Efeitos diferenciais de drogas hipolipemiantes na modulação da morfologia das partículas de colesterol

O objetivo geral deste estudo é avaliar o efeito de drogas hipolipemiantes na modulação de características morfológicas de partículas de colesterol usando um método de matriz de placas e identificar potenciais biomarcadores para o diagnóstico de aterosclerose e determinar os efeitos das drogas. O papel dos medicamentos hipolipemiantes na modulação da formação de partículas de colesterol é pouco compreendido. Aqui, demonstramos que os medicamentos hipolipemiantes desempenham um papel direto na alteração dos perfis e características morfológicas da formação de partículas de colesterol.

A principal vantagem do método de imagem in vitro baseado em matriz de placas sobre outros métodos de detecção de partículas é que ele permite a visualização de partículas de colesterol para avaliar o efeito de medicamentos hipolipemiantes no soro. Jason Lundry, técnico de laboratório da Plaxgen, demonstrará como configuramos o ensaio de matriz de placas usando um analisador químico. Raymond Kong, cientista sênior da Millipore Sigma, demonstrará como fazemos o processamento de amostras usando citometria de fluxo de imagem.

Finalmente, David Liu, técnico de laboratório da Plaxgen, demonstrará a análise de dados para imagens de partículas de colesterol. Use um analisador químico-1 para configurar o ensaio de matriz de placas para a formação de partículas de colesterol. Ao longo do ensaio, manter o volume final de reação em cada poço em 200 microlitros e realizar todos os ensaios em triplicata.

Primeiro, carregue 194 vírgula cinco microlitros de solução salina tamponada com fosfato, ou PDS, em cada poço de uma placa de 96 poços de fundo redondo e baixa ligação a proteínas. Para cada poço, adicione dois vírgula cinco microlitros de cada solução de medicamento hipolipemiante, nenhum medicamento é adicionado às amostras de controle negativo. Em seguida, agite a placa por 30 segundos, colocando-a na placa de reação do analisador químico-1 para misturar uniformemente o medicamento em solução.

Finalmente, adicione dois microlitros de solução agregada de colesterol marcada com fluorescência a cada poço. Agite a placa por 30 segundos, colocando-a na placa de reação do analisador químico-1 como antes. Em seguida, incube a placa em um agitador de laboratório por duas horas ajustadas a 37 graus Celsius e 200 rpm.

Após a incubação, adquira as imagens das partículas por citometria de fluxo por imagem. Abra o modelo de aquisição de dados para carregar as configurações corretas do instrumento. Clique em Arquivo, selecione Carregar modelo e selecione o arquivo de modelo.

Clique em Carregar para preparar o instrumento para o carregamento da amostra. Quando a caixa de diálogo Carregar amostra for aberta, clique em OK para carregar 50 microlitros das amostras no citômetro de fluxo de imagem. Aguarde até que as partículas possam ser vistas na área de imagem em tempo real.

Quando as partículas na área de imagem estiverem em bom foco, clique em Adquirir para adquirir imagens de cada objeto simultaneamente de maneira de alto rendimento para campo escuro, campo claro, fluorescência verde e fluorescência amarela. No final da aquisição, clique no botão Retornar para retornar a amostra. Repita essas etapas para adquirir de 5.000 a 10.000 partículas de cada amostra.

Analise todos os arquivos de imagem bruta usando o software de análise de imagem para determinar a intensidade de fluorescência do objeto e as variações morfológicas, conforme descrito no protocolo de texto. Prepare uma placa de 96 poços de baixa ligação a proteínas de fundo redondo carregando reagentes de maneira gradual, usando um volume de reação final de 200 microlitros por poço. Primeiro, prepare os poços de controle.

Carregue 193 microlitros de PBS em cada poço. Adicione 2,5% do soro do paciente, carregando apenas uma amostra de soro por poço. Em seguida, agite a placa por 30 segundos, colocando-a na placa de reação do analisador químico.

Em seguida, adicione dois microlitros de solução agregada de colesterol marcada com fluorescência em cada poço. Novamente, agite a placa por 30 segundos, colocando-a na placa de reação do analisador químico-1. Para preparar os poços com medicamentos, carregue 191 microlitros de PBS em cada poço.

Em seguida, adicione 2,5% de cada soro do paciente por poço e agite a placa por 30 segundos, colocando-a em uma placa de reação do analisador químico-1. Adicione dois microlitros de solução de ezetimiba, lovastatina, sinvastatina ou niacina a todos os poços, exceto os poços de controle negativo. Adicionando apenas um medicamento por poço.

Agite a placa por 30 segundos como antes. Em seguida, adicione dois microlitros de solução agregada de colesterol marcado com fluorescência em cada poço antes de agitar a placa por 30 segundos. Em seguida, incube a placa por duas horas em um agitador de laboratório, ajustado para 37 graus Celsius e 200 rpm.

Após a incubação, adquira as amostras por citometria de fluxo de imagem seguindo as mesmas configurações de antes. Use o software de análise de imagem para processar em lote todos os arquivos de imagem conforme descrito no protocolo de texto. Aqui são mostrados resultados representativos que mostram a identificação de partículas de colesterol globulares e lineares em forma de fita, induzidas por estatinas, por um mecanismo não enzimático.

A confirmação de duas morfologias distintas da formação de partículas de colesterol, induzidas por outras drogas hipolipemiantes, é mostrada. Incluindo ezetimiba, niacina, fibrato e ácido graxo ômega-3. Aqui são mostrados gráficos de pontos, onde o eixo X exibe um espectro de partículas de colesterol detectadas no canal de fluorescência verde.

E o eixo Y exibe dispersão lateral, gating mostra regiões de lipoproteína de densidade muito baixa, lipoproteína de baixa densidade e partículas de lipoproteína de alta densidade, detectadas nos gráficos de pontos de fluorescência. Esses resultados demonstram como o efeito hipolipemiante altera os perfis de partículas purificadas de VLDL e colesterol LDL, na presença de nenhum fármaco, ezemida, lovastatina, sinvastatina e niacina. Aqui é mostrada uma tela de três amostras de soro diferentes para a identificação de um efeito diferencial de vários medicamentos hipolipemiantes, que modulam os perfis de formação de partículas de colesterol VLDL, LDL e HDL.

Esses perfis indicam que também há uma variação nos níveis de resposta entre as três diferentes amostras de soro. A triagem da amostra de soro um para partículas de colesterol globulares e lineares formadas sem a droga e na presença de várias drogas hipolipemiantes, confirma duas morfologias distintas de partículas de colesterol derivadas do soro, exibindo formas de fita globular e linear. Portanto, demonstramos com sucesso uma abordagem de imagem in vitro para identificação do efeito de drogas hipolipemiantes, que modulam a relação com a formação de partículas de colesterol e seu significado clínico.

Nossos resultados preliminares são promissores e estamos no processo de validar ainda mais este ensaio de matriz de placas usando amostras clínicas em larga escala. Seu painel lipídico padrão mede os níveis de colesterol LDL e HDL no soro. Nosso ensaio de matriz de placas espera melhorar a precisão do risco de aterosclerose e prevê a resposta a medicamentos hipolipemiantes usando soro.