Name: Deteção e remoção de contaminação de Nuclease durante a purificação do protótipo recombinante vírus espumoso Integrase (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Aprenda a purificar a integrase do vírus espumoso protótipo livre de nucleases usando cromatografia de afinidade com heparina e ensaios de detecção. Este método garante preparações puras para estudos bioquímicos de integração retroviral.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH AI099854 e AI126742 a chave.

1. induzir PFV em expressão em e. coli
<ol><li>
Adicionar 1 μL do plasmídeo de expressão IN PFV (10 ng/μL) de 20 μL de Escherichia coli BL21(DE3) pLysS (20 alíquota μL de células disponíveis comercialmente tem > 2 x 106 UFC/μg plasmídeo) em um tubo de 1,5 mL. Misture suavemente pelo dedo tocar ou passar rapidamente o tubo. Incubar em gelo 5 min.
	<ol>
<li>Aqueça o choque por exatamente 30 s em um 42 ˚ c banho de água e em seguida, retornar imediatamente para gelo por 2 min.</li>
		<li>Adicione 80 µ l de caldo super ideal de temperatura com meios de repressão (SOC) catabolite. Incube durante 1 h a 37 ˚ c com 225 rotações por minuto (rpm) a tremer.</li>
		<li>Placa 25 μL da mistura em uma 100 x 15 mm placa de Petri contendo 25 mL de ágar de caldo (LB) de Luria (ágar-ágar LB 1L: 10 g NaCl, extrato de levedura 5 g, 10 g bacto-triptona, ágar 15 g) e 100 μg/mL ampicilina (100 mg/mL de solução).</li>
		<li>Os restantes 75 μL das células transformadas em uma segunda placa idêntica da placa. Incubar as placas com as tampas para baixo durante a noite a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recuperar as placas de transformada Escherichia coli. Usar uma única colônia para inocular 3 mL de LB (L 1 LB: 10g de bacto-triptona, 10 g de NaCl, 5 g de fermento extrato) suplementado com 100 ampicilina μg/mL em um tubo de polipropileno cultura 14 mL de fundo redondo. Encube por ~ 8 h em 37 ˚ c com 225 rpm a tremer.
	<ol>
<li>Adicione a 3 mL de cultura a 50 mL LB suplementado com 100 μg/mL ampicilina e cloranfenicol 34 μg/mL (34 mg/mL de solução) em um Erlenmeyer de 250 mL. Incube a cultura durante a noite a 37 ° C, com 225 rpm a tremer.</li>
		<li>Transferi o 53 mL da cultura para L 1 LB, 100 μg/mL ampicilina e 34 cloranfenicol μg/mL em um frasco de Erlenmeyer de 4 L. Incube a 37 ° C, com 225 rpm a tremer.</li>
		<li>Medir a densidade óptica em 600 nm (OD600) da cultura periodicamente. Inicialmente, verifica a cultura OD600 cada h. Como a cultura atinge o desejado OD600, verificar a cada 15 min para não overgrow. Cresce a cultura para uma OD600 entre 0,9 e 1,0. Transferir o balão para um banho de gelo e agite para reduzir a temperatura da cultura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transferi 1 mL da cultura para um tubo de 1,5 mL para análise posterior por desnaturação análise de SDS-PAGE.
	<ol>
<li>Granule as células no tubo de 1,5 mL por centrifugação por 1 min em uma microcentrífuga a 14.000 x g, à temperatura ambiente. Desprezar o sobrenadante. Resuspenda o pellet em 150 μL tampão fosfato soro fisiológico (PBS), pipetando. O PBS pode ser com ou sem CaCl2 e MgCl2.</li>
		<li>Adicionar 150 μL de tampão de amostra SDS-PAGE de 2x (150 mM Tris-HCl, pH 6,8, SDS de 1,2%, 30% de glicerol, 15% de β-mercaptoetanol (βME), 0,0018% bromofenol) e misture bem por pipeta ou vórtice. Ferva por 3 min. loja a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicionar a cultura bacteriana: uma concentração final de 0,25 mM isopropil-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG, solução estoque de 0,25 M) e 50 μM ZnCl2 (solução de 50 milímetros). IPTG induz a expressão do gene PFV IN o promotor T7 e ZnCl2 é adicionado como um suplemento para o dobramento correto de um domínio do dedo de zinco terminal amino em PFV IN. Incubate a cultura, a 25 ° C com agitação imediatamente a 225 rpm para 4 h. transferi o balão para um banho de gelo. Salve 1 mL da cultura para análise de SDS-PAGE, seguindo o mesmo protocolo como acima no ponto 1.3.</li>
	<li>
Transferi a cultura bacteriana para garrafas de centrífuga de tamanho apropriado. Por exemplo, uma cultura de 1L pode ser transferida para quatro garrafas de polipropileno parte inferior cónica estéril descartável 250 mL. Gire as garrafas em uma centrífuga de mesa refrigerada a 3000 x g durante 20 minutos a 4 ˚ c. Descarte os sobrenadantes derramando.
	<ol>
