Name: Efeitos diferenciais de drogas hipolipemiantes na modulação da morfologia das partículas de colesterol (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Descubra como drogas hipolipemiantes alteram a morfologia das partículas de colesterol usando o método de plaque array. Esta abordagem de imagem in vitro permite visualizar perfis de VLDL e LDL para identificar biomarcadores de aterosclerose.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi financiado por uma pesquisa Plaxgen subsídio concedido a SM (PLX-1008). Agradecemos a Palo Alto Medical Research Foundation Research Institute para a coleta de amostras de soro de indivíduos aterosclerose sob aprovação do IRB.

1. preparação de fluorescente-etiquetadas colesterol e drogas hipolipemiantes Nota: agregados de colesterol fluorescente-etiquetadas e estatinas foram preparadas conforme descrito em nosso artigo anterior 21. para obter detalhes dos reagentes, citômetro de fluxo, analisadores químicos e software de análise de dados utilizados neste estudo de imagem, consulte Tabela de materiais.
<ol><li>Solubilizar colesterol liofilizado fluorescente-etiquetadas (1 mg, Ex / Em = 495 nm nm/507) em pó em 1 mL de álcool a 100%.</li>
	<li>Centrifugar a amostra para 3 min a 2.040 x g e usar os sobrenadantes contendo agregados de colesterol de fluorescência-etiquetada solúvel no ensaio da matriz chapa.</li>
	<li>Para a preparação de drogas, individualmente solubilizar os pós (2 mg) de omega-3 ácidos graxos em 1 ml de álcool a 100%, lovastatina, Atorvastatina, ezetimiba e sinvastatina.</li>
	<li>Após a centrifugação por 3 min a 2.040 x g, use os sobrenadantes contendo drogas no ensaio de.</li>
	<li>Da mesma forma, solubilizar individualmente os pós (2 mg) de fluvastatina, rosuvastatina, niacina e fibratos em 1 mL de água desionizada para fazer uma solução stock de 2 mg/mL.</li>
	<li>Após a centrifugação por 3 min a 2.040 x g, use os sobrenadantes contendo drogas no ensaio da matriz chapa.</li>
</ol> 2. Ensaio de placa matriz para análise In Vitro e de formação de partículas de colesterol <ol><li>uso química analisador-1 (consulte a tabela de materiais) para configurar o ensaio da chapa de matriz para a formação de partículas de colesterol. Realize o ensaio em um fundo redondo, placa de 96 poços de ligação baixa proteína usando os reagentes preparados na secção 1. Manter o volume final de reação em cada poço em 200 µ l e realizar todos os ensaios em triplicado.
	<ol><li>Primeiro, carga 194.5 µ l de fosfato tampão salino (PBS) para cada poço.</li>
		<li>Para cada poço, adicionar 2,5 µ l (5 µ g) de cada solução de drogas hipolipemiantes e agitar a placa por 30 s, colocando-o no prato de analisador-1 reação química a misturar uniformemente a droga na solução. Nenhuma droga é adicionada para as amostras de controlo negativo.</li>
		<li>Finalmente, adicionar solução agregada de colesterol fluorescente-etiquetadas µ l (2 µ g) 2 a cada poço e agitar a placa por 30 s, colocando-o no prato de analisador-1 reação química.</li>
		<li>Incubar a placa num agitador de laboratório para 2 h a 37 ° C e 200 rpm.</li>
		<li>Após a incubação, adquirir as imagens de partículas por citometria de fluxo de imagem.</li>
	</ol></li></ol> 3. Capturar imagens de colesterol partículas usando Imaging Flow Cytometry <ol><li>abrir o modelo de aquisição de dados para carregar as configurações corretas do instrumento. Clique em " arquivo ", em seguida, selecione " modelo aberto … " e selecione o arquivo de modelo.</li>
	<li>Clique " carga de Flush, fechamento, " para preparar o instrumento para o carregamento de amostra.</li>
	<li>Quando o " carregar amostra " abre caixa de diálogo, clique " Okey " carregar 50 µ l das amostras de cada bem preparado na secção 2 no citômetro de fluxo de imagem.</li>
	Clique <li>" executar | Configuração " para visualizar as partículas na área de imagem em tempo real.</li>
	Clique em <li>quando as partículas na área de imagem estão em foco bom, " executar | Adquirir " para adquirir imagens de cada objeto simultaneamente de forma elevado-throughput para campo escuro (lado dispersão/SSC), campo claro (BF), fluorescência verde e amarela fluorescência.</li>
	<li>Repita os passos para adquirir 5.000-10.000 partículas de cada amostra de 3,2-3.5.</li>
	<li>Analisar todos os arquivos de imagem raw usando o software de análise de imagem para determinar a intensidade de fluorescência do objeto e variações morfológicas.
	<ol><li>Clique o " ferramentas " botão no topo do software de análise de imagem e, em seguida, selecione " arquivos de dados do lote " do menu drop-down, que irá abrir o " lotes " janela.</li>
		<li>No " lotes " janela, clique no " adicionar lote " botão, que irá abrir o " definir um lote " janela.</li>
		<li>No " definir um lote " janela, clique no " adicionar arquivos " botão e selecione os arquivos de imagem raw, clique no " modelo " botão e selecione o arquivo de modelo de análise de dados apropriados e, em seguida, selecione " Okey " e " enviar lotes " para iniciar o processamento e análise dos arquivos de imagem raw.</li>
	</ol></li></ol> 4. Placa matriz ensaio com base em avaliação de hipolipemiantes drogas efeito sobre partículas de colesterol purificado <ol><li>, conforme descrito no passo 2.1, realizar o ensaio de formação de partículas de colesterol lipoproteínas/partículas purificado de HDL, LDL e VLDL. Realizar o ensaio da chapa de matriz em uma placa de 96 poços.
	<ol><li>Primeiro, carregar todos os poços com PBS; use um volume final de 200 µ l de cada poço.</li>
	</ol></li> <li>Para o controle negativo, adicionar 4 µ g VLDL, LDL, ou proteínas/partículas de HDL individualmente em cada bem sem drogas e agitar a placa por 30 s.
	<ol><li>Para examinar o efeito de drogas hipolipemiantes, adicionar 4 µ g VLDL, LDL, ou proteínas/partículas de HDL individualmente a cada bem e agitar a placa por 30 s.</li>
		<li>Para poços adicionados com 4 µ g VLDL, LDL ou HDL, adicionar 2,5 µ l (5 µ g) de ezetimiba, sinvastatina, lovastatina ou niacina de solução e agitar a placa por 30 s, colocando-o no analisador de química-1.</li>
