Método para a rotulagem transcritos em células individuais Escherichia coli para único-molécula fluorescência In Situ as experiências de hibridação
21 de dezembro de 2017
Este manuscrito descreve um método para a rotulagem individual RNA mensageiro (mRNA) transcrições com fluorescente-etiquetadas sondas de DNA, para uso em único-molécula fluorescência em situ (smFISH) as experiências de hibridação em e. coli. smFISH é um método de visualização que permite a deteção simultânea, localização e quantificação de simples moléculas de mRNA em células individuais fixas.
O objetivo geral deste protocolo é rotular transcritos individuais em E.Coli para sondas de DNA marcadas com fluorescência para visualização em experimentos FiSH de molécula única. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia de sistemas, como caracterizar a capacidade de transcrição célula a célula do campo de interesse. Bem como as transcrições de localização da parede celular.
A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece uma quantidade de informações sobre as estatísticas dos processos transcricionais. Para iniciar o protocolo, cultive E.Coli MG1655 em meio LB durante a noite em um agitador orbital, a 260 RPM e 37 graus Celsius. No dia seguinte, diluir a cultura durante a noite em um a 100 em meio fresco e medir sua densidade óptica em um espectrofotômetro, até um valor de 0,2 a 0,4.
Em seguida, pelete as células por centrifugação por cinco minutos a 4.500 G a quatro graus Celsius. Remova o sobrenadante de todos os tubos. Adicione um mililitro de 1XPBS a cada tubo e ressuspenda o pellet para minimizar a agregação célula a célula.
Em seguida, adicione quatro mililitros de tampão de fixação e subtraia suavemente o tubo. Incubar as amostras em um agitador orbital. Ressuspenda o pellet para minimizar a agregação célula a célula, o que pode interferir na imagem celular.
Após a incubação, pelete as células, remova o sobrenadante e adicione um mililitro de 1XPBS. Transfira as suspensões para tubos de microcentrífuga de fundo cônico de 1,8 mililitro. Pellet as células por centrifugação.
Comece a permeabilização das bactérias removendo cuidadosamente o sobrenadante. Use pipetas de pequeno volume para remover todo o líquido fora do pellet. Em seguida, ressuspenda o pellet em 300 microlitros de água tratada com DEPC.
Adicione 350 microlitros de etanol absoluto de alta qualidade e misture a solução suavemente invertendo o tubo. Adicione mais 350 microlitros de etanol e misture novamente. Em seguida, gire a amostra com o rotador do tubo a 20 RPM por uma hora em temperatura ambiente.
Pulverize as células da permeabilização. Após centrifugação, remova o sobrenadante. Adicione um mililitro de tampão de lavagem de 20% às amostras.
Deixe-os em repouso por alguns minutos. Em seguida, células de pellets por centrifugação por sete minutos a 750 G e quatro graus Celsius. Remova o sobrenadante com muito cuidado e use pipetas de pequeno volume para remover todo o líquido fora do pellet.
Em seguida, adicione a solução estoque do conjunto de sonda de oligonucleotídeos à alíquota do tampão de hibridização de modo que a concentração final de oligonucleotídeos seja de 250 nanomolares e votice o tubo vigorosamente. Suspenda as amostras em 50 microlitros de tampão de hibridização que contém as sondas de oligonucleotídeos, evitando a geração de bolhas. Deixe as amostras durante a noite, no escuro, em um bloco de calor a 30 graus Celsius.
Para preparar a lavagem, obtenha um novo tubo de microcentrífuga para cada amostra a ser visualizada. Adicione um mililitro de tampão de lavagem a cada tubo. Adicione 10 a 15 microlitros das amostras hibridizadas ao novo tubo que contém o tampão de lavagem.
Pellet as células por centrifugação. Em seguida, remova o sobrenadante. Lave as amostras mais duas vezes.
Ressuspenda o pellet em tampão de lavagem de 25 microlitros. Prepare um gel de agarose adicionando 150 miligramas de agarose a 10 mililitros de tampão 2X SSC. Microondas a solução por 10 a 15 segundos de cada vez, até que a agarose se dissolva completamente.
Em seguida, deixe o tubo esfriar por alguns minutos. Em seguida, coloque uma moldura de silicone separadora na lâmina para que o centro da lâmina permaneça exposto. Coloque um anel rígido de 10 milímetros de largura e um a dois milímetros de espessura no centro da lâmina.
Deposite uma pequena quantidade de gel no centro para selar e aguarde alguns minutos para que o gel endureça. Em seguida, adicione mais gel, até formar uma forma de cúpula alta. Aguarde cerca de 10 minutos para que o gel endureça e remova o anel.
Deposite 10 microlitros de células bacterianas de lavagem no gel e sele-o com uma lâmina de lamínula número zero. Mantenha a amostra no escuro para evitar o fotobranqueamento. As medições de smFiSH de células E.coli mostram o nível de indução de galK em resposta a concentrações variáveis de D-fucose extracelular.
