Aderência de bactérias para plantar superfícies medidas em laboratório

O objetivo geral deste procedimento é observar e medir a ligação de bactérias às superfícies das plantas. Este método pode responder a questões importantes tanto na patologia das plantas quanto na segurança alimentar. Em particular, pode responder a perguntas sobre como as bactérias se ligam às superfícies das plantas e como elas podem ser removidas.

A principal vantagem dessa técnica é que ela é fácil, rápida e barata. Para preparar mudas cultivadas em água, coloque um pequeno número de sementes em um copo de vidro de 30, 50, 100 ou 150 mililitros. Aqui são usadas sementes de tomate.

Cubra as sementes com 80% de etanol e agite brevemente. Em seguida, deixe as sementes de molho por um minuto. Despeje o etanol e mergulhe as sementes em uma solução de 50% de alvejante comercial e 0,1% de Triton X-100 e água da torneira.

Deixe as sementes de molho por 20 minutos ou mais se as sementes forem grandes, como sementes de feijão. Despeje a mistura de água sanitária e lave as sementes três vezes com água estéril, deixando as sementes de molho na água por um minuto para cada lavagem. Despeje as sementes e uma pequena quantidade de água em uma placa de Petri estéril e incube as sementes no escuro até que as mudas atinjam o tamanho desejado, entre um centímetro e 10 centímetros.

Para preparar sementes ou mudas cultivadas em areia, após esterilizar as sementes e os materiais de plantio, inocular as sementes ou mudas com bactérias de acordo com o protocolo de texto. Usando uma haste de vidro estéril, faça um buraco raso na areia profundo o suficiente para colocar a semente abaixo da superfície. Coloque a semente no buraco e cubra-a com uma fina camada de areia.

Em seguida, use filme de vedação para selar a parte superior do recipiente para evitar a perda de água e a entrada de micróbios adicionais. Cultive as plantas no laboratório sob uma luz ou na estufa a uma temperatura e duração do dia adequadas para a espécie e variedade de planta. Plante as mudas na areia.

Use uma haste de vidro estéril para fazer um furo. Em seguida, com uma agulha de crochê de aço inoxidável estéril, guie a raiz cuidadosamente no orifício e use areia para preencher as laterais do orifício. Depois de incubar as plantas com bactérias de acordo com o protocolo de texto, prepare uma amostra para microscopia colocando-a em uma gota de água ou meio de incubação em uma lâmina de microscópio e observe-a diretamente.

Se não houver bactérias livres visíveis, pode ter havido morte bacteriana ou ligação bacteriana ao recipiente em que a incubação foi realizada. Lave a amostra em água ou meio de incubação, colocando-a em um frasco com líquido e invertendo suavemente o frasco. Em seguida, coloque a amostra na lâmina do microscópio em líquido fresco para observação.

Para montar a amostra, use uma lamínula comum. Se a amostra for espessa e formar uma protuberância, adicione o líquido e a amostra no poço de uma prensa, aplique a lamínula que tenha um anel de borracha ou plástico ao redor da borda. Coloque a corrediça em cima e pressione suavemente para selar a lamínula na corrediça.

Inverter a lâmina para examinar a amostra. Como alternativa, use uma lâmina de contagem de algas e uma lamínula de maneira semelhante e visualize com uma ampliação não superior a 20 vezes. Para determinar o número de bactérias viáveis encontradas nas plantas cultivadas na areia, comece removendo o material de vedação da parte superior e inferior do recipiente.

Coloque o recipiente sobre um pedaço de papel estéril e bata suavemente o recipiente contra a superfície para soltar a areia antes de levantar suavemente a areia com a planta do recipiente. Quando o cilindro de areia e a planta estiverem livres no papel, divida a areia ao meio para revelar a raiz da planta. Se desejar, colete amostras da areia perto da borda do recipiente, bem como perto da raiz.

Isso pode ser útil para determinar a disseminação, o acúmulo e o crescimento de bactérias. Pegue a raiz e remova a areia e as bactérias que estão frouxamente aderidas, mergulhando a raiz em um volume medido de água ou tampão e agitando suavemente. Determinar a contagem de células viáveis da bactéria na suspensão resultante, colocando-a em meio adequado, como o ágar lúria.

Isso representa o número de bactérias vagamente associadas à raiz. Finalmente, remova as bactérias fortemente ligadas por sonicação e determine seus números. Este gráfico mostra o efeito de duas mutações diferentes de celulose menos na capacidade da bactéria de colonizar raízes de tomate.

Embora os desvios padrão de algumas medições tenham chegado a 0,9 log base de 10, a redução na ligação da celulose menos mutantes é claramente evidente. Neste experimento, foi medida a ligação a brotos de alfafa do tipo selvagem E.Coli 0157:H7 em mutantes incapazes de produzir vários exopolissacarídeos. Em ambas as cepas, a produção de ácido poli-beta um seis glucurônico, ou PGA, pareceu dar a maior contribuição para a ligação de E.coli patogênica às superfícies das plantas.

O ácido colânico também desempenhou um papel significativo na ligação. Aqui, duas cepas de bactérias que são incapazes de se ligar às superfícies das plantas foram projetadas para produzir PGA para determinar se é suficiente para causar a ligação bacteriana às raízes do tomate. No caso de A.tumefaciens A1045, o PGA fez com que a bactéria se ligasse individualmente à superfície da raiz.

Por outro lado, S. meliloti se ligou em grandes aglomerados, nos quais apenas algumas das bactérias estavam diretamente ligadas à raiz, e a maioria das bactérias estava ligada a outras bactérias. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em menos de uma hora para configuração inicial, mais tempo de incubação e entre 10 minutos e uma hora de tempo de pontuação, dependendo da amostra. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que as bactérias podem aderir a quase qualquer superfície.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como observar a ligação de bactérias às superfícies das plantas. Determine onde na planta as bactérias se ligam e determine o número de bactérias ligadas. Não se esqueça de que, se você realizar esses procedimentos com patógenos humanos, o procedimento pode ser extremamente perigoso e precauções como trabalhar com capuz de contenção e usar luvas devem sempre ser tomadas.