Name: Célula única quantificação das taxas de degradação de proteínas por microscopia de fluorescência de lapso de tempo em cultura de células aderentes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Aprenda a quantificar meias-vidas de proteínas em células individuais usando SNAP-tag e microscopia de fluorescência em lapso de tempo. Este método revela a heterogeneidade da degradação proteica em culturas aderentes.

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No Biomolecular triagem Facility (BSF), EPFL, foram realizados experimentos de microscopia de lapso de tempo. Agradecemos a Marc Delachaux (serviço audiovisual, EPFL) para a produção de vídeo e edição do filme.

Nota: Neste estudo, foi usada a linha da célula E14 ES. No entanto, este protocolo é directamente aplicável a qualquer outra linha de células de rato ES expressar uma proteína de interesse fundido a um SNAP-tag, marcando a proteína endógena ou usando superexpressão. Para os exemplos mostrados na seção de resultados, foram utilizadas linhas de células de fusão SNAP-tag doxiciclina-inducible (SNAP-marca fundiu-se para as seguintes proteínas: Nanog, Oct4, Srsf11, ou para o mOrange2 de proteínas fluorescentes e sfGFP e colocar sob o controle de um doxiciclina-inducible promotor. Veja11 para obter mais informações sobre o plasmídeo utilizado para a geração das linhas de célula doxiciclina-inducible SNAP-marca fusão). O sistema de doxiciclina-inducible pode ser particularmente útil, pois permite controlar rigidamente o tempo e na intensidade da expressão da proteína de interesse. C-terminal de posicionamento de marca do SNAP é recomendado, como mudar o N-terminal sequência de aminoácidos é mais susceptível de modificar o Half-Life da proteína alvo (N-fim regra12).
1. E-caderina revestimento e propagação de células
<ol><li>Gere uma linha de celular ES expressar uma proteína de interesse fundido ao SNAP-marca4.</li>
	<li>Pratos de cultura de célula casaco 100 mm com 4 mL de gelatina de 0,1% (diluída em solução salina tamponada fosfato (PBS) sem Ca2 +/ mg2 +) por 1 h. Retire a gelatina e deixem secos por 1 h. uso imediatamente ou armazenam os pratos revestidos por até 2 meses.</li>
	<li>Crescer a linhagem de células de interesse em meio de cultura celular ES (Glasgow mínimo essencial médio, suplementado com 10% ES qualificado célula fetal de soro bovino, piruvato de sódio 2 mM, 1% não aminoácidos essenciais, 1% penicilina/estreptomicina, 2 mM L-glutamina, 100 µM 2- Mercaptoetanol, fator inibitório de leucemia (LIF), 3 µM CHIR99021 e 0,8 µM PD184352) em pratos de gelatina-revestido a 37 ° C e 5% CO2 por 2 dias até atingir uma confluência de 10-20 células de Mio por prato. Nota: Aqui, LIF foi produzido por transfection transiente de células de 293T HEK, seguido pela coleta de sobrenadante e filtragem. Cada lote de LIF foi testado por seu potencial para manter a pluripotência, mas concentrações não foram determinadas. No entanto, LIF recombinante também está disponível comercialmente e a concentração comumente utilizada para cultura de células de rato ES é de 1000 unidades/mL13.</li>
	<li>Revestir uma placa de 96 poços adequada para imagens com 30 µ l de rato recombinante da proteína de Quimera de E-caderina Fc (E-cad-Fc) por alvéolo (5 ng / µ l, diluído em PBS com Ca2 +/ mg2 +. Use concentrações estoque de 100 ng / µ l, armazenado a-80 ° C). Evite pipetagem extensa, como E-cad-Fc é muito frágil. Incube a 37 ° C por 1,5 h. Nota: Dependendo do microscópio, outros formatos podem ser usados.</li>
	<li>Aspire o E-cad-Fc, lave uma vez com 100 µ l de PBS com Ca2 +/ mg2 +e adicionar 100 µ l de meio de cultura de células ES previamente aquecido.</li>
