Name: Aderência de bactérias para plantar superfícies medidas em laboratório (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Aprenda a medir a adesão bacteriana em superfícies de plantas usando plântulas e microscopia. Este método rápido e econômico auxilia pesquisadores em patologia vegetal e segurança alimentar.

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O autor agradece a Susan Whitfield para preparação da Hillary Samagaio e Camille Martin e figuras para assistência com alguns dos experimentos.

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<li>Matthysse, A. G., McMahan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root+colonization+by+Agrobacterium+tumefaciens+is+reduced+in+cel%2C+attB%2C+attD%2C+and+attR+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Root colonization by Agrobacterium tumefaciens is reduced in cel, attB, attD, and attR mutants.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64, 2341-2345 (1998).</li>
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</ol>

O autor declara que ela tem sem interesses financeiros concorrentes.

É importante estar ciente de todas as superfícies, para o qual as bactérias podem aderir durante o experimento. Assim, as bactérias que são capazes de se ligar ao vidro podem ser subestimadas se a contagem de células viáveis é feitas usando pipetas e tubos de vidro. Se as plantas são cultivadas em ágar ou solo e alguns do ágar ou solo permanece nas plantas, em seguida, as bactérias podem se ligar ao material aderente ao invés de plantas. Por outro lado, lavar a superfície da planta, particularmente no caso de raízes, pode remover revestimentos superficiais naturais tais como mucosa e, assim, alterar os resultados dos testes de aderência.
É importante ter certeza de que a bactéria adicionada à mistura de incubação permanecem viva durante o experimento. Assim, contagem de células viáveis de bactérias gratuito, bem como anexadas deve ser feitas rotineiramente. Alguns tratamentos ou mutações bacterianas podem reduzir a taxa de crescimento bacteriano ou mesmo causar a morte de uma fração da população bacteriana. Bactérias vivas e mortas não podem ser distinguíveis no microscópio, a menos que as manchas especiais são usadas. Há um kit de mancha útil para viver/mortos bactérias que depende a exclusão dos corantes de bactérias vivas. No entanto, se uma população mista de espécies bacterianas está presente então, contagem de células viáveis da espécie de interesse é provável que seja o método mais fácil para determinar se a incubação resultou em morte bacteriana.
Composição média irá influenciar o crescimento e sobrevivência bacteriana. Exsudado de raiz e materiais libertado da ferida e cortar sites irão fornecer substrato para apoiar o modesto crescimento bacteriano. Fosfato, nitrogênio e ferro tendem a ser um fator limitante nessas condições. Cátions divalentes, tais como cálcio e magnésio podem influenciar a adesão. Em alguns casos a fonte de carbono pode influenciar a adesão. pH também é importante. Em geral, o pH da rizosfera é entre 5,5 e 6,5.
É preciso ter cuidado na utilização de bactérias marcadas com resistência aos antibióticos. Os antibióticos mais frequentemente utilizados são a rifampicina e ácido nalidíxico. Resistência a estes antibióticos geralmente é devido a mutações nos genes cromossômicos (RNA polimerase e girase, respectivamente) e, portanto, não podem facilmente ser transferidas para outra estirpe durante a incubação. Este tipo de resistência também não resulta na degradação ou modificação do antibiótico. Marcação de bactérias com um plasmídeo-carregadas gene marcador não é recomendado a menos que o plasmídeo não pode ser transferido para qualquer outras bactérias. A resistência aos antibióticos não deve ser devido à degradação ou químicos, modificação do antibiótico como bactérias sensíveis aos antibióticos, então será capazes de crescer em placas de antibióticas, se eles estão localizados perto de bactérias resistentes.
Os métodos descritos neste artigo são úteis para amostras pequenas e/ou experimentos onde as amostras precisam ser contidos (por exemplo, experimentos envolvendo agentes patogénicos humanos). Para tamanhos de amostra grande (acima de 100 g de material ou de mais de 50 plantas) outros métodos ou drástica modificação desses métodos seria necessário10,19,32,19,33, 34 , 35 , 36. a presença de um grande número de microorganismos que não a espécie a ser estudada também pode representar problemas significativos. Possíveis soluções incluem o uso de bactérias marcadas com uma proteína fluorescente ou resistência aos antibióticos, como descrito nos passos 6.1.2 e 7.3. No entanto, quando as bactérias de interesse são raros indivíduos em uma população grande de outros microorganismos estes marcadores podem não ser adequados para permitir uma avaliação objetiva dos números da bactéria em estudo.
Todos os métodos descritos aqui são métodos laboratoriais com base. Pequenas modificações seriam necessários estudos com efeito de estufa. Mais grandes modificações são susceptíveis de ser necessária para estudos de campo onde, protozoários, insetos e outra animal variação de predação e clima complicam a provisão de condições definidas para os experimentos. No futuro esses métodos podem ser ampliados para incluir as interações de dois ou mais microorganismos na superfície da planta.