		<li>Finalmente, adicionar solução agregada de fluorescência-etiquetada colesterol µ l (2 µ g) 2 a todos os poços e agitar a placa por 30 s, colocando-o no prato de analisador-1 reação química.</li>
	</ol></li> <li>Incubar a placa por 2h em um shaker de laboratório situado a 37 ° C e 200 rpm.</li>
	<li>Adquirir as amostras usando citometria de fluxo de imagem seguindo passos 3.1-3.5.</li>
	<li>Analisar arquivos de imagem raw usando o software de análise de imagem, conforme descrito na etapa 3.7.</li>
	<li>No modelo de análise, use o seguinte esquema associado para identificação de subpopulações de partículas de colesterol.
	<ol><li>Em um terreno de contagem de pixels verde canal saturado (eixo x) e canal de campo escuro a contagem de pixels saturados (eixo y), rejeitar objetos com um ou mais pixels saturados em qualquer canal.</li>
		<li>Sinopse as objetos/partículas sem pixels saturados usando intensidade canal verde (eixo x) e intensidade SSC (eixo y): objetos caem em uma das três regiões (VLDL, LDL, HDL) baseadas no seu canal verde e intensidades SSC. 
		Nota: Estes portões foram criados com baseados nos dados gerados a partir de experiências de controle realizadas usando HDL, LDL e VLDL partículas/proteínas purified sem a droga.</li>
	</ol></li> <li>Para determinar o efeito de drogas hipolipemiantes para cada amostra, calcular as concentrações de partículas de lipoproteína total, bem como a percentagem de cada subpopulação (VLDL, LDL, HDL) como descrito no passo 6.5.
	<ol><li>Calcular a partícula concentrações (partículas/mL), utilizando a seguinte equação: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56596/56596eq1.jpg"> Nota: O VLDL, LDL e HDL gating regiões na fluorescência ponto-trama detectar ~ 80% de seus respectivas subpopulações e os restantes ~ 20% das partículas se sobrepõem com outras regiões associadas.</li>
	</ol></li></ol> 5. Medição das concentrações de lipídios nas amostras de soro <ol><li>para determinar as concentrações de LDL, HDL, colesterol e triglicérides pelo analisador de química-2, usar amostras de soro obtidas de indivíduos normais e dislipidemia correspondência idade.</li>
	<li>Definir concentração anormal de LDL, HDL, colesterol e triglicérides com base na sua concentração identificada além dos valores de referência superior e inferior em amostras de soro.</li>
	<li>Siga a valor de referência normal as recomendaçõesDED pelo fabricante do reagente: colesterol (4-200 mg/dL), HDL (3.0-65 mg/dL), LDL (4-100 mg/dL) e triglicerídeos (9-200 mg/dL).</li>
	<li>Identificar amostras de soro que têm um valor anormal como abaixo do valor de referência inferior ou superior a referência maior valor para o colesterol e triglicérides e usá-los para a seleção na presença e na ausência de drogas hipolipemiantes.</li>
</ol> 6. Analisando o efeito das drogas na formação de partículas de colesterol em amostras de soro <ol><li>uso a química analisador-1 para configurar o ensaio da chapa de matriz para a formação de partículas de colesterol em amostras de soro. Realize o ensaio em um fundo redondo, placa de 96 poços de ligação de baixa proteína. Utilizar um volume final de reação de 200 µ l/poço e realizar todos os ensaios em triplicado.</li>
	<li>Preparar o prato por carregar os reagentes de forma gradual.
	<ol><li>Preparar os poços controle.</li>
		<li>Carga 193 µ l de PBS a cada poço.</li>
		<li>Adicionar 2,5% (v/v) de soro (amostra de apenas um soro por alvéolo) e agitar a placa por 30 s, colocando-o no prato de reação química analisador.</li>
		<li>Adicionar 2 µ l (2 µ g) de colesterol fluorescência-etiquetada agregar solução em cada poço e agitar a placa por 30 s, colocando-o em um prato de analisador-1 reação química.</li>
	</ol></li> <li>Preparar os poços com drogas.
	<ol><li>µ L 191 de carga de PBS a cada poço.</li>
		<li>Adicionar 2,5% (v/v) de soro (amostra de apenas um soro por alvéolo) e agitar a placa por 30 s, colocando-o em um prato de analisador-1 reação química.</li>
		<li>Adicionar 2 µ l a ezetimiba, lovastatina, sinvastatina ou niacina solução (4 µ g) para todos os poços excepto os poços de controle negativo. Adicione apenas uma droga por bem e agitar a placa por 30 s, colocando-o em um prato de analisador-1 reação química.</li>
		<li>Adicionar 2 µ l de fluorescência-etiquetada colesterol agregar a solução (2 µ g) em cada poço e agitar a placa por 30 s, colocando-o no prato de analisador-1 reação química.</li>
	</ol></li> <li>Carregar drogas somente após todos os poços (controle e tratados com drogas) foram carregados com suas respectivas amostras e adicionar colesterol fluorescência-etiquetada no final desta etapa.</li>
	<li>Incubar a placa por 2h em um shaker de laboratório situado a 37 ° C e 200 rpm.</li>
	<li>Adquirir as amostras por imagem citômetro de fluxo seguindo as configurações descritas nas etapas 3.1-3.6.</li>
	<li>Usar a software para todos os arquivos de imagem usando o mesmo modelo, como descrito nos passos 3.7 de processamento em lote de análise de imagens.
	<ol><li>Realizar a análise de dados por portões de desenho sobre a trama, conforme descrito nas etapas 4.5 e 4.6.</li>
	</ol></li> <li>Para determinar a hipolipemiantes drogas efeito/resposta (baixa, moderada e alta) para cada amostra, calcular a concentração de partículas de lipoproteína total, bem como a percentagem da composta de totais partículas de HDL, LDL e VLDL subpopulações.</li>
	<li>Sinopse os HDL, LDL e VLDL populações em um histograma do objeto ' s imagem de campo claro, largura subtraída de comprimento (comprimento - largura) e o portão em regiões globulares ou lineares: objetos com (comprimento - largura) ≤ 2 µm cair o região globular para calcular a percentagem de globulares e linear em forma de partículas.</li>
	<li>Comparar a porcentagem de globulares e linear em forma de LDL e HDL colesterol partículas identificados para cada amostra de soro incubada com e sem cada droga. Entre três vias valores obtidos para cada amostra de soro, aceitar a porcentagem de globulares e linear em forma de partículas de LDL e HDL que caem dentro do intervalo de ± 2 SD para determinação do efeito droga.</li>
</ol>