	<li>Lavam-se as células de interesse com 5 mL de PBS sem Ca2 +/ mg2 +. Aspire e adicionar 2 mL de EDTA-tripsina 0,25%. Incubar durante 4 min a 37 ° C. Adicionar 4 mL de meio de cultura celular ES, resuspenda e spin para baixo a 1000 x g, durante 4 min. Aspire o sobrenadante e resuspenda o pellet em 2 mL de meio de cultura celular ES fresco. Nota: PBS sem Ca2 +/ mg2 + deve ser usado para as células antes tripsinização de lavagem para remover Ca2 + íons, que são necessários para a adesão celular. Em contraste, para a diluição E-cad-Fc e revestimento (etapa 1.4), use o PBS com Ca2 +/ mg2 +, desde a adesão de células ES de E-cad-Fc pratos revestidos é Ca2 +-dependente14.</li>
	<li>Dilua a ressuspensão células 01:10 em 1 mL de meio de cultura celular ES e contagem, utilizando uma câmara de contagem (carga 10 µ l para uma câmara de 0,1 mm de profundidade).</li>
	<li>Semente de 30.000 células/cm2 no E-cad-Fc revestido placa de imagem. Encha até 200 µ l por alvéolo com meio de cultura celular ES. Para linhas de célula doxiciclina-inducible, induzir com uma dose apropriada de doxiciclina (otimizar dose e temporização da indução com antecedência. As linhas celulares usadas aqui foram tratadas com doxiciclina de ng/mL 500 24 h antes de imagem). Incubar a 37 ° C e 5% de CO2 e prossiga com o pulso, rotulagem e imagem 24h após a semeadura da célula.</li>
</ol>2. pulso rotulagem da SNAP-tag
Nota: Para experimentos de degradação de proteínas é fundamental usar uma adequada concentração de corante SNAP. A concentração deve ser alta o suficiente para produzir um sinal brilhante no início do lapso de tempo, como a fluorescência irá diminuir ao longo do tempo. No entanto, usando concentrações de tintura muito alto pode causar corante residual, sendo deixado no meio ou nas células mesmo após a lavagem. O corante livre posteriormente pode vincular a recém-produzido SNAP-marca moléculas ao longo do filme, que vai distorcer a curva de decaimento. O sinal de fluorescência observado dependerá das propriedades do corante, a linha de celular usado, bem como o nível de expressão da proteína correspondente. Portanto, é fundamental otimizar a concentração de corante, testando diferentes diluições, a partir da diluição sugerida para a imagem latente de célula viva pelo fabricante. Para este estudo, utilizou-se um substrato fluorescente far-red. Uma concentração ideal de 12 nM foi determinada para as linhas de célula de doxiciclina-inducible superexpressão.
<ol><li>Dilua o corante SNAP na concentração apropriada em meio de cultura de células ES previamente aquecido. Usar uma pipeta para remover suavemente o meio das células previamente semeadas na placa de 96 poços e adicionar 50 μL de tintura SNAP diluída por bem. Incubar durante 30 min a 37 ° C.</li>
	<li>Aspirar a tintura diluída com uma pipeta e lavar 3x com 200 µ l de PBS pré-aquecido (sem o Ca2 +/ mg2 +). Acrescente 200 µ l de meio de cultura celular ES e incube por 15 min a 37 ° C.</li>
	<li>Repita as etapas anteriores de lavagem mais duas vezes. Nota: Lavagem extensa é importante a fim de remover qualquer corante não acoplado. As etapas de lavagem repetida com PBS remover a tintura extracellular residual no meio, Considerando que a incubação do 15 min assegurar robusto rotulagem das proteínas de fusão de SNAP-etiqueta antes de iniciar a experiência de imagem. No entanto, execute as etapas de lavagem pipetando suave e não usar um aspirador automático, como células semeadas na E-cad-Fc tendem a separar-se facilmente.</li>
	<li>Adicione 200 µ l de meio de imagem. Para reduzir o fundo de fluorescência, utilize meio livre de vermelho de fenol (suplementado com 10% ES qualificado célula fetal de soro bovino, piruvato de sódio 2 mM, 1% não aminoácidos essenciais, 1% penicilina/estreptomicina, 2 mM L-glutamina, 100 µM 2-Mercaptoetanol, LIF, 3 µM CHIR99021 e 0,8 µM PD184352).</li>
</ol>3. Time-Lapse microscopia