A medição de vinculação bacteriana para plantar superfícies tornou-se importante em três situações diferentes. A primeira situação é o exame da transmissão de agentes patogénicos humanos na planta superfícies1,2,3. O objetivo aqui é para impedir a ligação de bactérias ou para remover ou matar as bactérias vinculadas e, portanto, para reduzir a transmissão da doença pelo material de planta. A segunda situação é o exame da ligação de patógenos vegetais para plantar superfícies4. Mais uma vez, o objetivo aqui é para impedir a ligação ou para remover ou matar as bactérias vinculadas e, portanto, para reduzir a doença. A terceira situação é o exame da ligação de bactérias simbióticas ou planta-growth-promoting5,6. O objetivo aqui é promover bacteriano vinculativo e, assim, para aumento de fitossanidade e cultura produz.
As técnicas para medir a ligação bacteriana para plantar superfícies descritas neste artigo são baratos e relativamente fáceis de realizar. Os únicos requisitos são um microscópio e materiais encontrados geralmente em um laboratório de bacteriologia. Para algumas técnicas um sonicador de banho é útil. As técnicas descritas são projetadas para experiências realizadas usando tamanhos de amostra relativamente pequeno de vinculação. Medições de vinculação são feitas em laboratório, embora seja possível modificar algumas dessas técnicas para o uso na estufa ou no campo.
Estas técnicas têm sido utilizadas para medir a ligação bacteriana de raízes, brotos, folhas cortadas, frutas cortadas e tomatinhos intactos na laboratório7,8,9,10,11, 12,13,14,15. Tem também sido costumavam medir a colonização de raiz de plantas que crescem no solo ou areia no laboratório16. As técnicas têm sido utilizadas com muitas espécies bacterianas, incluindo Agrobacterium tumefaciens, tem Sinorhizobium, Escherichia coli, Salmonella typhi e Pseudomonas fluorescens. Uma descrição útil de métodos para avaliar a interação da . tumefaciens com superfícies pode ser encontrada em Morton e Fuqua (2012)17. Em todos os casos as dimensões das amostras envolvidas eram pequenas, geralmente menos do que 25-50 plantas. As técnicas descritas são adequadas para uso com agentes patogénicos humanos que precisam ser mantidos contido durante os experimentos.

<table><tbody><tr><td>microscópio de luz</td><td>qualquer</td> contraste <td>de fase N/A</td><td>ou óptica Nomarski são úteis, para estudos usando marcadores fluorescentes, é necessário um microscópio de fluorescência.</td></tr><tr><td>sementes</td><td>qualquer&nbsp;</td><td>N/A</td><td>anote o número do lote da semente e o alvejante da cultivar</td></tr>, qualquer <tr><td>sonicador de banho</td> N/A<td></td><td></td>, qualquer empresa de suprimentos científicos, N/A <td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> ágar nutriente&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td>Difco&nbsp;</td><td>001-01-8</td><td></td></tr><tr><td>soytone</td><td>Difco&nbsp;</td><td>24360</td><td></td></tr><tr><td>Areia</td><td>areia do mar Fisher Scientific</td><td>S25</td><td></td></tr><tr><td>areia</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>S9887</td><td></td></tr><tr><td>conetainers</td><td>Stuewe & Filhos, Inc.</td><td>Os cone-tainers Ray-Leach</td><td>de muitos tamanhos diferentes estão disponíveis para se adequar ao tipo de planta que você deseja cultivar,</td></tr><tr><td>parafilmar</td>, <td>qualquer empresa de suprimentos científicos</td><td>, N/A</td><td></td></tr><tr><td>, MS sais</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td></td></tr>, <tr><td>pararafin</td><td>, qualquer</td> centrífuga <td>N/A</td><td></td></tr>, <tr><td></td><td>qualquer empresa científica, N</td><td>/A</td><td>para pellet, a maioria das bactérias, apenas uma pequena centrífuga com uma força máxima de 10.000 XG é necessário</td></tr><tr><td>misturador de vórtice</td><td>qualquer empresa</td><td></td><td></td>científica</tr><tr><td>micrômetro</td><td>ACCU-SCOPE Acessórios</td><td>A3145</td><td></td></tr><tr><td>Célula de contagem de vigas Sedgwick</td> Câmara de incubatina de pressão de pressão <td>Hauser Scientific</td><td>HS3800</td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359483</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rifampicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>ácido naladixic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>n8878</td><td></td></tr><tr><td>Mancha viva/morta</td><td>em Bioprobes moleculares</td><td>L7007</td><td></td> de Vitrogen</tr></tbody></table>