<li>Todas as pelotas de uma cultura bacteriana de 1 L, em um volume total de 25 mL (6,25 mL / frasco) PBS frio (com ou sem CaCl2 e MgCl2) Ressuspender pipetando. Combinar e transferir as suspensões bacterianas para um tubo cónico de 50 mL. Girar numa centrifugadora refrigerada a 3.000 x g por 20 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante por derramar ou pipetagem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resuspenda o pellet bacteriano em 10 mL de tampão de ressuspensão (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM de NaCl e 500 inibidor da protease phenylmethylsulfanoxide (PMSF) μM) por pipetagem. Snap congelar a pelota, colocando o tubo em um frasco de Dewar com nitrogênio líquido suficiente para submergir o tubo de 50 mL. Cuidadosamente Retire o tubo do nitrogênio líquido e armazene a-80 ° C. Nota: Pelotas bacterianas podem ser armazenadas por vários meses a-80 ° C. Temos visto sem perda de proteína ativa após armazenamento-80 ° C durante dois anos.</li>
	<li>
Análise das amostras de pré- indução e pós-indução por 8,3 cm de largura, 7,3 cm de altura, 0,75 mm espessura SDS-PAGE géis com poliacrilamida 6% de 1,5 mL camada de empilhamento (125 mM Tris-HCl, pH 6,8, persulfato de amónio do acrilamido 6%, 0,1% SDS, 0,1%, 0.001% TEMED) e 3,5 mL 10% poliacrilamida resolvendo camada (375 mM Tris-HCl, pH 8.8, 10% do acrilamido, 0,1% SDS, 0,1% persulfato de amónio, 0,001% TEMED)12.
	<ol>
<li>Depois de derramar o gel de empilhamento, inserir um pente bem 10. Quando o gel tem polimerizado, montar o aparato da página e adicionar suficiente buffer corrente de SDS-PAGE (25 mM Tris, glicina 192mm, 0,1% SDS).</li>
		<li>Carrega 10 μL de cada amostra e 4 μL de padrões da proteína de prestained. Execute a 16.5 V/cm até a frente do corante atinge a parte inferior do gel, aproximadamente 60 min.</li>
		<li>Desmontar as placas de gel e gel de transferência para uma banheira de plástico. Adicione Coomassie brilhante azul coloração solução (0,1% R-250 azul brilhante de Coomassie, 40% de metanol, ácido acético a 10%) generosamente cobrir o gel e mancha por 20 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Remover a solução de coloração derramando e substituir com destain solução (40% de metanol, ácido acético a 10%) até bandas são facilmente visíveis. Remover a solução de descoloração derramando e substituir com água desionizada. PFV IN devem ser facilmente identificado na amostra pós-indução. PFV em com um tag de hexahistidine tem um peso molecular de 47374 Da.</li>
		<li>Se em PFV não estiver visível, repita a indução, começando com uma colônia diferente de uma das placas de transformação.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. níquel cromatografia de afinidade
<ol><li>Descongele uma pelota bacteriana no gelo. Nota: Isso levará um tempo significativo (aproximadamente 2-3h). Quando a pelota descongelou para uma suspensão de células, adicione um adicional de 500 μM PMSF (solução estoque de 100 mM).</li>
	<li>Mantenha o tubo de 50 mL de bactérias chorume no gelo. Proceda à sonicação as bactérias em amplitude de 30% para 30 s (1 s na, 1 s fora) por pelota derivada da cultura de 1 L, usando um sonicador com um chifre de bio 0,5 polegada de diâmetro com um diâmetro de 0,125 polegada afilado microtip, uma frequência de 20 kHz e potência máxima de 400 w.</li>
	<li>Transferi a amostra de células para um tubo frio se. Use o policarbonato garrafa assemblies (25 mm de diâmetro, altura de 89 mm) compatíveis com um rotor de ângulo fixo tipo 60 de Ti. Rotores e tubos alternativos podem ser utilizados se a mesma força de gravitação é alcançada. Girar a 120.000 x g, durante 60 min a 4 ° C. Deve haver um pellet óbvio. O sobrenadante pode ter uma cor amarela.</li>
	<li>Transferi o sobrenadante por derramar ou Pipetar para um tubo cônico de frio 50 mL. Nota o volume; Este volume deve ser aproximadamente o volume de ressuspensão buffer usado antes da congelação de snap. Se o sobrenadante é viscoso, podem estar contaminado por ADN bacteriano que pode obstruir a coluna de cromatografia. Neste caso, repita a ultracentrifugação para o DNA bacteriano de Pelotas.</li>
	<li>
Preparar 500 mL Buffer uma (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM de NaCl, 500 μM PMSF) e 500 mL Buffer B (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM de NaCl, 500 μM PMSF, imidazol 200 mM). Nota: No presente protocolo, manter o sistema de cromatografia líquida (FPLC) proteína rápida, todos os buffers e a amostra a 4 ° C, em uma sala fria.<ol>