<ol><li>Use um microscópio apropriado para geração de imagens ao vivo, permitindo que a temperatura controlada e CO2. Defina a temperatura de 37 ° C e o CO2 a 5% antes de usar e permitem equilibrar para 1-2 h.</li>
	<li>Coloque o prato no microscópio e encontrar locais adequados para a imagem latente. Selecione os pontos onde as células são uniformemente distribuídas, mas não muito denso, como isso irá facilitar a análise. Ajuste o número de pontos selecionados para o número de células necessárias para a análise. Neste estudo, foram registrados 3-5 pontos por linha celular.</li>
	<li>Selecione o objetivo. Um objectivo X 20 é apropriado para o tamanho de pilhas do ES.</li>
	<li>Selecione as configurações de iluminação para o canal fluorescente (s) a ser gravado. Ajuste a potência do laser e a exposição de acordo com a intensidade do sinal de fluorescência das células de interesse. Certifique-se de obter um forte sinal inicial, uma vez que irá diminuir ao longo do filme, mas evitar os poderes do laser superior a 30% a fim de minimizar a fototoxicidade e fotobranqueamento. Para este estudo, um filtro de excitação de 632/22 nm (comprimento de onda/bandpass), filtro de emissão de 679/34 nm (comprimento de onda/bandpass), poder do laser do tempo de exposição e 10% de 100 ms foram usados.</li>
	<li>Selecione os intervalos e a duração da experiência do tempo-lapso de imagem. Para proteínas com esperado meia-vida de 2-20 h, escolha tempos de aquisição de 12-24 h com intervalos de tempo de 15 min. Para proteínas do cliente, reduza os intervalos e tempos de aquisição, para aumento de proteínas caudais em conformidade.</li>
	<li>Começa a imagem.</li>
</ol>4. processamento e análise de imagem
<ol><li>Recolha as imagens adquiridas como uma pilha no formato tiff. Para análise e tratamento subsequente, use o software de FIJI15. Se os dados de lapso de tempo não são coletados como uma pilha pelo software do microscópio, abrir todos os quadros da experiência do tempo-lapso no software (ou clicando em arquivo | Abrir... ou arrastar e soltar os arquivos correspondentes à barra de ferramentas) e clique em imagem | Pilhas | Imagens de empilhar.</li>
	<li>Use a função de fundo subtrair para remover o fundo de todas as imagens na pilha. Para isso, clique em processo | Subtrair a fundo. Selecione o raio de bola rolando na janela pop-up. Use um raio que é pelo menos o tamanho das células fotografada. Para aplicar a subtração de fundo para todas as células na pilha, selecione Sim no pilha processo? janela pop-up.</li>
	<li>Selecione uma célula de interesse e desenhar uma região de interesse (ROI) em torno dele usando a barra de ferramentas. Para sinais nucleares, use a seleção Oval primeiro clicando na guia correspondente na barra de ferramentas e depois clicando sobre o núcleo de interesse e ajustando o oval em torno dele. Para sinais citoplasmáticos ou regiões muito densas use a seleção à mão livre para ser capaz de acompanhar de perto os contornos da célula. Evite incluindo regiões muito grandes, de fundo, mesmo que não é necessário seguir os contornos de célula precisamente devido a posterior subtração de todos os pixels do fundo (etapa 4.8-4.9).</li>
	<li>Adicione a região de interesse para o Gerenciador de ROI clicando Analyze | Ferramentas | Gerente de ROI | Adicionar, ou com a tecla T no teclado.</li>
	<li>Prosseguir para o próximo quadro movendo a guia na janela pilha ou por pressionando shift + &lt; no teclado, em seguida, repita as ações anteriores. Siga a célula de interesse ao longo do filme e adicionar o ROI de cada frame para o Gerenciador de ROI. Salvar o ROI final definido para cada célula controlada clicando mais | Salve... no Gerenciador de ROI. Nota: Depois de divisões celulares, rastrear as duas células-filhas separadamente e resumir sua intensidade integrada após subtracção de fundo (ver passos 4.6-4.9) a conta para diluição de proteína durante a divisão celular. Salve os conjuntos ROI para as duas células-filhas.</li>
