Célula única quantificação das taxas de degradação de proteínas por microscopia de fluorescência de lapso de tempo em cultura de células aderentes

O objetivo geral desta abordagem de imagem de fluorescência é determinar a meia-vida de uma proteína de interesse em células vivas individuais usando um SNAP-tag. As proteínas celulares são renovadas extensivamente, com taxas de síntese e degradação específicas para cada proteína e sujeitas à regulação fisiológica. No entanto, os métodos mais comumente usados para determinar a meia-vida da proteína são limitados às médias populacionais de células de piolhos ou requerem o uso de inibidores da síntese de proteínas.

Neste vídeo, demonstramos como um SNAP-tag em combinação com microscopia de lapso de tempo de fluorescência pode ser usado para medir meias-vidas de proteínas em células vivas. A vantagem desse método é que ele atinge a resolução de uma única célula e, portanto, fornece uma estimativa para a heterogeneidade das meias-vidas em uma população de células cultivadas. O procedimento experimental aqui apresentado pode ser aplicado a qualquer tipo de células cultivadas aderentes, expressando uma proteína de interesse fundida a um SNAP-tag.

Isso pode ser alcançado por marcação endógena de proteínas ou usando a superexpressão de proteínas marcadas. O SNAP-tag é uma versão mutante da enzima de reparo do DNA, O6-alquilguanina-DNA alquiltransferase que reage especificamente com a benzilguanina, que pode ser acoplada a sondas moleculares. Portanto, qualquer proteína de fusão SNAP-tag pode ser irreversivelmente marcada com um corante permeável à célula de florescência.

Após a lavagem do corante residual, a população de proteínas marcadas decairá exponencialmente e a meia-vida da proteína correspondente pode ser inferida. Neste vídeo, usamos células-tronco embrionárias, que formam colônias apertadas quando cultivadas classicamente em pratos revestidos de gelatina. Para permitir que eles cresçam como uma monocamada de células e, assim, alcancem a resolução de célula única para experimentos de imagem de florescência, nós os cultivamos em placas revestidas aderentes ao inc, o que reduz as interações célula a célula mediadas pela adesão celular expressa na membrana plasmática.

Diluir o inc recombinante aderindo a cinco nanogramas por microlitro em PBS e adicionar 30 microlitros de inc diluído aderindo por válvula em uma placa de 96 válvulas, adequada para imagens. Evite pipetas extensas, pois a adesão ao inc recombinante é muito frágil. Incube a 37 graus por uma hora e meia.

Aspire a solução aderente inc, lave uma vez com 100 microlitros de PBS e adicione até 200 microlitros de meio de cultura ESL pré-vermesgado. Use linhas ESL expressando uma proteína de interesse fundida à etiqueta SNAP. Lave as células com cinco ml de PBS.

Em seguida, adicione dois ml de Tripson e incube por quatro minutos a 37 graus. Adicionar quatro ml de meio de cultura ESL, ressuspender e centrifugar a 1000 T durante quatro minutos. Aspire o sobrenadante, ressuspenda em meio fresco e conte as células.

Assente 30.000 células por centímetro quadrado na placa de imagem revestida aderente ao inc. Prossiga com a coloração do corante SNAP 24 horas após o assentamento da célula. Diluir o corante celular em meio de cultura ELS até à concentração óptima previamente determinada.

Aspire o meio usando uma pipeta e adicione cuidadosamente 50 microlitros do corante SNAP diluído. Incube por 30 minutos a 37 graus. Aspire o corante e lave três vezes com 200 microlitros de PBS pré-verme.

Adicione 200 microlitros de meio de cultura ESL e incube por 15 minutos a 37 graus. Execute as etapas de lavagem pipetando suavemente e não use um aspirador automático, pois as células tendem a se soltar facilmente. Repita as mesmas etapas de lavagem mais duas vezes e, em seguida, adicione 200 microlitros de meio de imagem.

Use meio livre de vermelho de fenol para reduzir o fundo da florescência. Use um microscópio que permita temperatura e CO2 controlados. Defina a temperatura para 37 graus e o CO2 para cinco por cento antes do uso e deixe o equilíbrio por uma a duas horas.

Coloque a placa no microscópio e selecione o local adequado para a geração de imagens. As imagens de campo claro mostram o ESL preso ao prato revestido aderente em uma monocamada. Selecione o objetivo, um objetivo 20X é apropriado para este tamanho de ESLs.

Selecione as configurações de iluminação para o canal de florescência a ser gravado. Ajuste a potência e a exposição do laser para obter um sinal forte, uma vez que diminuirá ao longo do filme. Selecione os parâmetros de aquisição para o experimento de lapso de tempo.

Para proteínas com meias-vidas esperadas de duas a vinte horas, escolha tempos de aquisição de 12 a 24 horas com intervalos de tempo de 15 minutos. Inicie o experimento de imagem. Use o software FIJI para processamento e análise do filme.

Colete as imagens adquiridas como uma pilha e deforme-a. Use a função FIJI de subtrair plano de fundo para remover o plano de fundo de todas as imagens da pilha. Selecione uma célula de interesse, desenhe uma região de interesse ao redor dela usando a barra de ferramentas FIJI e adicione a região de interesse ao ROI Manager.

Prossiga para o próximo quadro e repita as ações anteriores. Siga a célula de interesse ao longo do filme e salve o ROI definido para cada célula rastreada. Clique em medir para obter valores para a intensidade média e a área dos ROIs.