<li>Buffers de filtro estéril A e B com 0,2 μm unidades de filtro descartável. Dependendo do sistema FPLC, lave bomba A e B de bomba com tampão A e B do Buffer, respectivamente. B de Buffer de fluxo 90% A de Buffer e 10% através do sistema até estabilizar a condutividade e leituras de UV. A taxa de fluxo máxima vai depender do instrumento; Use uma taxa de fluxo de 5 mL/min com um limite de pressão máxima de 1,0 MPa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar uma 110 mm, 5 mm diâmetro FPLC coluna com resina de níquel-cobrado 1,5 mL (capacidade de ligação máxima 50 mg/mL, máximo 1 MPa de pressão). A coluna pode ser preparada no dia antes da purificação e armazenada a 4 ˚ c.</li>
	<li>A coluna Conecte o instrumento FPLC. Equilibrar a coluna com 20 mL de 90% A de Buffer e 10% B Buffer (imidazol 20mm) a uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min, com um limite de pressão máxima de 0,5 MPa. O instrumento deve estar coletando dados em tempo real de condutividade e absorção UV em 280 nm (280). A condutividade e leituras de UV devem estabilizar. Se estas leituras não tem estabilizado, continue a buffers de fluxo através da coluna até que estejam estáveis.</li>
	<li>
Carrega a amostra de proteínas (~ 10 mL por pelota) para a coluna em uma taxa de fluxo de 0,15 mL/min, com um limite de pressão máxima de 0,5 MPa. A pressão de coluna e a taxa de fluxo permanece a mesma em toda a purificação. Colete o fluxo através de um tubo de 50 mL.
	<ol>
<li>Lavar a coluna com 20 mL de 90% A de Buffer e 10% Buffer B. coletar a lavagem em um tubo de 50 mL. Eluir as proteínas com um gradiente linear de 20 mL de 10% a 100% B Buffer (20 mM para imidazole 200 mM).</li>
		<li>Finalmente, lave a coluna com 5 mL 100% B Buffer (imidazol 200 mM). Recolher a lavagem final e gradiente em frações de 0,27 mL.
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aliam 15 μL de tampão de amostra SDS-PAGE 2 x 15 μL do fluxo através de lavagem e pico A280 fracções. Ferva as amostras por 3 min.
	<ol>
<li>Prepare dois 10% gel de SDS-PAGE, conforme descrito anteriormente na etapa 1.6 exceto com 15 pentes bem. Carrega 10 μL de cada amostra para os géis e 4 μL de padrões da proteína de prestained. Executar, manchar e analisar os geles, conforme descrito na etapa 1.6.</li>
		<li>Fracções de combinar que parecem conter quase puro PFV IN baseiam na inspeção visual. Medir o volume de pipetagem, normalmente de 8 a 10 mL.</li>
		<li>Usando um spectrophotometer, medir a um280 das frações combinadas e calcular a quantidade total de proteínas em PFV; nosso rendimento típico é ~ 10 mg / L de cultura induzida. O coeficiente de extinção da PFV IN com a tag hexahistidine é 59360 cm-1 M-1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para remover a marca de hexahistidine, suplemento PFV IN com 10 mM ditiotreitol (DTT, solução estoque de 1 M) e 0,1 mM EDTA, pH 8.0 (solução 0,5 M). Adicione 15 μg de protease de 3C rinovírus humano (VFC) por mg PFV IN. Incubate no 4 ˚ c durante a noite. Clivagem reduz o peso molecular PFV IN de 47374 para Da 44394 e pode ser verificada pela análise de SDS-PAGE 10%.</li>
</ol>3. cromatografia de afinidade heparina
<ol><li>
Preparar 250 mL Buffer C (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM DTT, 0,1 mM de EDTA e 500 μM PMSF) e 250 mL de tampão D (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 500 μM PMSF, 1 M NaCl). Nota: Este protocolo, o sistema FPLC, buffers e amostra são mantidos em uma sala fria no 4 ˚ c.<ol>
<li>Filtro estéril Buffers C e D com 0,2 μm unidades de filtro descartável. Dependendo do sistema FPLC, lave bomba A e B de bomba com Buffer C e D do Buffer, respectivamente. Fluxo de Buffer C 80% e 20% D reserva através do sistema até estabilizar a condutividade e leituras de UV. A taxa de fluxo máxima vai depender do instrumento; rotineiramente usamos uma taxa de fluxo de 5 mL/min, com um limite de pressão máxima de 1,0 MPa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Prepare uma 80 mm, 5 mm diâmetro FPLC de coluna com 1 mL de resina sepharose de heparina (máxima capacidade de ligação 2,0 mg de bovinos antitrombina III / mL da resina; 1,4 MPa de pressão máxima). A coluna pode ser preparada no dia antes da purificação e armazenada a 4 ° C. A coluna Conecte o instrumento FPLC.
	<ol>