	<li>Uma vez que a célula de interesse é controlada durante todo o filme, clique em medida, para obter valores de intensidade média e a área do ROIs. Copie os valores obtidos em um programa de planilha eletrônica e calcular a intensidade integrada cru da célula para cada ponto de tempo da seguinte maneira: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq1.jpg"> onde quer dizerca intensidade média eáreaCa área do ROI correspondente.</li>
	<li>Para estimar o fundo local, adicione um ROI perto da célula de interesse para cada período de tempo. Evite incluindo qualquer sinal de fluorescência celular. Use um ROI circular que é aproximadamente do tamanho de uma célula e mover ou reduzi-lo em conformidade, se necessário, por exemplo, se as células vizinhas a interferir. Proceda como descrito anteriormente, com o celular ROI em conjunto a fim de obter um ROI de fundo definida e copiar os valores de medida de intensidade para a planilha.</li>
	<li>Para obter um valor de correção de fundo para a intensidade integrada da célula, primeiro Calcule a intensidade integrada do plano de fundo para cada ponto de tempo: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq2.jpg"> onde quer dizerBG é a intensidade média do sinal de fundo e áreaC é a área do ROI circundando a célula. Não utilize a área do plano de fundo ROI, a menos que ambas as áreas têm o mesmo tamanho.</li>
	<li>Calcule a intensidade integrada final subtraído de plano de fundo da célula para cada ponto de tempo: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq3.jpg">
</li>
	<li>Para normalizar as curvas de decaimento de célula única, divida o valor de intensidade de cada ponto do tempo pelo valor do primeiro tempo-ponto de intensidade. Nota: A curva de ajuste (ver passo 4.11) pode também ser executada em cada célula única ou sobre a média da população. Uma normalização é necessária se uma população com base média é calculada para evitar vieses de intensidades de fluorescência diferentes entre as células. A normalização, assim, garante que cada célula contribui com o mesmo peso para a curva de decaimento final. Além disso, a normalização pode ser útil para visualizar os decaimentos única célula independentemente suas intensidades de fluorescência absoluto (ver Figuras 3A-3C). No entanto, se apenas a meia-vida de célula única é determinado e os dados não é uma média, a etapa de normalização pode ser omitida e a curva de ajuste pode ser executada diretamente em dados brutos.</li>
	<li>Para a estimativa do Half-Life da proteína, use uma ferramenta de encaixe de curva. Neste estudo, utilizou-se a curva MATLAB, montagem de ferramentas 3.4.1, que está localizado por padrão na seção de aplicativos de interface de usuário do MATLAB. Importar a intensidade da fluorescência e valores de tempo da planilha eletrônica em MATLAB, clicando na guia Importar dados Abra a caixa de ferramentas de encaixe de curva e selecionar os pontos de tempo e dados de decaimento de fluorescência no dados X e Y de dados Tab. Choose Custom equação no encaixe de curva tab e insira a equação para um decaimento exponencial: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq4.jpg"> onde f é a intensidade da fluorescência em um determinado ponto de tempo, um a intensidade inicial e b a taxa de decaimento. Nas Opções de ajuste... guia, selecione 0 para o limite de um e b. Os valores estimados para a e b aparecerá na janela de resultados. Calcule a meia-vida da seguinte maneira: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq5.jpg">
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