<ol><li>Pahan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-lowering+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Lipid-lowering drugs.</a> Cell Mol Life Sci. 63, 1165-1178 (2006).</li>
<li>Laforest, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+low+high-density+lipoprotein+cholesterol+and+hypertriglyceridaemia+in+patients+treated+with+hypolipidaemic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Cardiovasc+Dis%22%5BJournal%5D)">Prevalence of low high-density lipoprotein cholesterol and hypertriglyceridaemia in patients treated with hypolipidaemic drugs.</a> Arch Cardiovasc Dis. 102, 43-50 (2009).</li>
<li>Roberts, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preventing+and+arresting+coronary+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Preventing and arresting coronary atherosclerosis.</a> Am Heart J. 130, 580-600 (1995).</li>
<li>Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+century+of+cholesterol+and+coronaries%3A+from+plaques+to+genes+to+statins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A century of cholesterol and coronaries: from plaques to genes to statins.</a> Cell. 16, 161-172 (2015).</li>
<li>Drexel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statins%2C+fibrates%2C+nicotinic+acid%2C+cholesterol+absorption+inhibitors%2C+anion-exchange+resins%2C+omega-3+fatty+acids%3A+which+drugs+for+which+patients%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Fundam+Clin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Statins, fibrates, nicotinic acid, cholesterol absorption inhibitors, anion-exchange resins, omega-3 fatty acids: which drugs for which patients?</a> Fundam Clin Pharmacol. 23, 687-692 (2009).</li>
<li>Camelia, S., Anca, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statins%3A+Mechanism+of+action+and+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J.Cell.Mol.Med%22%5BJournal%5D)">Statins: Mechanism of action and effects.</a> J.Cell.Mol.Med. 5, 378-387 (2001).</li>
<li>Schaefer, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparisons+of+effects+of+statins+%28atorvastatin%2C+fluvastatin%2C+lovastatin%2C+pravastatin%2C+and+simvastatin%29+on+fasting+and+postprandial+lipoproteins+in+patients+with+coronary+heart+disease+versus+control+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Comparisons of effects of statins (atorvastatin, fluvastatin, lovastatin, pravastatin, and simvastatin) on fasting and postprandial lipoproteins in patients with coronary heart disease versus control subjects.</a> Am J Cardiol. 93, 31-39 (2004).</li>
<li>Meyers, C. D., Kamanna, V. S., Kashyap, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niacin+therapy+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+in+Lipid%22%5BJournal%5D)">Niacin therapy in atherosclerosis.</a> Curr Opin in Lipid. 15, 659-665 (2004).</li>
<li>Phan, B. A., Dayspringm, T. D., Toth, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ezetimibe+therapy%3A+mechanism+of+action+and+clinical+update%5BTitle%5D)+AND+%22Vasc+Health+Risk+Mana%22%5BJournal%5D)">Ezetimibe therapy: mechanism of action and clinical update.</a> Vasc Health Risk Mana. 8, 415-427 (2012).</li>
<li>Leitersdorf, E., Fruchart, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+action+of+fibrates+on+lipid+and+lipoprotein+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Mechanism of action of fibrates on lipid and lipoprotein metabolism.</a> Circulation. 98, 2088-2093 (1998).</li>
<li>Backes, J., Anzalone, D., Hilleman, D., Catini, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+relevance+of+omega-3+fatty+acids+in+the+management+of+hypertriglyceridemia%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids+Health+Dis%22%5BJournal%5D)">The clinical relevance of omega-3 fatty acids in the management of hypertriglyceridemia.</a> Lipids Health Dis. 15, 118(2016).</li>
<li>Davidson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Significance+of+Statin+Pleiotropic+Effects+Hypotheses+Versus+Evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Clinical Significance of Statin Pleiotropic Effects Hypotheses Versus Evidence.</a> Circulation. 111, 2280-2281 (2005).</li>
<li>Chinetti-Gbaguidi, G., Fruchart, J. C., Staels, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotropic+effects+of+fibrates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Atheroscler+Rep%22%5BJournal%5D)">Pleiotropic effects of fibrates.</a> Curr Atheroscler Rep. 7, 396-401 (2005).</li>
<li>McTaggart, F., Jones, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Statins+on+High-Density+Lipoproteins%3A+A+Potential+Contribution+to+Cardiovascular+Benefit+Effects+of+Statins+on+High-Density+Lipoproteins%3A+A+Potential+Contribution+to+Cardiovascular+Benefit%5BTitle%5D)+AND+%22CardiovascDrugs+Ther%22%5BJournal%5D)">Effects of Statins on High-Density Lipoproteins: A Potential Contribution to Cardiovascular Benefit Effects of Statins on High-Density Lipoproteins: A Potential Contribution to Cardiovascular Benefit.</a> CardiovascDrugs Ther. 22, 321-338 (2008).</li>
<li>Quehenberger, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Human+Plasma+Lipidome%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">The Human Plasma Lipidome.</a> N Engl J Med. 365, 1812-1823 (2011).</li>
<li>Lund-Katz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+responsible+for+the+compositional+heterogeneity+of+nascent+high+density+lipoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mechanisms responsible for the compositional heterogeneity of nascent high density lipoprotein.</a> J. Biol Chem. 288, 23150-23160 (2013).</li>