aderência de bactérias para plantar superfícies medidas em laboratório

Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory

Este manuscrito descreve um método para medir a ligação bacteriana às superfícies da planta axénica no microscópio de luz e através do uso de contagem de células viáveis. Materiais vegetais usados incluem raízes, brotos, folhas e cortar frutas. Os métodos descritos são de baixo custo, fácil e adequado para amostras pequenas. Vinculação é medida em laboratório e uma variedade de condições e meios de incubação pode ser usada. O efeito de inibidores pode ser determinado. Situações que promovem e inibem a ligação também podem ser avaliadas. Em alguns casos é possível distinguir-se várias condições alteram ligação principalmente devido aos seus efeitos na planta ou sobre as bactérias.

A. tumefaciens coloniza as superfícies da raiz. A fim de determinar se a produção bacteriana da celulose desempenha um papel na colonização de raiz, os efeitos de mutações de bactérias que impedem a síntese de celulose foram examinadas16. Foram utilizadas as técnicas descritas em etapas 1.3 e 7.1. Sementes de tomate foram superfície esterilizada e germinadas em água estéril. Quando as raízes estavam cerca de 2 cm de comprimento foram mergulhadas em uma suspensão de 105 bactérias / mL e plantadas em solo pasteurizado em recipientes. As plantas foram cultivadas por 14 dias a 25 ° C num ciclo escuro h luz/12 de 12 h. Depois que as vezes as plantas indicadas foram removidas dos recipientes. As raízes foram lavadas e lisadas em um sonicador de banho para remover as bactérias acopladas. Bacterianos números foram determinados usando a contagem de células viáveis. A Figura 2 mostra o efeito das mutações de celulose-menos dois diferentes sobre a capacidade das bactérias para colonizar raízes de tomate. Embora os desvios-padrão de algumas medidas foram tão alto quanto 0.9 log10 (um problema comum com este tipo de medida) a redução na ligação da celulose-menos mutantes é claramente evidente e podemos concluir que a produção bacteriana de celulose auxilia as bactérias na colonização de raízes de tomate.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig2.jpg"> Figura 2 : Raiz de colonização por tipo selvagem e mutantes de celulose-menos da . tumefaciens. Log10 número total de bactérias por cm de comprimento de raiz recuperado de raízes de tomate inoculadas com estirpe de tipo selvagem a. tumefaciens C58 e celulose-menos mutantes, C58:1 e C58:A60. Os números mostrados são os meios de um mínimo de quatro experimentos separados. As barras indicam desvios-padrão dos meios. As raízes foram inoculadas mergulhando-os em uma suspensão de 105 bactérias / mL para um minuto. As plantas foram cultivadas em recipientes e as bactérias frouxamente aderentes foram removidas lavando as raízes no buffer em um frasco de vidro de lavagem. Firmemente aderentes bactérias foram removidas usando um sonicador de banho e a suspensão resultante chapeado para determinar a célula viável conta16. Esta figura foi modificada de Matthysse e McMahan. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Analisou-se o papel de exopolissacarídeo na ligação de e. coli e outras bactérias de brotos de alfafa. Alguns surtos de doenças diarreicas devido a e. coli O157: H7 têm sido rastreados para brotos de alfafa contaminada. Ligação das bactérias do tipo selvagem e mutantes incapazes de fazer vários exopolissacarídeo foi medida usando os métodos descritos nas etapas 1.1, 5.1 e 7.2. Rebentos de alfafa foram superfície esterilizada e germinadas por um dia em água estéril a 25 ° C, no escuro. Quatro brotos com os revestimentos de semente anexados foram colocados em pratos de plástico estéril contendo 5 mL de água. Bactérias cultivadas em caldo Luria foram adicionadas a uma concentração final de aproximadamente 5 x 103 / mL. Os brotos inoculados foram incubados a 25 ° C, no escuro por 3 dias. Os brotos foram lavados duas vezes em 5 mL de água estéril em um frasco por inversão vigorosa e homogeneizados no buffer usando um homogeneizador de vidro do Teflon motorizado de lavagem. Experiências anteriores usando bactérias marcado com um plasmídeo que carreg o gene GFP não mostrou nenhuma bactéria interiorizada embora superfície bactérias observaram-se facilmente. Os resultados são mostrados na tabela 1. Foram examinadas duas estirpes de Escherichia coli O157: H7. Em ambas as cepas a produção de acid(PGA) poli-β-1,6-glucurônico apareceu para fazer a maior contribuição para a ligação de patogênicas Escherichia coli para plantar superfícies. Ácido do cólon também desempenhou um papel significativo na ligação. Enquanto a redução da ligação em celulose-menos mutantes foi significativa não era tão grande como para os outros dois polissacarídeos.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Efeitos das mutações nos Genes de produção de exopolissacarídeo na vinculação de E. coli O157: H7 de brotos e revestimentos de semente abertos</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Estirpe bacteriana</td>
