinco por cento de dióxido de carbono. Plaquear quatro vezes 10 até o quinto monócitos em um mililitro por poço de seu meio correspondente. Coloque uma inserção em cada poço e adicione 900 microlitros das quatro vezes 10 à quinta suspensão de células BrC no meio correspondente.

Incube as culturas a 37 graus Celsius em um ambiente umidificado de dióxido de carbono a cinco por cento por cinco dias e recupere os sobrenadantes. Recupere as células por tripsinização se a análise subsequente for realizada. Inclua controles de culturas de células individuais com os respectivos meios.

Para marcar as células e monócitos BrC com cumerina e rodamina comercialmente disponíveis antes da cultura celular, prepare uma monocamada de duas vezes 10 elevado à sexta célula BrC de interesse e substitua o meio padrão por uma solução de trabalho pré-aquecida suficiente do corante fluorescente. Incube as células a 37 graus Celsius em um ambiente umidificado de dióxido de carbono a cinco por cento por 30 minutos. Em seguida, aspire a solução de corante e use um XPBS suficiente para enxaguar suavemente as células.

Aspirar o PBS e adicionar o meio padrão. Para tripsinizar as células, adicione dois mililitros de 05% de tripsina e 0,48 milimolar de EDTA ao frasco e incube as células a 37 graus Celsius por cinco a 10 minutos. Adicione 200 microlitros de FBS para interromper a tripsinização e sete mililitros do meio correspondente sem suplementos.

Ressuspenda as células pipetando, depois transfira 10 microlitros das células para uma câmara Nuebauer e conte-as. Em seguida, coloque as células em pellets a 430 vezes g e temperatura ambiente por cinco minutos, depois descarte o sobrenadante e use três mililitros de solução de trabalho de corante fluorescente pré-aquecido para ressuspender as células. Incube a suspensão celular a 37 graus Celsius em um ambiente umidificado de dióxido de carbono a cinco por cento por 30 minutos.

Depois de peletizar as células novamente, descarte a solução de trabalho do corante e use de cinco a sete mililitros de um XPBS para ressuspender suavemente as células. Então, depois de peletar as células mais uma vez e descartar o PBS, ressuspenda as células em cinco a sete mililitros de meio padrão. Conte 10 microlitros da suspensão celular.

Configure uma co-cultura espalhando ECME suficiente no fundo do poço para formar uma camada uniforme em cada poço de um sistema de deslizamento de quatro poços. Placa de 20 microlitros de uma única suspensão celular contendo cinco vezes 10 elevado ao quinto células BrC marcadas por poço. Após 15 a 20 minutos a 37 graus Celsius, adicione uma suspensão de 2,5 vezes 10 aos quintas monócitos marcados em 80 microlitros de meio de ensaio suplementado com 60 por cento de ECME.

Deixe o ECME solidificar a 37 graus Celsius por 15 a 20 minutos. Agora adicione um mililitro de uma mistura de um para um das células BrC e meio de cultura de monócitos. Incube as coculturas a 37 graus Celsius em um ambiente umidificado de cinco por cento de dióxido de carbono por 24 horas, 48 horas ou cinco dias para rastrear as mudanças em diferentes momentos.

Para degradar as proteínas ECM e recuperar as células das culturas, aspire e descarte o meio, em seguida, adicione 0,5 mililitros de um XPBS com 0,1% de tripsina e 0,25% de EDTA à cultura. Incube as células a 37 graus Celsius por três horas. Após a incubação, adicione 0,5 mililitros de um XPBS com 10% de FBS para neutralizar a tripsina e ressuspender as células pipetando vigorosamente para obter uma única suspensão celular.

Depois de peletizar as células, descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em cinco mililitros de um XPBS com 10% de FBS. Repita esta etapa uma vez. Submeter a suspensão da cela a fax com o instrumento apropriado.

Certifique-se de que as populações finais sejam pelo menos 95% puras. Em cada poço de um sistema de deslizamento de câmara de oito poços, espalhe uma base de 40 microlitros de ECME e deixe-a solidificar a 37 graus Celsius por 30 minutos. Semear 800 células MCF10 A por poço em 400 microlitros de meio de cultura DMEM F12 suplementado de acordo com o protocolo de texto.

Em seguida, adicione 400 microlitros de meio condicionado ou meio de cultura DMEM F12 suplementado com 20 nanogramas por mililitro de IL1 beta recombinante humano. Coloque a lâmina da câmara em uma placa de Petri de vidro contendo uma placa de Petri de 35 mililitros cheia de dois mililitros de PBS. As células MCF 10A devem ser semeadas em cada poço muito lentamente para evitar danos à base do ECME e para evitar que as células se estabeleçam e formem uma monolisia.

Usando um microscópio óptico, registre a formação de ácinos glandulares a cada 24 horas por 14 dias. Após 14 dias de cultivo, adicionar 100 microlitros de dapy 100 nanomolar em um XPBS e incubar as amostras em temperatura ambiente com agitação constante por 25 minutos. Enxágue as amostras com um XPBS à temperatura ambiente, três vezes por cinco minutos cada, agitando constantemente.

Use um meio de montagem específico para coloração fluorescente para montar as preparações. Em seguida, sele as amostras montadas com polimento transparente e mantenha as lâminas, protegidas da luz a quatro graus Celsius. Demonstrando o procedimento no microscópio confocal estará Vadim Perez, pesquisador do Laboratório Nacional de Microscoping Avançado.

Analise os ácinos com um microscópio confocal obtendo imagens de pilhas transversais em diferentes profundidades dos ácinos. Visualize diferentes proteínas celulares nos ácinos com protocolos de coloração adequados. Por exemplo, o caheren foi corado aqui para avaliar a adesão célula a célula, a polaridade celular e a formação de oralímen.

A morfologia das células primárias de BrC crescendo em culturas 3D em baixas e altas densidades foi estudada ao longo de cinco dias. Durante as primeiras 48 horas, as células aderem ao ECME com uma forma de fuso alongado e formam estruturas semelhantes a malha em cinco dias. Após cinco dias em co-culturas 3D, as células BrC comerciais MCF7 e MDA-MB-231 formaram agregados desorganizados.

No entanto, células MDA-MB-231 agressivas para agregados com formas alongadas, enquanto células MCF7 não agressivas para agregados com formas arredondadas que são mais densamente compactadas do que as células MDA-MB-231. Os sobrenadantes de culturas primárias de BrC 3D de interação indireta e suas co-culturas de cinco dias com monócitos primários foram colhidos. Níveis significativamente aumentados de IL1 beta e IL8 foram observados nas co-culturas primárias de monócitos de células BrC.

Citocinas cruciais e inflamatórias que foram previamente associadas à progressão maligna. As células MCF10A foram cultivadas com dois sobrenadantes diferentes de duas linhagens celulares primárias de BrC para observar a formação do lúmen como uma medida de resistência a anoykis. Ao contrário das células MCF10A cultivadas em condições padrão, microscopia biconfocal no dia 14, os cortes transversais dos esferóides mostram que as células MCF10A evitaram anoykis conforme medido pela contagem do número de células centrais nos ácinos.

Após este procedimento, outros métodos, como análise médica, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais. Teste as vias de sinalização em ambas as migrações do câncer. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo de microambientes tumorais explorarem as comunicações de células de câncer de mama com células de massa, fibroblastos, neutrófilos ou mesmo diferentes clones de células tumorais em sistemas de co-cultura 3D.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como estabelecer um sistema de cultura 3D para modelar o microambiente tumoral.