Para estimar o plano de fundo local, adicione uma região de interesse próxima à célula de interesse para cada período de tempo. No final, clique em medir para obter valores para a intensidade média do plano de fundo. Primeiro, calcule a intensidade média da célula multiplicando o valor obtido para a intensidade média do ROI celular por sua área.

Em seguida, prossiga para calcular o valor de fundo integrado da célula, multiplicando a intensidade média do ROI de fundo pela área do ROI celular. Finalmente, para obter um valor corrigido de fundo para a intensidade integrada da célula, subtraia o valor da intensidade de fundo integrado do valor de intensidade celular integrado. Para obter uma meia-vida média da população de células, normalize os valores obtidos para o valor de intensidade do primeiro quadro para cada célula.

Isso garante que cada célula contribua com o mesmo peso para o valor médio da meia-vida, independentemente de sua intensidade absoluta de florescência. Após as divisões celulares, rastreie as duas células-filhas separadamente e some suas intensidades integradas após a subtração de fundo para levar em conta a diluição da proteína durante a divisão celular. Salve os conjuntos de ROI para ambas as células-filhas.

Para a estimativa da meia-vida da proteína, use a ferramenta de ajuste de curva no MATLAB. O decaimento da proteína segue um exponencial onde F (x) é a intensidade da florescência no ponto de tempo dado, a "intensidade inicial e b" a taxa de decaimento. Depois de obter os valores para a taxa de decaimento b"do ajuste, a meia-vida pode ser calculada dividindo o logaritmo de dois por b"Este filme mostra o decaimento da florescência do corante SNAP em uma doxiciclina inutilizável opt quatro SNAP-tag

O sinal de florescência observado dependerá da linhagem celular utilizada, do nível de expressão da proteína correspondente de interesse, bem como das propriedades do corante que está sendo usado. Para experimentos de decaimento de proteínas, é importante usar uma concentração adequada de corante SNAP. A concentração deve ser alta o suficiente para produzir um sinal de florescência brilhante no início do lapso de tempo.

No entanto, o uso de concentrações muito altas de corante pode fazer com que o corante residual seja deixado no meio, mesmo após a lavagem. O corante livre pode posteriormente se ligar a moléculas de etiqueta SNAP recém-produzidas ao longo do filme, o que distorceria a curva de decaimento. Portanto, é crucial otimizar a concentração do corante SNAP testando diferentes diluições.

Esta figura mostra as curvas de decaimento para oito concentrações diferentes de um corante SNAP de florescência testado em uma linha celular inutilizável de doxiciclina. Uma concentração inicial de corante de três micromolares foi escolhida de acordo com as instruções do fabricante para imagens de células vivas, e uma diluição seriada de um a três foi realizada até atingir uma concentração de 1,4 nanomolar. Para as duas concentrações mais altas, o sinal não diminui, enquanto o decaimento observado segue uma curva exponencial para concentrações mais baixas.

Neste exemplo, uma concentração ideal de 12 nanomolares foi selecionada, uma vez que essa concentração garante quantidades mínimas de corante residual deixadas no meio após a lavagem, mas o sinal de florescência ainda é brilhante o suficiente para observar uma curva de decaimento clara. O protocolo descrito fornece uma estimativa da variabilidade célula a célula e meia-vida para qualquer proteína fundida ao SNAP-tag. Esta figura mostra os decaimentos de uma única célula e a média populacional para três diferentes linhas celulares de fusão SNAP-tag inutilizáveis de doxiciclina.

Nanog"e Oct4"são bastante curtos, com meias-vidas médias de 2,9 e 4,8 horas. Considerando que Srsf11 "tem vida mais longa, tendo uma meia-vida média de 25,3 horas. Os gráficos de caixa mostram a distribuição de meias-vidas para as três proteínas.

Mostramos que o uso de um SNAP-tag, em combinação com a microscopia de lapso de tempo de florescência, permite determinar a meia-vida de qualquer proteína de interesse. As medições de decaimento de célula única fornecem uma estimativa para a heterogeneidade das meias-vidas em uma população de células, que é omitida ao usar outros métodos para determinar as meias-vidas das proteínas. Uma das etapas mais cruciais ao usar uma etiqueta SNAP para monitorar a deterioração da proteína é garantir que nenhum corante residual não ligado seja deixado no meio ou nas células após a lavagem.

Caso contrário, ele pode se ligar a moléculas de marcação SNAP recém-produzidas mais tarde no decorrer do experimento e, assim, comprometer a curva de decaimento. Por um lado, isso é conseguido executando cuidadosamente todas as etapas de lavagem descritas. Por outro lado, a concentração do corante SNAP deve ser mantida o mais baixa possível, mantendo-se em uma faixa que permita obter uma boa relação sinal-ruído.

A concentração do corante SNAP deve ser otimizada para cada experimento de acordo com a linhagem celular e o tipo de corante usado. Embora seja possível que o SNAP-tag possa alterar a meia-vida das proteínas candidatas em alguns casos, não vemos evidências de tais efeitos, pois as meias-vidas determinadas do teste de proteínas candidatas aderem aos valores publicados correspondentes. Para descartar ainda mais um efeito do SNAP-tag na degradação da proteína, uma opção seria bloquear a síntese de proteínas com cicloheximida e realizar borrões no banheiro em diferentes momentos, usando um anticorpo que reconhece a proteína indígena.

E para comparar diretamente o decaimento da proteína candidata SNAP-tag com a versão indígena não marcada.