<li>Equilibrar a coluna com 20 mL de tampão C de 80% e 20% D Buffer (200 mM NaCl) a uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min, com um limite de pressão máxima de 1 MPa. O instrumento deve estar coletando dados em tempo real de condutividade e absorção UV em 280 nm (280). A condutividade e leituras de UV devem estabilizar. Se estas leituras não tem estabilizado, continue a buffers de fluxo através da coluna até que estejam estáveis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reduzir a concentração de NaCl de amostra PFV em 200mm adicionando 1,5 volumes Buffer C. Por exemplo, adicionar 15 mL de tampão C para 10 mL PFV IN. Nosso volume total é tipicamente ~ 25 mL.</li>
	<li>
A amostra em PFV diluída à coluna de sepharose heparina em taxa de fluxo de 0,5 mL/min com pressão máxima de carga limite 1,0 MPa. A pressão de coluna e a taxa de fluxo permanece a mesma em toda a purificação. Colete o fluxo através de um tubo cónico de 50 mL.
	<ol>
<li>Lavar a coluna com 20 mL de tampão C de 80% e 20% D Buffer (200 mM NaCl), coletando a lavagem em um tubo cónico de 50 mL. Eluir a coluna com um gradiente linear de 30 mL de 20% a 100% D Buffer (200 mM a 1 M NaCl).</li>
		<li>Lave a coluna com 5 mL de 100% Buffer D. coletar o gradiente e lavagem final em frações de 0,37 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analisar o fluxo através de carga, lavagem e frações em 8% SDS-PAGE, conforme descrito em 2.9. PFV em clivagem da hexahistidine marca a seguir tem um peso molecular de 44394 Da e o coeficiente de extinção permanece 59360 cm-1 M-1 sem a marca de hexahistidine. Armazene todas as frações no 4 ˚ c até a conclusão de um ensaio de nuclease.</li>
</ol>4. ensaio de nuclease
<ol><li>
Identificar frações de sepharose heparina que parecem conter quase puro PFV pol. combinar 3 μL de fração de heparina e 50 ng de 3KB supercoiled Plasmídeo em reação buffer (10 mM HEPES, pH 7,5, 110 mM de NaCl, 5 mM de MgSO4, 4 μM ZnCl2 10 mM DTT) com um volume final de 15 µ l. Incubar a 37 ˚ c por 90 min. incluir um controle negativo com nenhum PFV IN.
	<ol>
<li>Parar a reação com 1 mg/mL da protease K (20 mg/mL de solução) e 0,5% SDS (solução a 10% das ações). Incube a 37 ° C por 1 h. amostras podem ser armazenadas a-20 ° C para posterior análise.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Prepare um gel de 125 mL de 1% peso por volume (p/v) de agarose em 1 x TAE buffer (40 mM Tris-Acetato, 1 mM EDTA) com 0,1 µ g/mL ethidium bromide (10 mg/mL de solução)13. Derreter a solução de agarose e despeje para uma bandeja de fundição de gel 15 cm x 10 cm. Inserir um pente bem 15 com ampla, poços de espessura 0,75 mm 5 mm. Poços finos rendem melhor resolução de banda, em comparação com poços de espessura de 1,5 mm. Permitir que o gel solidificar à temperatura ambiente.
	<ol>
<li>Imergir o gel em 1 x TAE com brometo de etídio 0,1 µ g/mL. Adicione 3,5 μL de 6 x Tintura (50% de glicerol, tintura de laranja G 0,15%) de carregamento para as reações de ensaio de nuclease. Carrega todo o volume para o gel. Funcione o gel em constante tensão, 10 volts por centímetro (100 V) à temperatura ambiente durante 1 h ou até a frente de corante laranja G chega ao fim do gel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
O gel de agarose imediatamente da imagem com um scanner fluorescente definido para detectar o brometo de etídio. DNA linear deve ser executado fiel tamanho em kb 3, DNA supercoiled deve correr mais rápido (~ 2 kb) e círculo relaxado DNA deve executar mais lento (~3.5 kb).
	<ol>
<li>Usando o software de análise de imagem, calcule o volume de pixel do plasmídeo círculo supercoiled, linear e relaxado em cada raia. Chame a soma do pixel volumes para estas três formas de DNA, o DNA"total" de valor e usá-lo para calcular a percentagem de círculos lineares e relaxados. Por exemplo, o volume de pixel de círculos relaxados é dividido pelo valor de pixel de DNA total na lane, multiplique esse número por 100, para determinar uma porcentagem. Frações que contêm contaminante nuclease exibem um percentual maior de círculos lineares e descontraídos, em comparação com o controle negativo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Combine a frações de sepharose heparina que não exibem atividade de nuclease contaminante. Urinar em 10 mm, 6-8 kDa peso molecular corte (MWCO) tubulação da diálise em 4 ° C durante a noite contra 1 L de 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl, 50 μM ZnCl2, 10 mM DTT, 20% de glicerol.</li>
	<li>Recupere a amostra PFV IN livre de nuclease da tubulação da diálise. Medir a um280 e calcular a concentração de proteína final. Alíquota e snap freeze em nitrogênio líquido. Alíquotas de loja a-80 ° C.</li>
</ol>