A etapa mais crucial quando usando um SNAP-tag para monitorar a deterioração de proteína é garantir que nenhuma tintura desacoplada residual é deixada no meio ou nas células após a lavagem, caso contrário pode vincular recém produzido moléculas SNAP-marca mais tarde durante o experimento e ther Eby comprometer a curva de decaimento. Isto é por um lado, alcançado realizando cuidadosamente todas as etapas de lavagem descritas. Por outro lado, a concentração de corante deve ser mantida tão baixa quanto possível, estando ain...

É sabido que as proteínas celulares passam por extenso volume de negócios, com taxas de síntese e degradação, sendo específicas para cada proteína e sujeitas a regulação fisiológica. Tradicionalmente, taxas de degradação de proteínas são medidos usando métodos em massa, tais como análise de perseguição de pulso radioactivos, ou envolvendo inibidores da síntese de proteínas tais como cicloheximida1. Mais recentemente, isótopo estável, etiquetando com aminoácidos na cultura de pilha (SILAC) em combinação com a espectrometria de massa foi estabelecido para quantificar o volume de negócios de proteína em uma escala global2. No entanto, esses métodos são limitados por uma média de população, e informações sobre a variabilidade de célula para célula, portanto, estão perdidas. Além disso, mudanças transientes na degradação de proteínas que são sincronizadas através de população celular não podem ser identificadas.
Alternativamente, proteína de meia-vida também pode ser determinado por abordagens baseadas em fluorescência, que muitas vezes têm a vantagem de fornecer resolução de célula única. Por exemplo, uma proteína fluorescente verde photoactivatable (paGFP) tem sido usada para determinar o Oct4 Half-Life no início3embriões de mamíferos. Um outro método para monitorar a degradação de proteínas em células vivas é o uso de uma marca de SNAP em combinação com a imagem de lapso de tempo de fluorescência. A SNAP-tag é uma versão mutante da enzima O reparo DNA6- alkylguanine DNA-alkyltransferase (AGT) que reage especificamente com benzylguanine derivados de (BG), que podem ser acoplados ao sondas moleculares4,5, 6. portanto, qualquer proteína de fusão SNAP-etiqueta pode ser irreversivelmente rotulada com um corante fluorescente, de permeável célula. Rotulagem de pulso de uma proteína de interesse fundido a marca do SNAP, seguida de esmaecimento do corante residual, permite para monitorar a degradação da população rotulada de proteína e, portanto, para a determinação de Half-Life da proteína. SNAP-etiquetas tem sido utilizados com sucesso para a rotulagem de pulso-perseguição de proteínas e para a determinação da proteína meias-vidas em aderente celulares cultura e na vivo5,7,8,9. Uma grande variedade de substratos SNAP-marca cobrindo comumente usado de espectros fluorescentes são comercialmente disponíveis, permitindo a seleção do corante ideal para cada aplicação específica. Assim, SNAP-marcas também podem ser usadas para a imagem latente multicolor em combinação com outras proteínas da fusão fluorescente ou corantes. Corantes célula-impermeável são adequados para a rotulagem das proteínas de membrana-amarrados, Considerando que a célula-permeável corantes são aplicáveis para o monitoramento de proteínas intracelulares e membrana-limite. Além disso, alguns dos tais sondas não exibem quase nenhuma fluorescência basal e apenas começam a emitir um sinal fluorescente forte sobre vinculação a um SNAP-marca10.
Este protocolo descreve como medir as taxas de degradação de proteínas diferentes de interesse em células únicas usando um SNAP-tag. Aqui podemos aplicar esse método para as células-tronco embrionárias (ES) do mouse cultivadas na E-caderina, mas deve ser possível usá-lo com qualquer tipo de células cultivadas aderentes. Mostramos que pulso rotulagem de proteínas da fusão SNAP-marca seguidas por imagens de lapso de tempo de fluorescência permite determinar as única célula meias-vidas de várias proteínas de interesse e fornece uma estimativa para a variabilidade de célula para célula de meias-vidas em um população de células cultivadas.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ES linha celular expressando uma proteína de fusão SNAP-tag de interesse</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Plate</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>96 Well, Preto/Transparente, Placa Tratada com Cultura de Tecidos</td><td>Corning</td><td>353219</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de contagem melhorada por Neubauer, 0,1 mm</td><td>Marienfeld-superior</td><td>640030</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de CO2</td><td>Panasonic</td><td>MCO-170AICUV-PE</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5804 R</td><td>Eppendorf</td><td>5804000528</td><td></td></tr><tr><td>InCell Analyzer 2200 Sistema de Imagem Celular</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>29027886</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número do catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Reagentes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glasgow Meio Essencial Mínimo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5154</td><td></td></tr><tr><td>Soro Bovino Fetal, qualificado por células-tronco embyônicas</td><td>ThermoFisher</td><td>16141-079</td><td></td></tr><tr><td>Solução de piruvato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>113-24-6</td><td></td></tr><tr><td>Meio Essencial Mínimo&nbsp; Aminoácidos não essenciais</td><td>ThermoFisher</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>BioConcept</td><td>4-01F00H</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina 200mM</td><td>ThermoFisher</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63689-25ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Fator inibidor de leucemia</td><td>-</td><td>-</td><td>Produzido em laboratório por transfecção transitória de células HEK-293T, seguida de coleta e filtragem do sobrenadante.</td></tr><tr><td>CHIR99021 (Inibidor XVI de GSK-3)</td><td>Merck Millipore</td><td>361559</td><td></td></tr><tr><td>PD 0325901</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>391210-10-9</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina de pele bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9000-70-8</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x concentrado de Dulbecco</td><td>BioConcept</td><td>3-05K00-I</td><td></td></tr><tr><td>PBS de Dulbecco sem Ca++/Mg++</td><td>BioConcept</td><td>3-05F29-I</td><td></td></tr> Proteína recombinante R& da quimera do Fc do rato da E-Caderina da <tr><td>Trypsin-EDTA-Solution 0.25%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td></td><td> D systems</td><td>748-EC-050</td><td></td></tr><tr><td>Hidrato de doxiciclina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>SNAP-Cell 647-SiR</td><td>New England BioLabs</td><td>S9102S</td><td></td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>A18967-01</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número do catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI-</td><td></td><td>-</td><td>Software de análise de imagem de código aberto</td></tr><tr><td>MATLAB R2014a</td><td>Mathworks-Microsoft</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