			<td rowspan="2">Mutação ou genótipo (fenótipo relevante)</td>
			<td colspan="2">10 número de bactérias vinculado por broto ou semente casaco de log</td>
		</tr>
<tr>
<td>B de brotos de alfafa
</td>
			<td>Revestimentos de semente abertos</td>
		</tr>
<tr>
<td>86-24</td>
			<td>Nenhum (tipo selvagem)</td>
			<td>4,7 ± 0,6</td>
			<td>5,6 ± 0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>8624N</td>
			<td>
yhjN (celulose-subtração)</td>
			<td>2,9 ± 0,7c
</td>
			<td>3,5 ± 0,6c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>8624C</td>
			<td>
wcaD (menos ácido do cólon)</td>
			<td>1,8 ± 0,7c
</td>
			<td>2.4 ± 0.5c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>8624P</td>
			<td>
pgaC (PGA-subtração)</td>
			<td>&lt; 1,0c
</td>
			<td>1,0 ± 1.0c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4A</td>
			<td>Nenhum (tipo selvagem)</td>
			<td>5,6 ± 0.2</td>
			<td>6.1 ± 0,3</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AN</td>
			<td>
yhjN (celulose-subtração)</td>
			<td>de 4,8 ± 0,8d
</td>
			<td>4.1 ± 0,8d
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AC</td>
			<td>
wcaD (menos ácido do cólon)</td>
			<td>3,9 ± 0.5c
</td>
			<td>de 4,8 ± 0,8d
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AP</td>
			<td>
pgaC (PGA-subtração)</td>
			<td>&lt; 1,0c
</td>
			<td>1.2 ± 0,7c
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">média ± desvio padrão de um mínimo de três medições do número de bactérias (log10) vinculado depois de 3 dias.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">b brotos foram lavados antes da medição.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">c significativamente diferente do tipo selvagem: P &lt; 0,01.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">d significativamente diferente do tipo selvagem: P &lt; 0,05.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Esta tabela foi modificada de Matthysse, Deora, Mishra e Torres10.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: efeitos das mutações nos genes de produção de exopolissacarídeo na ligação de Escherichia coli O157: H7 de brotos. A fim de determinar o papel de vários exopolissacarídeo e lipopolissacarídeo na ligação de patogenicidade estirpes de Escherichia coli O157: H7 de brotos de alfafa, a vinculação de um conjunto de mutantes para os brotos e revestimentos de semente abertos foi examinado usando os métodos descrito na etapa 6. Os resultados mostraram que poli-ß-1, 6 -N-acetil-D-glucosamina (PGA) parece ser essencial para a ligação com as couves e esse ácido tanto celulose e colanic são necessários para ligação máxima de Escherichia coli O157. Esta tabela foi modificada de Matthysse, Deora, Mishra e Torres10.
A fim de determinar se a produção de PGA é suficiente para causar ligação bacteriana plantar superfícies, um plasmídeo (pMM11) carregando o operon clonado codificação os genes necessários para PGA produção foi introduzida em duas bactérias diferentes que não Normalmente, seria capaz de ligar a tomate raízes10. A. tumefaciens A1045 é um mutante da estirpe selvagem tipo C58 que não efectuar cíclico-1,2-β-glucan e também falha ao ligar para plantar superfícies29. Sinorhizobium tem 1021 que forma nódulos na alfafa falha ao ligar para não-leguminosas incluindo tomate12. As técnicas descritas em etapas 1.1, 5.1, 7.1 e 6.3 foram usadas para determinar se a capacidade de fazer PGA geralmente maior vinculação bacteriana às superfícies de raiz. Sementes de tomate foram superfície esterilizada e germinadas em água estéril. As raízes foram cortadas em segmentos de 1 cm de comprimento e colocadas em água estéril e as bactérias foram vacinadas. Como estas duas espécies de bactérias crescem em ritmos diferentes, vinculação foi medida em momentos diferentes para permitir quantidades aproximadamente iguais de crescimento bacteriano. A presença de pMM11 o plasmídeo causada semelhante aumento significativo no número de bactérias limite de ambas as espécies (tabela 2)10. Um aumento significativo na ligação também foi visto no microscópio de luz, mas a ligação era muito diferente para as duas espécies (Figura 3). A. tumefaciens A1045 associadas como bactérias individuais para a superfície da raiz. S. tem ligado em grandes aglomerados em que somente algumas das bactérias eram conectadas diretamente à raiz, e a maioria das bactérias foram anexada a outras bactérias. Este exemplo mostra que simplesmente analisar os números de bactérias vinculados sem incluir observações microscópicas pode dar uma ideia errada dos resultados de um experimento. Embora ambos os métodos (contagem de células viáveis e observações microscópicas) mostram que pMM11 aumentou bacteriana ligação às raízes de tomate, o tipo de ligação causada pela produção de PGA foi diferente para as duas espécies bacterianas10.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">O efeito da pMM11 plasmídeo sobre a ligação de bactérias às raízes de tomate</td>