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<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Proteínas recombinantes que interagem com o DNA, tais como proteínas, catadores de oxigênio para aplicações de microscopia única molécula ou integrases retroviral, de reparação do DNA devem ser livres de contaminação bacteriana nucleases2,3. Estes contaminantes podem confundir a interpretação dos resultados durante os ensaios bioquímicos ou única molécula de granel.
Achamos que uma nuclease bacteriana frequentemente co purifica com PFV...

Estudos bioquímicos e única molécula de interações da proteína com DNA requerem proteínas recombinantes excepcionalmente puras. Contaminar as nucleases de bactérias pode obscurecer os resultados desses ensaios. Um contaminante nuclease foi encontrado em preparações à base de proteínas recombinantes oxigênio ao tesouro protocatechuate-3,4-dioxigenase (PCD) e protótipo vírus espumoso (PFV) integrase (IN) isolados de Escherichia coli (e. coli)1 , 2 , 3.
Ensaios de integração retroviral dependem a conversão de DNA supercoiled produtos entalhadas ou lineares como uma medida da atividade4. Durante a infecção celular IN junta-se as duas extremidades do cDNA viral para o anfitrião cromatina5. Cada participante se juntar a reação é denominado transferência de vertente. Ensaios de recombinação na atividade posso juntar dois oligómeros de DNA imitar o cDNA viral termina para um destino de DNA em uma integração concertada reação4,5,6,7,8. Alternativamente IN recombinante pode aderir apenas um final de DNA em um site não-fisiologicamente relevante metade integração reação9,10. Quando supercoiled Plasmídeo é alvo de integração, integração concertada produtos são linearizadas DNA e produtos de integração local metade são círculos relaxados. Estes produtos de reação são identificados por sua mobilidade relativa durante de eletroforese de gel de agarose1. Se o recombinante em tem uma contaminante nuclease, haverá círculos relaxados espúrios ou um plasmídeo linear possivelmente confundir os resultados experimentais. Oligómeros de DNA virais podem ser rotulados fluorescente para identificar conclusivamente produtos de integração, ao contrário de produtos da nuclease. No entanto, em muito favorece supercoiled alvos do DNA; qualquer perda do plasmídeo supercoiled círculos relaxados ou DNA linear por nucleases contaminantes poderia distorcer os resultados e interpretação de dados11. Assim, é imperativo para remover bacterianas nucleases de retroviral em preparações.
PFV em tem uma diferente afinidade para heparina sepharose comparado ao de nuclease bacteriana1. PFV IN e a nuclease podem estar separadas por uma eluição gradiente linear de heparina-sepharose. A nuclease não é facilmente detectado por uma absorvância (UV) ultravioleta no pico de nm 280 ou por eletroforese em gel de poliacrilamida analítica de sódio Dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). Em vez disso, a nuclease é detectado por um ensaio de atividade nuclease empregando a conversão de um plasmídeo supercoiled círculos relaxados ou produtos lineares. Cada fração após cromatografia de sepharose heparina é testada para a atividade de nuclease. PFV IN e a contaminação de nuclease não tem nenhuma diferença na afinidade para resina de ânion Mono-Q. Há uma pequena diferença na afinidade para resina de cátion Mono-S. No entanto, a resolução de Mono-S de nuclease bacteriana e em PFV não permitiria eficiente separação das proteínas. Em última análise, purificação da afinidade de sepharose heparina oferece a melhor separação de nuclease bacteriana de PFV IN... e tem a vantagem do volume de carga ilimitada.
Teste para contaminar a atividade de nuclease pode ser adaptada a outras proteínas. A proteína de interesse provavelmente terá características de afinidade alternativos que PFV IN; a diferença de vinculação características da proteína de interesse e a contaminação de nuclease deve ser determinada empiricamente. Esta metodologia para identificar contaminação nuclease pode ser adaptada para outras resinas incluindo cátion Mono-S ou resinas de troca de ânion Mono-Q. Afinidade e troca iônica resinas podem oferecer um método confiável para isolar uma proteína recombinante do interesse de contaminar nucleases sem limites no volume de proteína durante a cromatografia.