célula única quantificação das taxas de degradação de proteínas por microscopia de fluorescência de lapso de tempo em cultura de células aderentes

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

As proteínas estão em um estado dinâmico da síntese e degradação e sua meia-vida podem ser ajustada sob várias circunstâncias. No entanto, mais comumente usados abordagens para determinar ou Half-Life da proteína são limitados para as médias de população de células lisadas ou exigem o uso de inibidores da síntese de proteínas. Este protocolo descreve um método para medir a proteína meia-vida em vida única células aderentes, usando proteínas da fusão SNAP-etiqueta em combinação com microscopia de fluorescência lapso de tempo. Qualquer proteína de interesse fundido a um SNAP-tag pode ser ligados covalentemente por uma tintura fluorescente, de célula permeável que está acoplada a um derivado de benzylguanine, e a decadência da população rotulada de proteína pode ser monitorizada após a lavagem do corante residual. Célula subsequente acompanhamento e quantificação da intensidade da fluorescência integrado sobre resultados de tempo em uma curva de decaimento exponencial para cada célula rastreada, permitindo a determinação de taxas de degradação de proteínas em células únicas pelo encaixe de curva. Este método fornece uma estimativa para a heterogeneidade das meias-vidas em uma população de células cultivadas, que não podem ser facilmente avaliados por outros métodos. A abordagem apresentada aqui é aplicável a qualquer tipo de culturas de células aderentes de expressar uma proteína de interesse fundido a um SNAP-tag. Aqui usamos as células-tronco embrionárias (ES) do mouse cultivadas em placas de cultura de células E-caderina-revestido para ilustrar como único degradação celular, taxas de proteínas com uma ampla gama de meia-vida podem ser determinadas.

O protocolo descrito fornece uma estimativa da variabilidade de célula para célula em Half-Life para qualquer proteína dada fundida a um SNAP-tag. O uso de recombinante E-caderina-Fc para o revestimento da placa de imagem permite a resolução única célula em células de ES, que, de outra forma, crescem nas colônias. Células individuais podem ser controladas separadamente ao longo do filme ( figura 1A).
Para determinar a meia-vida de proteína para cada célula única, ...

Este protocolo descreve um método para determinar a proteína meia-vida em vida única células aderentes, usando pulso rotulagem e imagem latente de lapso de tempo de fluorescência de proteínas da fusão SNAP-marca.

Célula única quantificação das taxas de degradação de proteínas por microscopia de fluorescência de lapso de tempo em cultura de células aderentes

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...