<li>Krauss, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoprotein+subfractions+and+cardiovascular+disease+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Lipidol%22%5BJournal%5D)">Lipoprotein subfractions and cardiovascular disease risk.</a> Curr Opin Lipidol. 21, 305-311 (2010).</li>
<li>Krauss, R. M., Burke, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multiple+subclasses+of+plasma+low+density+lipoproteins+in+normal+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of multiple subclasses of plasma low density lipoproteins in normal humans.</a> J Lipid Res. 23, 97-104 (1982).</li>
<li>Rosenson, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDL+measures%2C+particle+heterogeneity%2C+proposed+nomenclature%2C+and+relation+to+atherosclerotic+cardiovascular+Events%5BTitle%5D)+AND+%22Clinic+Chemi%22%5BJournal%5D)">HDL measures, particle heterogeneity, proposed nomenclature, and relation to atherosclerotic cardiovascular Events.</a> Clinic Chemi. 57, 392-410 (2011).</li>
<li>Madasamy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plaque+array+method+and+proteomics-based+identification+of+biomarkers+from+Alzheimer%27s+disease+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Plaque array method and proteomics-based identification of biomarkers from Alzheimer's disease serum.</a> Clin Chim Acta. 441, 79-85 (2015).</li>
<li>Madasamy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonenzymatic+Mechanism+of+Statins+in+Modulating+Cholesterol+Particles+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Nonenzymatic Mechanism of Statins in Modulating Cholesterol Particles Formation.</a> Am J Cardiol. 118, 1187-1191 (2016).</li>
<li>Peter, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+relevance+of+the+biochemical%2C+metabolic%2C+and+genetic+factors+that+influence+low-density+lipoprotein+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Clinical relevance of the biochemical, metabolic, and genetic factors that influence low-density lipoprotein heterogeneity.</a> Am J Cardiol. 90, 30-47 (2002).</li>
<li>Weissglas-Volkov, D., Pajukanta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+causes+of+high+and+low+serum+HDL-cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Genetic causes of high and low serum HDL-cholesterol.</a> J Lipid Res. 51, 2032-2057 (2010).</li>
<li>Abela, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+statins+on+cholesterol+crystallization+and+atherosclerotic+plaque+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Effect of statins on cholesterol crystallization and atherosclerotic plaque stabilization.</a> Am J Cardiol. 107, 1710-1717 (2011).</li>
<li>Nidorf, S. M., Eikelboom, J. W., Thompson, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cholesterol+crystal-induced+inflammation+for+the+secondary+prevention+of+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeting cholesterol crystal-induced inflammation for the secondary prevention of cardiovascular disease.</a> Cardiovasc Pharmacol Ther. 19, 45-52 (2014).</li>
<li>Thacker, S. G., Zarzour, A., Chen,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+density+lipoprotein+reduces+inflammation+from+cholesterol+crystals+by+inhibiting+inflammasome+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol%22%5BJournal%5D)">High density lipoprotein reduces inflammation from cholesterol crystals by inhibiting inflammasome activation.</a> Immunol. 149, 306-319 (2016).</li>
<li>Kim, S. H., Lee, E. S., Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+coherent+anti-stokes+Raman+Spectroscopy+images+intact+atheromatous+lesions+and+concomitantly+identifies+distinct+chemical+profiles+of+atherosclerotic+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Multiplex coherent anti-stokes Raman Spectroscopy images intact atheromatous lesions and concomitantly identifies distinct chemical profiles of atherosclerotic lipids.</a> Circ Res. 106, 1332-1341 (2010).</li>
<li>Lim, R. S., Suhalim, J. L., Miyazaki-Anzai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cholesterol+crystals+in+plaques+of+atherosclerotic+mice+using+hyperspectral+CARS+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of cholesterol crystals in plaques of atherosclerotic mice using hyperspectral CARS imaging.</a> J Lipid Res. 52, 2177-2186 (2011).</li>
<li>Rothblat, G. H., Phillips, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+lipoprotein+heterogeneity+and+function+in+reverse+cholesterol+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Lipidol%22%5BJournal%5D)">High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport.</a> Curr Opin Lipidol. 21, 229-238 (2011).</li>
<li>Kontush, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDL+particle+number+and+size+as+predictors+of+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+in+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">HDL particle number and size as predictors of cardiovascular disease.</a> Front in Pharmacol. , (2015).</li>
<li>Karathanasis, S. K., Freeman, L. A., Gordon, S. M., Remaley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+changing+face+of+HDL+and+the+best+way+to+measure+it%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">The changing face of HDL and the best way to measure it.</a> Clin. Chem. 63, 196-210 (2017).</li>
</ol>

