Deteção e remoção de contaminação de Nuclease durante a purificação do protótipo recombinante vírus espumoso Integrase

O objetivo geral deste protocolo é identificar e remover a atividade de nucleases contaminantes durante a purificação de proteínas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da retrovirologia, como a bioquímica, a estrutura e a dinâmica da integração. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a identificação e a remoção da atividade de nucleases de DNA contaminantes de uma proteína recombinante de interesse durante o processo de purificação.

Comece descongelando um pellet de E. coli expressando integrase do vírus espumoso protótipo em gelo. Utilize um sonificador equipado com uma biohorn de diâmetro de 0,5 polegadas e uma microponta cônica de diâmetro de 0,125 polegadas para sonificar durante 30 segundos a 30% de amplitude com o tubo em gelo. Após a sonicação, transfira a amostra celular para um tubo de ultracentrífuga frio e gire a 120.000 vezes g por 60 minutos a quatro graus Celsius.

Após a centrifugação, deve haver um precipitado evidente, e o sobrenadante pode apresentar coloração amarelada. Transfira o sobrenadante para um tubo cônico de 50 mililitros gelado. Em seguida, prepare a coluna de FPLC com 110 milímetros de comprimento e 5 milímetros de diâmetro, contendo resina carregada com níquel de 1,5 mililitro.

Primeiro, conecte a coluna ao instrumento FPLC e aplique o tampão. O instrumento deve estar coletando dados em tempo real de condutividade e absorbância UV em 280 nanômetros. As leituras de condutividade e UV devem estabilizar.

Se necessário, continue a passar tampões pela coluna até que as leituras estejam estáveis. Usando um superloop, carregue a amostra proteica na coluna a uma taxa de fluxo de 0,15 mililitros por minuto com um limite máximo de pressão de 0,5 megapascal. Conecte o superloop ao FPLC AKTA.

Após lavar a coluna e eluir as proteínas, retire alíquotas de 15 microlitros do fluxo inicial, da lavagem e das frações com pico de absorbância a 280 nanômetros, e adicione 15 microlitros de tampão amostral SDS-PAGE 2X a cada amostra. Ferva as amostras por três minutos. Carregue 10 microlitros de cada amostra em géis de SDS-PAGE 10%, juntamente com quatro microlitros de padrões proteicos pré-marcados.

Inspecione visualmente o gel para identificar as frações que parecem conter integrase do vírus espumoso protótipo quase pura. Combine essas frações e anote o volume durante a pipetagem. Normalmente, são oito a dez mililitros.

Utilizando um espectrofotômetro, meça a absorbância UV em 280 nanômetros das frações combinadas e calcule a quantidade total da proteína integrase do vírus espumoso protótipo. Um rendimento típico é de cerca de 10 miligramas por litro de cultura induzida. Para remover a marcação de hexahistidina, suplemente a integrase do vírus espumoso protótipo com uma concentração final de 10-milimolar de DTT e 0,1-milimolar de EDTA.

Em seguida, adicione 15 microgramas da protease 3C do rinovírus humano por miligrama da integrase do vírus espumoso protótipo e incube a quatro graus Celsius durante a noite. Para realizar a fracionamento por cromatografia de afinidade com heparina da integrase do vírus espumoso protótipo, reduza a concentração de cloreto de sódio da amostra para 200 milimolares adicionando 1,5 volumes do tampão C. Em seguida, aplique a amostra diluída da integrase do vírus espumoso protótipo na coluna de Sepharose com heparina a uma taxa de fluxo de 0,5 mililitros por minuto com um limite máximo de pressão de um megapascal. Após lavar a coluna e coletar o gradiente e a lavagem final, analise o carregamento, o fluxo passante, a lavagem e as frações por SDS-PAGE a 8%.

Em seguida, avalie as frações corando o gel com azul de Coomassie. A integrase do vírus espumoso prototípico e a nuclease contaminante apresentam afinidades diferentes para a cromatografia em heparina Sepharose. Identifique as frações de heparina Sepharose que parecem conter integrase do vírus espumoso prototípico quase pura para utilização no ensaio de nuclease.

Para iniciar o ensaio de nucleases, combine três microlitros da fração de heparina e 50 nanogramas de DNA plasmidial superenrolado de três quilobases com tampão de reação até um volume final de 15 microlitros. Incube a 37 graus Celsius por 90 minutos. Interrompa a reação com Proteinase K a um miligrama por mililitro e SDS a 0,5%, e incube a 37 graus Celsius por uma hora.

Em seguida, adicione 3,5 microlitros de corante de carregamento 6X às reações do ensaio de nucleases e carregue todo o volume em um gel de agarose 1%. Execute o gel a 100 volts à temperatura ambiente por uma hora ou até que a frente do corante atinja o final do gel. Quando a eletroforese estiver concluída, uma imagem do gel obtida por scanner fluorescente deve mostrar que o DNA linear migra de acordo com o tamanho esperado em três kb, o DNA superenrolado migra mais rápido, em torno de dois kb, e o DNA em forma de círculo relaxado migra mais lentamente, próximo a 3,5 kb.

Utilizando um software de análise de imagens, calcule o volume em pixels das formas plasmidial superenrolada, linear e circular relaxada em cada poço. Denomine a soma dos volumes em pixels dessas três formas de DNA como valor total de DNA e utilize-o para calcular a porcentagem de formas lineares e circulares relaxadas. Frações que contêm nuclease contaminante exibem uma porcentagem maior de formas lineares e circulares relaxadas em comparação com o controle negativo.

Combine as frações de heparina Sepharose que não exibem atividade de nucleases contaminantes e transfira para tubos de diálise com corte de peso molecular de 10 milímetros, seis a oito quilodaltons. Realize a diálise a quatro graus Celsius durante a noite contra um litro de solução de diálise. No dia seguinte, recupere a amostra livre de nucleases do integrase do vírus espumoso protótipo do tubo de diálise.

Meça a absorbância em 280 nanômetros e calcule a concentração final da proteína. Aliquote a proteína e congele rapidamente em nitrogênio líquido. Em seguida, armazene os alíquotas a menos 80 graus Celsius.

O ensaio de nuclease foi realizado conforme descrito neste vídeo. Os controles negativos incluem DNA plasmidial sem proteína e uma purificação anterior da integrase selvagem do vírus fago prototípico, sabidamente livre de nuclease. Um controle positivo para atividade de nuclease contaminante é uma purificação anterior da integrase cataliticamente inativa do vírus fago prototípico, conhecida por conter nuclease contaminante.

Após este procedimento, outros métodos, como ensaios bioquímicos ou imagem de molécula única, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como cinética e dinâmica enzimática. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como identificar e remover atividade de nuclease contaminante de uma proteína recombinante.