<table><tbody><tr><td>BL21/DE3 Rosetta E. coli</td><td>EMD Millipore</td><td>70956-4</td><td></td></tr><tr><td>LB caldo</td><td>EMD biosciences</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Amresco</td><td>0339</td><td></td></tr><tr><td>Cloranfenicol&nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0230</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>IPTG&nbsp;</td><td>Denville Scientific</td><td>CI8280</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086</td><td></td></tr><tr><td>Tris Ultra Pure</td><td>Gojira Fine Chemicals</td><td>UTS1003</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>P212121</td><td>RP-S23020</td><td></td></tr><tr><td>PMSF&nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0754</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0250</td><td></td></tr><tr><td>DTT&nbsp;</td><td>P212121</td><td>SV-DTT</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Amresco</td><td>0662</td><td></td></tr><tr><td>Agarose&nbsp;</td><td>Denville Scientific</td><td>CA3510</td><td></td></tr><tr><td>Brometo de Etídio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1302</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G37-20</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Superflow</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td></td></tr><tr><td>Heparina Sepharose 6</td> Fast <td>Flow GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0998-01</td><td></td></tr><tr><td>HRV14 3C protease&nbsp;</td><td>Produtos Químicos EMD</td><td>71493-3</td><td></td></tr></tbody></table>