		</tr>
<tr>
<td>Estirpe bacteriana</td>
			<td>Plasmídeo</td>
			<td>Limite de número de bactérias por mm de comprimento de raiz</td>
		</tr>
<tr>
<td>A. tumefaciens A1045um
</td>
			<td>nenhum</td>
			<td>0,25 x 103 ± 0,25 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pBBR1mcs (vector)</td>
			<td>0,25 x 103 ± 0,25 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pMM11 (síntese de PGA)</td>
			<td>10 x 103 ± 0,25 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td>S. tem 1021b
</td>
			<td>nenhum</td>
			<td>Não detectado</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pBBR1mcs (vector)</td>
			<td>Não detectado</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pMM11 (síntese de PGA)</td>
			<td>50 x 103 ± 5 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">uma associação bacteriana foi medida após 2 horas</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">b ligação bacteriana foi medida após 18 horas</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Esta tabela foi modificada de Matthysse, Deora, Mishra e Torres10.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: O efeito de um plasmídeo carregando os genes para a síntese de PGA na ligação de A. tumefaciens A1045 e S. tem 1021 para segmentos de raiz de tomate. A fim de examinar a capacidade de poli-ß-1, 6 -N-acetil-D-glucosamina (PGA) para promover a ligação de bactérias para plantar raízes, o efeito de um plasmídeo confere a capacidade de fazer PGA (pMM11) na ligação de duas cepas de bactérias associadas a planta para raízes de tomate foi examinado. Nem cepa de bactérias mostrou significativa ligação às raízes de tomate na ausência do plasmídeo ou na presença do plasmídeo sem os genes que codificam a síntese de PGA (pBBR1mcs). A adição do plasmídeo com genes de síntese PGA aumentou a vinculação por ambos os tipos de bactérias. Porque a. tumefaciens cresce mais rápido do que o S. tem ligação foi medida após 2 h de incubação para a. tumefaciens e após 18 h para S. tem. As técnicas utilizadas são as descritas na etapa 7. Esta tabela foi modificada de Matthysse, Deora, Mishra e Torres10.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig3.jpg"> Figura 3 : O efeito da pMM11 plasmídeo carregando os genes de biossíntese de PGA na ligação da . tumefaciens A1045 e S. tem 1021 para cabelos de raiz tomate. Ligação para cabelos de raiz de tomate da) a. tumefaciens A1045, B) pMM11 a. tumefaciens A1045, C) tem S. 1021 e D) tem S. 1021 pMM11. Embora o aumento da vinculação das duas espécies bacterianas é mais ou menos semelhante os detalhes da ligação como visto no microscópio luz são completamente diferentes. As técnicas utilizadas são as descritas na etapa 6. Esta figura foi modificada de Matthysse, Deora, Mishra e Torres10. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Às vezes é possível usar a ligação de superfícies não-biológicos para auxiliar na distinção entre a contribuição das bactérias e da planta em uma interação específica. O polysaccharide(UPP) unipolar da . tumefaciens tem demonstrado ser capaz de mediar bacteriana vinculação a uma variedade de ambas as superfícies biológicos e não biológicos30. Cálcio, observou-se inibir a ligação da a. tumefaciens plantar superfícies mediadas por UPP28. A fim de determinar se a inibição por íons de cálcio da vinculação bacteriana para plantar superfícies é devido a um efeito sobre as bactérias ou sobre a superfície da planta, analisou-se a vinculação das bactérias de fios de nylon. As técnicas se descreve no passo 8.2 foram usados. Sementes de tomate foram superfície esterilizada e germinadas em água conforme descrito na etapa 1. As bactérias foram cultivadas em meio mínimo com sacarose e adicionadas a raízes de tomate ou fios de nylon em uma concentração final de aproximadamente 105/mL, conforme descrito na etapa 5.1. O efeito da adição de CaCl2 sobre vinculação bacteriana a raízes de tomate e fios de nylon foi examinado no microscópio. A Figura 4 mostra uma semelhante inibição da ligação de cálcio usando qualquer superfície sugerindo que o efeito do cálcio é principalmente sobre as bactérias10.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig4.jpg"> Figura 4 : O efeito do cálcio na ligação da . tumefaciens para cabelos de raiz de tomate e fios de nylon. A. tumefaciens foi incubada com raízes de tomate (A e B) ou fios de nylon (C e D) por 24 h em um 01:10 diluição dos sais de MS e um 01:20 diluição do meio mínimo AB, 0,4% de sacarose (A e C) ou em um 01:10 diluição dos sais de MS e 01:20 diluição do meio mínimo AB , 0,4% de sacarose que contém 60 mM CaCl2 (B e D)31. O adicionado CaCl2 inibiu bacteriana vinculação a raízes e fios de nylon, sugerindo que a inibição foi principalmente devido a um efeito sobre as bactérias, e não sobre a superfície da planta. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Um método fácil para medir e caracterizar adesão bacteriana em plantas, principalmente raízes e brotos, é descrito neste artigo.