O sinal de fundo é mostrado por uma cepa excluída galK ou delta galK JW0740 como um controle negativo. Numerosas manchas são vistas na maioria das células. Correspondendo a um ou poucos transcritos galK quando dois milimolares D-fucose são adicionados à cultura bacteriana.
Considerando que, alguns pontos são vistos na ausência de D-fucose extracelular. Outro exemplo para a aplicação deste protocolo é fornecido pelo gene sodB, com imagens de fluorescência e contraste de fase de smFiSH em um tipo selvagem ou uma cepa excluída de JW1648 sodB. As amostras preparadas com este protocolo também podem ser visualizadas usando o STORM, que permite a precisão precisa dos transcritos na célula.
Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia de sistemas explorarem as estatísticas de eventos de transcrição em células individuais.
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Visão Geral
Este manuscrito descreve um método para rotular transcritos de RNA mensageiro (mRNA) individuais com sondas de DNA marcadas com fluorescência para uso em experimentos de hibridização in situ de fluorescência de molécula única (smFISH) em E. coli. Esta técnica permite a detecção simultânea, localização e quantificação de moléculas de mRNA únicas em células individuais fixas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia de Sistemas
- Biologia Celular
Fundo
- A hibridização in situ de fluorescência de molécula única (smFISH) é um método poderoso de visualização.
- Este método permite o estudo de processos transcricionais a nível de célula única.
- Compreender a localização e quantificação de mRNA é crucial para a biologia de sistemas.
- E. coli serve como um organismo modelo para estes experimentos.
Propósito do Estudo
- Rotular transcritos de mRNA individuais em E. coli.
- Visualizar a localização de mRNA usando sondas de DNA marcadas com fluorescência.
- Melhorar a compreensão da variabilidade transcricional entre células.
Métodos Utilizados
- Criar E. coli MG1655 em meio LB durante a noite.
- Dilui o cultivo noturno em meio fresco.
- Medir a densidade óptica para garantir condições de crescimento adequadas.
- Aplicar sondas de DNA marcadas com fluorescência para análise smFISH.
Principais Resultados
- Rotulagem bem-sucedida de transcritos de mRNA individuais.
- Visualização da localização de mRNA em células fixas.
- Quantificação de processos transcricionais a nível de molécula única.
- Insights sobre a variabilidade célula a célula na expressão de transcritos.
Conclusões
- O método fornece uma abordagem robusta para estudar a dinâmica do mRNA.
- Contribui com informações valiosas para o campo da biologia de sistemas.
- Esta técnica pode ser aplicada a várias questões de pesquisa relacionadas à expressão gênica.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) in E. coli enables direct quantification and spatial mapping of mRNA transcripts at single-cell resolution, addressing key challenges in understanding transcriptional heterogeneity. This capability supports predictive confidence in early discovery by revealing cell-to-cell variability and subcellular transcript localization. The method is strategically positioned for target validation and mechanistic de-risking in microbial systems biology and synthetic biology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of gene expression variability across individual bacterial cells.
- Supports mechanistic de-risking by mapping transcript localization and abundance at single-molecule resolution.
- Facilitates functional target validation by distinguishing true biological effects from population-averaged artifacts.
- Provides high-content data for hypothesis-driven pathway analysis in microbial models.
Screening & Assay Development
- Prepares validated bacterial systems for downstream screening of gene regulation or synthetic constructs.
- Delivers reproducible, quantitative mRNA copy number outputs for assay standardization.
- Enables multiplexed transcript detection within single cells, limited by spectral overlap of fluorophores.
- Supports robust evaluation of gene induction or repression in response to experimental perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling precise quantification of gene expression changes in microbial models.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation for engineered strains or pathway interventions.
- Reduces risk in advancing microbial targets by supplying single-cell resolution data on transcript dynamics.
Pipeline & Workflow Integration
This smFISH labeling method integrates into the discovery-to-preclinical continuum for microbial systems, supporting both hypothesis testing and quantitative analytics.
- Discovery Biology: Delivers direct measurement of transcriptional events and spatial transcript distribution for pathway clarification.
- Screening: Supplies standardized, quantitative readouts for evaluating gene expression modulation in engineered or wild-type strains.
- Analytics: Enables statistical analysis of mRNA copy number distributions and cell-to-cell variability using open-source or custom software.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models by validating gene expression changes at single-cell resolution.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable workflow for transcript quantification in diverse bacterial systems and experimental contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in microbial gene expression studies.
- Operational Value: Standardizes transcript labeling and imaging for reproducible, scalable data generation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for microbial targets and synthetic constructs by providing high-resolution expression data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of microbial targets and engineered pathways based on quantitative single-cell analytics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial cell handling, fixation, and fluorescence microscopy.
- Needs access to fluorescence imaging platforms with low-intensity detection and appropriate filter sets.
- Demands cross-team standardization of probe design and imaging protocols for reproducibility.
- Adaptation to other bacterial strains or gene targets may require probe redesign and spectral optimization.
- Multiplexing is limited by spectral overlap of available fluorophores, constraining simultaneous gene detection.