Dr. Madasamy recebeu o apoio de concessão de Plaxgen, Inc e tem um interesse financeiro concorrente. Os outros autores têm sem interesses financeiros concorrentes para divulgar.

Em geral, a distribuição e propriedades funcionais das partículas de colesterol HDL, LDL e VLDL na circulação sanguínea são determinadas principalmente pela metabólico, genético, epidemiológico, celular e plasma fatores22,23. No presente estudo, analisar os efeitos da modificação de lipídios drogas no buffer revelaram que drogas altamente lipofílicas como a ezetimiba, sinvastatina, lovastatina e atorvastatina induziram uma complexidade de nível superior na morfologia das partículas de colesterol em comparação com o efeito de nível mais baixo observado com drogas altamente hidrofílicas de Rosuvastatina e fluvastatina. Estes resultados estão em boa concordância com nosso estudo anterior, descrevendo um efeito não enzimáticos mecanismo baseado das estatinas em LDL e HDL formação de partículas de colesterol no buffer e soro amostras21de modulação. Por conseguinte, os resultados do presente estudo revelaram um mecanismo não-enzimática de ação da ezetimiba, fibrato, niacina e ácido graxo ômega-3 drogas que podem desempenhar um papel directo na formação de partículas de colesterol de modulação. É possível que as interações entre drogas e agregados de colesterol leva à assembleia de partículas de colesterol de grandes dimensões que são 2-60 µm2, exibindo morfologias vertente globulares e linear.
Além disso, os resultados obtidos usando partículas de lipoproteína purificada sugerem interações entre agregados de colesterol e fatores de plasma, incluindo proteínas HDL, LDL e VLDL que podem alterar as composições e propriedades morfológicas do colesterol partículas. Os resultados do tratamento de drogas envolvendo partículas de lipoproteína purificada indicam um efeito de drogas de nível superior na formação de partículas de VLDL em relação ao seu efeito observado na formação de partículas de colesterol LDL. As ezetimiba, sinvastatina e lovastatina drogas foram usadas como pro-drogas e suas doses em ensaios podem ser maiores do que as concentrações fisiológicas.
Curiosamente, triagem de amostras de soro mostrou variações do efeito de drogas em alterar os perfis de formação de partículas de colesterol HDL, LDL e VLDL, especialmente seus efeitos sobre as formações da linear em forma de partículas de LDL e HDL. Estas drogas induziram redução linear em forma de LDL e HDL formação de partículas de colesterol em dislipidemia e amostras de soro normal de idade correspondente. Os efeitos de droga observados na redução da formação de partículas de forma linear foi maior no ezetimiba, sinvastatina, lovastatina e niacina. A identificação das partículas de colesterol com morfologias vertente globulares e linear nas amostras de soro normal e dislipidemia sugere que as partículas com morfologias semelhantes podem formar em condições na vivo . Estudos anteriores identificaram a presença de disco e cristais de colesterol de agulha-como na ateroma de humanos e ApoE- / - e LDLR- / - ratos modelos24,25,26 ,de27,28.
As partículas de HDL circulantes no sangue existem como uma mistura heterogênea e o nível das partículas de HDL de pequeno e grande porte juntamente com atividade funcional são fatores importantes para exercer seu efeito cardio-protetor através do transporte reverso de colesterol percurso de29,30. Estudos recentes salientaram a importância de identificar subfractions de partículas HDL colesterol para elucidar seu papel em várias funções biológicas como o efluxo de colesterol, anti-inflamatório, anti-trombótica e antioxidativo31 . Além disso, vários estudos têm relatado o efeito da terapia de hipolipemiantes em aumentar um ponto baixo para moderar o nível de HDL no plasma1,5,21. Nesse sentido, os resultados deste estudo fornecem introspecções novas em características morfológicas das partículas de colesterol. Notavelmente, a detecção de um maior nível de linear em forma de partículas de HDL colesterol nas amostras de soro de dislipidemia assuntos sugere que eles podem ser o biomarcador confiável para diagnóstico e avaliar os efeitos da modificação de lipídios drogas em pacientes. No entanto, mais investigação é necessária usando grandes amostras clínicas para entender melhor as partículas de colesterol com morfologias distintas e sua associação à DCV.
No ensaio de matriz da chapa para examinar o efeito de drogas no conjunto de partículas de colesterol, usamos 2 µ g de fluorescência rotulado agregados de colesterol e 5 µgof cada droga porque: (1) drogas competitivamente ligar para ambos fluorescência rotulado de colesterol e endógenos lípidos presentes nas amostras de soro; (2) de cada amostra, adquirimos as partículas de colesterol de 5.000 a 10.000 que são montadas em grandes tamanhos e formas, que variam de ~ 2-60 µ2; (3) observamos um variações de resposta de drogas entre as amostras de soro, incubadas com as drogas (doses 300 ng de 5 µ g) e ~ 15% deles incubadas com altas doses não mostrou nenhuma alteração detectável no perfil de formação de partículas de colesterol; e (4) a interação entre agregados de colesterol e drogas hipolipemiantes é mediada por um processo não enzimáticos. Portanto, as concentrações dos reagentes usados no ensaio podem ser superiores a seu nível fisiológico.
Em conclusão, temos com sucesso demonstrado as vantagens de um em vitro método descrito neste estudo para determinar o efeito de um amplo espectro de drogas hipolipemiantes na morfologia e composição de colesterol de modulação de imagem partículas. A abordagem de Visualizar e quantificar a morfologia das partículas de lipídios, empregando uma constelação de algoritmos de análise de imagem pode ajudar o diagnóstico de aterosclerose e avaliar os resultados da terapia de hipolipemiantes em pacientes.

Numerosos estudos clínicos têm demonstrado os efeitos benéficos das drogas hipolipemiantes em reduzir os níveis plasmáticos de colesterol de lipoproteínas de baixa densidade (LDL) e um baixo a moderado nível de aumento do colesterol da lipoproteína de alta densidade (HDL), que impede a incidência de primária e secundária de eventos cardiovasculares adversos relacionados à aterosclerose1,2,3,4,5. Estatinas, um grupo de inibidores da HMG-CoA redutase enzima, bloqueiam a síntese endógena de colesterol no fígado que, em vez de chumbo para abaixar circulando os níveis de colesterol LDL no sangue6,7. Da mesma forma, os lipídios diminuindo o efeito de niacina é mediado pela sua inibição direta e não-competitivas de hepatócito diacilglicerol aciltransferase-2, uma enzima hepática chave envolvidos na síntese de triglicérides8. Comparativamente, a ezetimiba reduz o nível plasmático de LDL, limitando a absorção do colesterol exógeno por ligação a proteína 1 de C1-Like de Niemann-Pick (NPC1L1) localizada nas células epiteliais do intestino delgado9. Fenofibrato, outro drogas hipolipemiantes, reduz substancialmente as concentrações plasmáticas de triglicérides e também moderadamente diminui o colesterol LDL através o Peroxissoma proliferator-activated receptores via10. Além disso, o ácido graxo ômega-3 é relatado para ter o efeito antiaterosclerótico devido à sua capacidade para reduzir os níveis plasmáticos de LDL11.
As drogas hipolipemiantes, além de seu efeito primário na redução de colesterol LDL, têm um número de efeitos pleiotrópicos benéficos, incluindo realçando o nível de HDL, melhorando funções endoteliais, reduzir a inflamação e inibição plaquetária agregações12,13,14. No entanto, o mecanismo subjacente destas drogas no aumento de partículas de colesterol HDL e modificando suas características estruturais não são totalmente compreendidos. Uma vez que estes medicamentos são amplamente prescritos para tratar doenças cardiovasculares relacionadas com a aterosclerose (doenças cardiovasculares), é essencial para investigar suas possíveis funções na determinação das características morfológicas e distribuição das partículas de lipídios. O plasma humano lipidome consiste de aproximadamente 600 distintos lípidos e 22 tipos diferentes de moleculares de colesterol que estão presentes em vários tamanhos, formas, densidades e composições15,16,17 . Métodos analíticos tais como ultracentrifugação, NMR e eletroforese em gel de gradiente são usados para caracterizar partículas LDL e HDL e seus subfractions18,19. No entanto, a aplicação destes métodos é limitada a estudos que visam determinar o efeito de drogas em morfologia e montagem das partículas de lipídios de modulação. A matriz de placa com base de citômetro de fluxo é um ensaio de bioquímico funcional desenvolvido para a deteção e a visualização de soro derivado lipídico e amiloide placa partículas20. As vantagens do em vitro método descrito neste estudo de imagem possibilitam a identificação de lipídios-modulando efeitos de drogas em alterar a morfologia e distribuição das partículas de colesterol em amostras de buffer e soro.