deteção e remoção de contaminação de nuclease durante a purificação do protótipo recombinante vírus espumoso integrase

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

A proteína integrase (IN) do vírus espumoso da retrovírus protótipo (PFV) é uma enzima de modelo para o estudo do mecanismo de integração retroviral. Comparado a pol de outros retrovírus, PFV IN é mais solúvel e mais receptivos a manipulação experimental. Além disso, é sensível a inibidores de IN clinicamente relevantes vírus de imunodeficiência humana (HIV-1), sugerindo que o mecanismo catalítico da PFV IN é semelhante do HIV-1 IN. IN catalisa juntarem covalente viral DNA complementar (cDNA) para o alvo DNA em um processo chamado transferência de vertente. Esta reação de transferência de vertente apresenta cortes de ADN do alvo. Análise dos produtos de reacção de integração pode ser confundida pela presença de nucleases que nick da mesma forma o DNA. Uma nuclease bacteriana foi mostrado para purificar co com PFV recombinante expressa em Escherichia coli (e. coli). Aqui nós descrevemos um método para isolar PFV IN das nucleases contaminantes por cromatografia de afinidade de heparina. Frações são facilmente rastreadas por contaminação de nuclease com um plasmídeo supercoiled e eletroforese em gel de agarose. PFV IN e o contaminante nuclease exibem afinidades alternativas para heparina sepharose permitindo uma preparação livre de nuclease da recombinação PFV IN adequado para análise de bioquímica ou única molécula em massa de integração.