Aderência de bactérias para plantar superfícies medidas em laboratório

This manuscript describes a method to measure bacterial binding to axenic plant surfaces in the light microscope and through the use of viable cell ...

O objetivo geral deste procedimento é observar e medir a ligação de bactérias às superfícies das plantas. Este método pode responder a questões importantes tanto na patologia das plantas quanto na segurança alimentar. Em particular, pode responder a perguntas sobre como as bactérias se ligam às superfícies das plantas e como elas podem ser removidas.A principal vantagem dessa técnica é que ela é fácil, rápida e barata. Para preparar mudas cultivadas em água, coloque um pequeno número de sementes em um copo de vidro de 30, 50, 100 ou 150 mililitros. Aqui são usadas sementes de tomate.Cubra as sementes com 80% de etanol e agite brevemente. Em seguida, deixe as sementes de molho por um minuto. Despeje o etanol e mergulhe as sementes em uma solução de 50% de alvejante comercial e 0,1% de Triton X-100 e água da torneira.Deixe as sementes de molho por 20 minutos ou mais se as sementes forem grandes, como sementes de feijão. Despeje a mistura de água sanitária e lave as sementes três vezes com água estéril, deixando as sementes de molho na água por um minuto para cada lavagem. Despeje as sementes e uma pequena quantidade de água em uma placa de Petri estéril e incube as sementes no escuro até que as mudas atinjam o tamanho desejado, entre um centímetro e 10 centímetros.Para preparar sementes ou mudas cultivadas em areia, após esterilizar as sementes e os materiais de plantio, inocular as sementes ou mudas com bactérias de acordo com o protocolo de texto. Usando uma haste de vidro estéril, faça um buraco raso na areia profundo o suficiente para colocar a semente abaixo da superfície. Coloque a semente no buraco e cubra-a com uma fina camada de areia.Em seguida, use filme de vedação para selar a parte superior do recipiente para evitar a perda de água e a entrada de micróbios adicionais. Cultive as plantas no laboratório sob uma luz ou na estufa a uma temperatura e duração do dia adequadas para a espécie e variedade de planta. Plante as mudas na areia.Use uma haste de vidro estéril para fazer um furo. Em seguida, com uma agulha de crochê de aço inoxidável estéril, guie a raiz cuidadosamente no orifício e use areia para preencher as laterais do orifício. Depois de incubar as plantas com bactérias de acordo com o protocolo de texto, prepare uma amostra para microscopia colocando-a em uma gota de água ou meio de incubação em uma lâmina de microscópio e observe-a diretamente.Se não houver bactérias livres visíveis, pode ter havido morte bacteriana ou ligação bacteriana ao recipiente em que a incubação foi realizada. Lave a amostra em água ou meio de incubação, colocando-a em um frasco com líquido e invertendo suavemente o frasco. Em seguida, coloque a amostra na lâmina do microscópio em líquido fresco para observação.Para montar a amostra, use uma lamínula comum. Se a amostra for espessa e formar uma protuberância, adicione o líquido e a amostra no poço de uma prensa, aplique a lamínula que tenha um anel de borracha ou plástico ao redor da borda. Coloque a corrediça em cima e pressione suavemente para selar a lamínula na