<table><tbody><tr><td>Colesterol fluorescente TopFluor</td><td>Avanti Polar lipids</td><td></td><td>store 100 &micro; l alíquotas em -20 &deg; C</td></tr><tr><td>sinvastatina (pró-droga)</td><td>Cayman Chemicals</td><td></td><td>store 100 &micro; l alíquotas em -20 &deg; C</td></tr><tr><td>lovastatina (pró-droga)</td><td>Cayman Chemicals</td><td></td><td>store 100 &micro; l alíquotas em -20 &deg; C</td></tr><tr><td>rosuvastatina</td><td>Cayman Chemicals</td><td></td><td>store 100 &micro; l alíquotas em -20 &deg; C</td></tr><tr><td>atorvastatina</td><td>Cayman Chemicals</td><td></td><td>store 100 &micro; l alíquotas em -20 &deg; C</td></tr><tr><td>fluvastatina</td><td>Cayman Chemicals</td><td></td><td>store 100 &micro; l alíquotas em -20 &deg; C</td></tr><tr><td>ezetimiba (pró-droga)</td><td>Cayman Chemicals</td><td></td><td>store 100 &micro; l alíquotas em -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Niacina</td><td>MilliporeSigma</td><td></td><td>store 100 &micro; l alíquotas em -20 &deg; C</td></tr><tr><td>fibrato</td><td>MilliporeSigma</td><td></td><td>store 100 &micro; l alíquotas em -20 &deg; C</td></tr><tr><td>ômega-3 ácido graxo</td><td>MilliporeSigma</td><td></td><td>store 100 &micro; l alíquotas em -20 &deg; C</td></tr><tr><td>proteínas / partículas VLDL purificadas</td><td>Lee Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>proteínas / partículas LDL purificadas</td><td>Lee Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>proteínas / partículas HDL purificadas</td><td>Lee Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soro humano compatível com a idade</td><td>Dx Biosamples</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soro de aterosclerose humana</td><td>Bioserve</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soro normal humano</td><td>Stanford Pacote</td> de reagentes para medição de LDL para hemocentro <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Roche Diangostics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pacote de reagentes para medição de HDL</td><td>Roche Diangostics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medição de colesterol total</td><td>Roche Diangostics</td> Placas de microtitulação de 96 poços <td></td><td></td></tr> Medição <tr><td>de</td> triglicerídeos Roche Diangostics <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amnis Imaging Citômetro de fluxo</td><td>Amnis Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de análise de imagem IDEAS</td><td>Amnis Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemistry Analyzer-1, ChemWel 2902</td><td>Awarness Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemistry Analyzer-2, Intergra 400</td><td>Roche Diangostics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

efeitos diferenciais de drogas hipolipemiantes na modulação da morfologia das partículas de colesterol

Differential Effects of Lipid-lowering Drugs in Modulating Morphology of Cholesterol Particles

Tratamento de pacientes com dislipidemia com fármacos hipolipemiantes leva a uma redução significativa no nível de lipoproteínas de baixa densidade (LDL) e um baixo a moderado nível de aumento do colesterol da lipoproteína de alta densidade (HDL) no plasma. No entanto, um possível papel destas drogas em alterar a morfologia e distribuição das partículas de colesterol é mal compreendido. Aqui, descrevemos em vitro avaliação dos efeitos de drogas hipolipemiantes na modulação das características morfológicas das partículas de colesterol, usando o método de matriz de placa em combinação com imaging citometria de fluxo. Análises de imagem das partículas de colesterol indicaram que a lovastatina, sinvastatina, ezetimiba e atorvastatina induzem a formação de partículas em forma de vertente globulares e lineares, Considerando que a niacina, fibratos, fluvastatina e Rosuvastatina induzem o formação de apenas globular em forma de partículas. Em seguida, muito purificada lipoproteína de baixa densidade (VLDL) e partículas de LDL incubadas com estas drogas mostraram alterações na morfologia e imagem textura de colesterol subpopulações de partículas. Além disso, o rastreio de 50 amostras de soro revelou a presença de um maior nível de linear em forma de partículas de HDL colesterol em indivíduos com dislipidemia (média de 18,3%) em comparação com as amostras de idade de correspondência normal (média de 11,1%). Observou-se também variações consideráveis em efeitos de drogas hipolipemiantes na redução linear em forma de formação partículas de LDL e HDL colesterol em amostras de soro. Esses achados indicam que drogas hipolipemiantes, além de seus efeitos hipolipidémico mediada por células, diretamente podem modular a morfologia das partículas de colesterol por um mecanismo não-enzimática de ação. Os resultados destes resultados têm potencial para informar o diagnóstico de aterosclerose e prever a terapia ideal hipolipemiantes.

O objetivo deste estudo foi avaliar em vitro hipolipemiantes efeitos de drogas em modulando a morfologia das partículas de colesterol. Comparação de drogas hipolipemiantes revelou variações no seu efeito em modulando as características morfológicas das partículas de colesterol.