O objetivo geral desta abordagem de imagem de fluorescência é determinar a meia-vida de uma proteína de interesse em células vivas individuais usando um SNAP-tag. As proteínas celulares são renovadas extensivamente, com taxas de síntese e degradação específicas para cada proteína e sujeitas à regulação fisiológica. No entanto, os métodos mais comumente usados para determinar a meia-vida da proteína são limitados às médias populacionais de células de piolhos ou requerem o uso de inibidores da síntese de proteínas.Neste vídeo, demonstramos como um SNAP-tag em combinação com microscopia de lapso de tempo de fluorescência pode ser usado para medir meias-vidas de proteínas em células vivas. A vantagem desse método é que ele atinge a resolução de uma única célula e, portanto, fornece uma estimativa para a heterogeneidade das meias-vidas em uma população de células cultivadas. O procedimento experimental aqui apresentado pode ser aplicado a qualquer tipo de células cultivadas aderentes, expressando uma proteína de interesse fundida a um SNAP-tag.Isso pode ser alcançado por marcação endógena de proteínas ou usando a superexpressão de proteínas marcadas. O SNAP-tag é uma versão mutante da enzima de reparo do DNA, O6-alquilguanina-DNA alquiltransferase que reage especificamente com a benzilguanina, que pode ser acoplada a sondas moleculares. Portanto, qualquer proteína de fusão SNAP-tag pode ser irreversivelmente marcada com um corante permeável à célula de florescência.Após a lavagem do corante residual, a população de proteínas marcadas decairá exponencialmente e a meia-vida da proteína correspondente pode ser inferida. Neste vídeo, usamos células-tronco embrionárias, que formam colônias apertadas quando cultivadas classicamente em pratos revestidos de gelatina. Para permitir que eles cresçam como uma monocamada de células e, assim, alcancem a resolução de célula única para experimentos de imagem de florescência, nós os cultivamos em placas revestidas aderentes ao inc, o que reduz as interações célula a célula mediadas pela adesão celular expressa na membrana plasmática.Diluir o inc recombinante aderindo a cinco nanogramas por microlitro em PBS e adicionar 30 microlitros de inc diluído aderindo por válvula em uma placa de 96 válvulas, adequada para imagens. Evite pipetas extensas, pois a adesão ao inc recombinante é muito frágil. Incube a 37 graus por uma hora e meia.Aspire a solução aderente inc, lave uma vez com 100 microlitros de PBS e adicione até 200 microlitros de meio de cultura ESL pré-vermesgado. Use linhas ESL expressando uma proteína de interesse fundida à etiqueta SNAP. Lave as células com cinco ml de PBS.Em seguida, adicione dois ml de Tripson e incube por quatro minutos a 37 graus. Adicionar quatro ml de meio de cultura ESL, ressuspender e centrifugar a 1000 T durante quatro minutos. Aspire o sobrenadante, ressuspenda em meio fresco e conte as células.Assente 30.000 células por centímetro quadrado na placa de imagem revestida aderente ao inc. Prossiga com a coloração do corante SNAP 24 horas após o assentamento da célula. Diluir o corante celular em meio de cultura ELS até à concentração óptima previamente determinada.Aspire o meio usando uma pipeta e adicione cuidadosamente 50 microlitros do corante SNAP diluído. Incube por 30 minutos a 37 graus. Aspire o corante e lave três vezes com 200 microlitros de PBS pré-verme.Adicione 200 microlitros de meio de cultura ESL e incube por 15 minutos a 37 graus. Execute as etapas de lavagem pipetando suavemente e não use um aspirador automático, pois as células tendem a se soltar facilmente. Repita as mesmas etapas de lavagem mais duas vezes e, em seguida, adicione 200 microlitros de meio de imagem.Use meio livre de vermelho de fenol para reduzir o fundo da florescência. Use um microscópio que permita temperatura e CO2 controlados. Defina a temperatura para 37 graus e o CO2 para cinco por cento antes do uso e deixe o equilíbrio por uma a duas horas.Coloque a placa no microscópio e selecione o local adequado para a geração de imagens. As imagens de campo claro mostram o ESL preso ao prato revestido aderente em uma monocamada. Selecione o objetivo, um objetivo 20X é apropriado para este tamanho de ESLs.Selecione as configurações de iluminação para o canal de florescência a ser gravado. Ajuste a potência e a exposição do laser para obter um sinal forte, uma vez que diminuirá ao longo do filme. Selecione os parâmetros de aquisição para o experimento de lapso de tempo.Para proteínas com meias-vidas esperadas de duas a vinte horas, escolha tempos de aquisição de 12 a 24 horas com intervalos de tempo de 15 minutos. Inicie o experimento de imagem. Use o software FIJI para processamento e análise do filme.Colete as imagens adquiridas como uma pilha e deforme-a. Use a função FIJI de subtrair plano de fundo para remover o plano de fundo de todas as imagens da pilha. Selecione uma célula de interesse, desenhe uma região de interesse ao redor dela usando a barra de ferramentas FIJI e adicione a região de interesse ao ROI Manager.Prossiga para o próximo quadro e repita as ações anteriores. Siga a célula de interesse ao longo do filme e salve o ROI definido para cada célula rastreada. Clique em medir para obter valores para a intensidade média e a área dos ROIs.Para estimar o plano de fundo local, adicione uma região de interesse próxima à célula de interesse para cada período de tempo. No final, clique em medir para obter valores para a intensidade média do plano de fundo. Primeiro, calcule a intensidade média da célula multiplicando o valor obtido para a intensidade média do ROI celular por sua área.Em seguida, prossiga para calcular o valor de fundo integrado da célula, multiplicando a