corrediça.Inverter a lâmina para examinar a amostra. Como alternativa, use uma lâmina de contagem de algas e uma lamínula de maneira semelhante e visualize com uma ampliação não superior a 20 vezes. Para determinar o número de bactérias viáveis encontradas nas plantas cultivadas na areia, comece removendo o material de vedação da parte superior e inferior do recipiente.Coloque o recipiente sobre um pedaço de papel estéril e bata suavemente o recipiente contra a superfície para soltar a areia antes de levantar suavemente a areia com a planta do recipiente. Quando o cilindro de areia e a planta estiverem livres no papel, divida a areia ao meio para revelar a raiz da planta. Se desejar, colete amostras da areia perto da borda do recipiente, bem como perto da raiz.Isso pode ser útil para determinar a disseminação, o acúmulo e o crescimento de bactérias. Pegue a raiz e remova a areia e as bactérias que estão frouxamente aderidas, mergulhando a raiz em um volume medido de água ou tampão e agitando suavemente. Determinar a contagem de células viáveis da bactéria na suspensão resultante, colocando-a em meio adequado, como o ágar lúria.Isso representa o número de bactérias vagamente associadas à raiz. Finalmente, remova as bactérias fortemente ligadas por sonicação e determine seus números. Este gráfico mostra o efeito de duas mutações diferentes de celulose menos na capacidade da bactéria de colonizar raízes de tomate.Embora os desvios padrão de algumas medições tenham chegado a 0,9 log base de 10, a redução na ligação da celulose menos mutantes é claramente evidente. Neste experimento, foi medida a ligação a brotos de alfafa do tipo selvagem E.Coli 0157:H7 em mutantes incapazes de produzir vários exopolissacarídeos. Em ambas as cepas, a produção de ácido poli-beta um seis glucurônico, ou PGA, pareceu dar a maior contribuição para a ligação de E.coli patogênica às superfícies das plantas.O ácido colânico também desempenhou um papel significativo na ligação. Aqui, duas cepas de bactérias que são incapazes de se ligar às superfícies das plantas foram projetadas para produzir PGA para determinar se é suficiente para causar a ligação bacteriana às raízes do tomate. No caso de A.tumefaciens A1045, o PGA fez com que a bactéria se ligasse individualmente à superfície da raiz.Por outro lado, S. meliloti se ligou em grandes aglomerados, nos quais apenas algumas das bactérias estavam diretamente ligadas à raiz, e a maioria das bactérias estava ligada a outras bactérias. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em menos de uma hora para configuração inicial, mais tempo de incubação e entre 10 minutos e uma hora de tempo de pontuação, dependendo da amostra. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que as bactérias podem aderir a quase qualquer superfície.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como observar a ligação de bactérias às superfícies das plantas. Determine onde na planta as bactérias se ligam e determine o número de bactérias ligadas. Não se esqueça de que, se você realizar esses procedimentos com patógenos humanos, o procedimento pode ser extremamente perigoso e precauções como trabalhar com capuz de contenção e usar luvas devem sempre ser tomadas.

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