Efeitos diferenciais de drogas hipolipemiantes na modulação da morfologia das partículas de colesterol

Treatment of dyslipidemia patients with lipid-lowering drugs leads to a significant reduction in low-density lipoproteins (LDL) level and a low to ...

O objetivo geral deste estudo é avaliar o efeito de drogas hipolipemiantes na modulação de características morfológicas de partículas de colesterol usando um método de matriz de placas e identificar potenciais biomarcadores para o diagnóstico de aterosclerose e determinar os efeitos das drogas. O papel dos medicamentos hipolipemiantes na modulação da formação de partículas de colesterol é pouco compreendido. Aqui, demonstramos que os medicamentos hipolipemiantes desempenham um papel direto na alteração dos perfis e características morfológicas da formação de partículas de colesterol.A principal vantagem do método de imagem in vitro baseado em matriz de placas sobre outros métodos de detecção de partículas é que ele permite a visualização de partículas de colesterol para avaliar o efeito de medicamentos hipolipemiantes no soro. Jason Lundry, técnico de laboratório da Plaxgen, demonstrará como configuramos o ensaio de matriz de placas usando um analisador químico. Raymond Kong, cientista sênior da Millipore Sigma, demonstrará como fazemos o processamento de amostras usando citometria de fluxo de imagem.Finalmente, David Liu, técnico de laboratório da Plaxgen, demonstrará a análise de dados para imagens de partículas de colesterol. Use um analisador químico-1 para configurar o ensaio de matriz de placas para a formação de partículas de colesterol. Ao longo do ensaio, manter o volume final de reação em cada poço em 200 microlitros e realizar todos os ensaios em triplicata.Primeiro, carregue 194 vírgula cinco microlitros de solução salina tamponada com fosfato, ou PDS, em cada poço de uma placa de 96 poços de fundo redondo e baixa ligação a proteínas. Para cada poço, adicione dois vírgula cinco microlitros de cada solução de medicamento hipolipemiante, nenhum medicamento é adicionado às amostras de controle negativo. Em seguida, agite a placa por 30 segundos, colocando-a na placa de reação do analisador químico-1 para misturar uniformemente o medicamento em solução.Finalmente, adicione dois microlitros de solução agregada de colesterol marcada com fluorescência a cada poço. Agite a placa por 30 segundos, colocando-a na placa de reação do analisador químico-1 como antes. Em seguida, incube a placa em um agitador de laboratório por duas horas ajustadas a 37 graus Celsius e 200 rpm.Após a incubação, adquira as imagens das partículas por citometria de fluxo por imagem. Abra o modelo de aquisição de dados para carregar as configurações corretas do instrumento. Clique em Arquivo, selecione Carregar modelo e selecione o arquivo de modelo.Clique em Carregar para preparar o instrumento para o carregamento da amostra. Quando a caixa de diálogo Carregar amostra for aberta, clique em OK para carregar 50 microlitros das amostras no citômetro de fluxo de imagem. Aguarde até que as partículas possam ser vistas na área de imagem em tempo real.Quando as partículas na área de imagem estiverem em bom foco, clique em Adquirir para adquirir imagens de cada objeto simultaneamente de maneira de alto rendimento para campo escuro, campo claro, fluorescência verde e fluorescência amarela. No final da aquisição, clique no botão Retornar para retornar a amostra. Repita essas etapas para adquirir de 5.000 a 10.000 partículas de cada amostra.Analise todos os arquivos de imagem bruta usando o software de análise de imagem para determinar a intensidade de fluorescência do objeto e as variações morfológicas, conforme descrito no protocolo de texto. Prepare uma placa de 96 poços de baixa ligação a proteínas de fundo redondo carregando reagentes de maneira gradual, usando um volume de reação final de 200 microlitros por poço. Primeiro, prepare os poços de controle.Carregue 193 microlitros de PBS em cada poço. Adicione 2,5% do soro do paciente, carregando apenas uma amostra de soro por poço. Em seguida, agite a placa por 30 segundos, colocando-a na placa de reação do analisador químico.Em seguida, adicione dois microlitros de solução agregada de colesterol marcada com fluorescência em cada poço. Novamente, agite a placa por 30 segundos, colocando-a na placa de reação do analisador químico-1. Para preparar os poços com medicamentos, carregue 191 microlitros de PBS em cada poço.Em seguida, adicione 2,5% de cada soro do paciente por poço e agite a placa por 30 segundos, colocando-a em uma placa de reação do analisador químico-1. Adicione dois microlitros de solução de ezetimiba, lovastatina, sinvastatina ou niacina a todos os poços, exceto os poços de controle negativo. Adicionando apenas um medicamento por poço.Agite a placa por 30 segundos como antes. Em seguida, adicione dois microlitros de solução agregada de colesterol marcado com fluorescência em cada poço antes de agitar a placa por 30 segundos. Em seguida, incube a placa por duas horas em um agitador de laboratório, ajustado para 37 graus Celsius e 200 rpm.Após a incubação, adquira as amostras por citometria de fluxo de imagem seguindo as mesmas configurações de antes. Use o software de análise de imagem para processar em lote todos os arquivos de imagem conforme descrito no protocolo de texto. Aqui são mostrados resultados representativos que mostram a identificação de partículas de colesterol globulares e lineares em forma de fita, induzidas por estatinas, por um mecanismo não enzimático.A confirmação de duas morfologias distintas da formação de partículas de colesterol, induzidas por outras drogas hipolipemiantes, é mostrada. Incluindo ezetimiba, niacina, fibrato e ácido graxo ômega-3. Aqui são mostrados gráficos de pontos, onde o eixo X exibe um espectro de partículas de colesterol detectadas no canal de fluorescência verde.E o eixo Y exibe dispersão lateral, gating mostra regiões de lipoproteína de densidade muito baixa, lipoproteína de baixa densidade e partículas de lipoproteína de alta densidade, detectadas nos gráficos de pontos de fluorescência. Esses resultados demonstram como o efeito hipolipemiante altera os perfis de partículas purificadas de VLDL e colesterol LDL, na presença de nenhum fármaco, ezemida, lovastatina, sinvastatina e niacina. Aqui é mostrada uma tela de três amostras de soro diferentes para a identificação de um efeito diferencial de vários medicamentos hipolipemiantes, que modulam os perfis de formação de partículas de colesterol VLDL, LDL e HDL.Esses perfis indicam que também há uma variação nos níveis de resposta entre as três diferentes amostras de soro. A triagem da amostra de soro um para partículas de colesterol globulares e lineares formadas sem a droga e na presença de várias drogas hipolipemiantes, confirma duas morfologias distintas de partículas de colesterol derivadas do soro, exibindo formas de fita globular e linear. Portanto, demonstramos com sucesso uma abordagem de imagem in vitro para identificação do efeito de drogas hipolipemiantes, que modulam a relação com a formação de partículas de colesterol e seu significado clínico.Nossos resultados preliminares são promissores e estamos no processo de validar ainda mais este ensaio de matriz de placas usando amostras clínicas em larga escala. Seu painel lipídico padrão mede os níveis de colesterol LDL e HDL no soro. Nosso ensaio de matriz de placas espera melhorar a precisão do risco de aterosclerose e prevê a resposta a medicamentos hipolipemiantes usando soro.