intensidade média do ROI de fundo pela área do ROI celular. Finalmente, para obter um valor corrigido de fundo para a intensidade integrada da célula, subtraia o valor da intensidade de fundo integrado do valor de intensidade celular integrado. Para obter uma meia-vida média da população de células, normalize os valores obtidos para o valor de intensidade do primeiro quadro para cada célula.Isso garante que cada célula contribua com o mesmo peso para o valor médio da meia-vida, independentemente de sua intensidade absoluta de florescência. Após as divisões celulares, rastreie as duas células-filhas separadamente e some suas intensidades integradas após a subtração de fundo para levar em conta a diluição da proteína durante a divisão celular. Salve os conjuntos de ROI para ambas as células-filhas.Para a estimativa da meia-vida da proteína, use a ferramenta de ajuste de curva no MATLAB. O decaimento da proteína segue um exponencial onde F (x) é a intensidade da florescência no ponto de tempo dado, a "intensidade inicial e b" a taxa de decaimento. Depois de obter os valores para a taxa de decaimento b"do ajuste, a meia-vida pode ser calculada dividindo o logaritmo de dois por b"Este filme mostra o decaimento da florescência do corante SNAP em uma doxiciclina inutilizável opt quatro SNAP-tagO sinal de florescência observado dependerá da linhagem celular utilizada, do nível de expressão da proteína correspondente de interesse, bem como das propriedades do corante que está sendo usado. Para experimentos de decaimento de proteínas, é importante usar uma concentração adequada de corante SNAP. A concentração deve ser alta o suficiente para produzir um sinal de florescência brilhante no início do lapso de tempo.No entanto, o uso de concentrações muito altas de corante pode fazer com que o corante residual seja deixado no meio, mesmo após a lavagem. O corante livre pode posteriormente se ligar a moléculas de etiqueta SNAP recém-produzidas ao longo do filme, o que distorceria a curva de decaimento. Portanto, é crucial otimizar a concentração do corante SNAP testando diferentes diluições.Esta figura mostra as curvas de decaimento para oito concentrações diferentes de um corante SNAP de florescência testado em uma linha celular inutilizável de doxiciclina. Uma concentração inicial de corante de três micromolares foi escolhida de acordo com as instruções do fabricante para imagens de células vivas, e uma diluição seriada de um a três foi realizada até atingir uma concentração de 1,4 nanomolar. Para as duas concentrações mais altas, o sinal não diminui, enquanto o decaimento observado segue uma curva exponencial para concentrações mais baixas.Neste exemplo, uma concentração ideal de 12 nanomolares foi selecionada, uma vez que essa concentração garante quantidades mínimas de corante residual deixadas no meio após a lavagem, mas o sinal de florescência ainda é brilhante o suficiente para observar uma curva de decaimento clara. O protocolo descrito fornece uma estimativa da variabilidade célula a célula e meia-vida para qualquer proteína fundida ao SNAP-tag. Esta figura mostra os decaimentos de uma única célula e a média populacional para três diferentes linhas celulares de fusão SNAP-tag inutilizáveis de doxiciclina.Nanog"e Oct4"são bastante curtos, com meias-vidas médias de 2,9 e 4,8 horas. Considerando que Srsf11 "tem vida mais longa, tendo uma meia-vida média de 25,3 horas. Os gráficos de caixa mostram a distribuição de meias-vidas para as três proteínas.Mostramos que o uso de um SNAP-tag, em combinação com a microscopia de lapso de tempo de florescência, permite determinar a meia-vida de qualquer proteína de interesse. As medições de decaimento de célula única fornecem uma estimativa para a heterogeneidade das meias-vidas em uma população de células, que é omitida ao usar outros métodos para determinar as meias-vidas das proteínas. Uma das etapas mais cruciais ao usar uma etiqueta SNAP para monitorar a deterioração da proteína é garantir que nenhum corante residual não ligado seja deixado no meio ou nas células após a lavagem.Caso contrário, ele pode se ligar a moléculas de marcação SNAP recém-produzidas mais tarde no decorrer do experimento e, assim, comprometer a curva de decaimento. Por um lado, isso é conseguido executando cuidadosamente todas as etapas de lavagem descritas. Por outro lado, a concentração do corante SNAP deve ser mantida o mais baixa possível, mantendo-se em uma faixa que permita obter uma boa relação sinal-ruído.A concentração do corante SNAP deve ser otimizada para cada experimento de acordo com a linhagem celular e o tipo de corante usado. Embora seja possível que o SNAP-tag possa alterar a meia-vida das proteínas candidatas em alguns casos, não vemos evidências de tais efeitos, pois as meias-vidas determinadas do teste de proteínas candidatas aderem aos valores publicados correspondentes. Para descartar ainda mais um efeito do SNAP-tag na degradação da proteína, uma opção seria bloquear a síntese de proteínas com cicloheximida e realizar borrões no banheiro em diferentes momentos, usando um anticorpo que reconhece a proteína indígena.E para comparar diretamente o decaimento da proteína candidata SNAP-tag com a versão indígena não marcada.

single-cell-quantification-protein-degradation-rates-time-lapse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Célula única quantificação das taxas de degradação de proteínas por microscopia de fluorescência de lapso de tempo em cultura de células aderentes (Vídeo) | JoVE Journal

Célula única quantificação das taxas de degradação de proteínas por microscopia de fluorescência de lapso de tempo em cultura de células aderentes

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