differential-effects-lipid-lowering-drugs-modulating-morphology

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

O ensaio de colesterol é concebido para quantificar a taxa de efluxo de colesterol a partir de células cultivadas e da capacidade de plasma aceitadores para aceitar o colesterol libertado a partir de células. O ensaio consiste de marcação das células com o equilíbrio do colesterol, de colesterol entre pools intracelulares e libertação de colesterol para um aceitador extracelular.

Ensaio de efluxo do colesterol

Mais da metade das proteínas são pequenas proteínas (massa molecular &lt;200 kDa) que são um desafio tanto para elétron imagem ao microscópio e reconstruções tridimensionais. Coloração negativa otimizado é um protocolo robusto e de alto rendimento para a obtenção de alto contraste e imagens de pequenas proteínas ou complexos assimétricas em diferentes condições fisiológicas relativamente alta resolução (~ 1 nm).

Optimizado coloração negativa: um protocolo de alta capacidade para Examinando pequeno e assimétrico Estrutura de proteínas por microscopia eletrônica

Este protocolo fornece uma abordagem eficiente para medir a absorção de colesterol LDL com taxas de fluxo em tempo real usando uma célula viva, sistema em vários tipos de células de imagem. Esta técnica fornece uma plataforma para a atividade farmacológica de compostos afetando o influxo de LDL enquanto monitora para morfologia celular e citotoxicidade, portanto, potencial de tela.

Ensaio de absorção de LDL colesterol usando célula viva análise com célula de imagem monitoramento de integridade

Aqui, é apresentado um protocolo de reação em cadeia de polimerase em tempo real quantitativo para a determinação do conteúdo de microRNA nativo (absoluto/relativo) de partículas de lipoproteína. Além, um método para aumentar o nível do Micro-RNA, assim como um método para determinar a taxa de captação celular de partículas da lipoproteína, é demonstrado.

Enriquecimento de partículas de lipoproteína nativa com microRNA e subsequente determinação de seu conteúdo de microRNA absoluto/relativo e sua taxa de transferência celular

Dois métodos de enriquecimento do colesterol são apresentados: a aplicação de ciclodextrina saturada com colesterol para enriquecer tecidos e células de mamíferos, e o uso de dispersões à base de fosfolipídeos enriquecidos com colesterol (lipossos) para enriquecer os oócitos xenopus. Esses métodos são fundamentais para determinar o impacto de níveis elevados de colesterol na função molecular, celular e de órgãos.

Enriquecimento de Tecidos mamíferos e Oócitos xenopus com colesterol

Vários métodos têm sido utilizados para analisar lipoproteínas plasmáticas; no entanto, a ultracentrifugação ainda é um dos métodos mais populares e confiáveis. Aqui, descrevemos um método sobre como isolar as lipoproteínas do plasma usando ultracentrifugação de densidade sequencial e como analisar as apolipoproteínas para fins diagnósticos e de pesquisa.

Isolamento e Análise de Lipoproteínas plasmáticas por Ultracentrifugação

Aqui, descrevemos os protocolos para medir a quantidade de fosfolipídio fluorescente especificamente removido das partículas doadoras de lipídios pela lipoproteína de alta densidade (HDL) presente no plasma ou soro humano total. Mostramos que essa métrica de funcionalidade HDL prevê doenças cardiovasculares incidentes.

Ensaio de efluxo de fosfolipídios específico para lipoproteína de alta densidade

Os modelos atuais ex vivo de glioblastoma (GBM) não são otimizados para o estudo fisiologicamente relevante da invasão de tumores humanos. Aqui, apresentamos um protocolo para geração e manutenção de culturas de fatia organotípicas a partir de tecido GBM humano fresco. É fornecida uma descrição da microscopia por lapso de tempo e técnicas quantitativas de análise de migração celular.

Um modelo de cultura de fatia organotipica de glioblastoma humano para estudo de migração de células tumorais e efeitos específicos de pacientes de drogas anti-invasivas

O objetivo deste protocolo é o de avaliar a especificidade de drogas anticâncer in vitro utilizando culturas mistas que contêm células tumorais tanto e não-tumorais.

Avaliando Especificidade de Anticancer Drugs<em&gt; In Vitro</em

Os coelhos são amplamente utilizados para estudar a farmacocinética de drogas intraoculares. Descrevemos um método para a realização de estudos farmacocinéticos de drogas intraoculares usando olhos de coelho.

Uso de olhos de coelhos em farmacocinéticas Estudos de intraoculares Drogas

Descubra como drogas hipolipemiantes alteram a morfologia das partículas de colesterol usando o método de plaque array. Esta abordagem de imagem in vitro permite visualizar perfis de VLDL e LDL para identificar biomarcadores de aterosclerose.

Efeitos diferenciais de drogas hipolipemiantes na modulação da morfologia das partículas de colesterol

Explorar mais vídeos