Recombinante PFV em muitas vezes está contaminado com uma nuclease bacteriana1. Ensaios bioquímicos integração dependem a quantificação da conversão do plasmídeo supercoiled DNA para círculos relaxados e produtos lineares. A presença de uma contaminante nuclease poderia levar a quantificação espúria destes ensaios. Expressão da PFV IN com um tag de hexahistidine é induzida em e. coli (Figura 1) e primeiro purificado por cromatografia de afinidade de níquel (<...

Proteína de integrase espumosa vírus recombinante protótipo é frequentemente contaminada com uma nuclease bacteriana durante a purificação. Este método identifica a contaminação da nuclease e remove-lo a preparação final da enzima.

Deteção e remoção de contaminação de Nuclease durante a purificação do protótipo recombinante vírus espumoso Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

O objetivo geral deste protocolo é identificar e remover a atividade de nucleases contaminantes durante a purificação de proteínas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da retrovirologia, como a bioquímica, a estrutura e a dinâmica da integração. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a identificação e a remoção da atividade de nucleases de DNA contaminantes de uma proteína recombinante de interesse durante o processo de purificação.Comece descongelando um pellet de E. coli expressando integrase do vírus espumoso protótipo em gelo. Utilize um sonificador equipado com uma biohorn de diâmetro de 0,5 polegadas e uma microponta cônica de diâmetro de 0,125 polegadas para sonificar durante 30 segundos a 30% de amplitude com o tubo em gelo. Após a sonicação, transfira a amostra celular para um tubo de ultracentrífuga frio e gire a 120.000 vezes g por 60 minutos a quatro graus Celsius.Após a centrifugação, deve haver um precipitado evidente, e o sobrenadante pode apresentar coloração amarelada. Transfira o sobrenadante para um tubo cônico de 50 mililitros gelado. Em seguida, prepare a coluna de FPLC com 110 milímetros de comprimento e 5 milímetro

detection-removal-nuclease-contamination-during-purification

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

O genoma do vírus influenza A é composto por oito complexos separada de RNA e proteínas, denominadas complexos de ribonucleoproteínas viral (vRNPs). Este artigo descreve a purificação gradiente glicerol e transmissão de visualização microscopia eletrônica de influenza A vRNPs.

Purificação e Visualização de Influenza A complexos de ribonucleoproteínas Viral

Fonte: Mackler, R. M., et al. Montagem e Purificação de Intassomos de Vírus Foamy Protótipos. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo demonstra a purificação de intassomos do vírus da foamy protótipo (PFV) a partir de uma suspensão mista de proteína-DNA utilizando extração com sal e cromatografia de exclusão por tamanho, obtendo complexos ativos para análises posteriores.

Purificação de Intassomos do Vírus Espumoso Protótipo por Cromatografia de Exclusão Molecular

Fonte: Lopez Jr., M. A., et al. Detecção e Remoção de Contaminação por Nucleases Durante a Purificação da Integrase do Vírus Espumoso Protótipo Recombinante. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra a purificação da integrase viral com marcação de polihistidina utilizando cromatografia de afinidade por níquel. O protocolo utiliza eluição com gradiente de imidazol para isolar seletivamente a integrase com base em sua afinidade pela resina carregada com níquel.

Purificação de Integrase Viral Utilizando Cromatografia de Afinidade

Fonte: Lopez Jr., M. et al. Detecção e Remoção de Contaminação por Nucleases Durante a Purificação da Integrase Protótipo Recombinante do Vírus Espumoso. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra o procedimento para purificar a integrase viral a partir de contaminação por nuclease bacteriana utilizando cromatografia em coluna de heparina Sepharose seguida de análise por SDS-PAGE para confirmar a pureza da proteína.

Purificação de Integrase Viral Utilizando Cromatografia de Afinidade por Heparina

Fonte: Gao, Y., et al. Geração e Montagem de Nucleocapsídeos Específicos do Vírus do Vírus Sincicial Respiratório. J. Vis. Exp. (2021)O vídeo demonstra a montagem in vitro de nucleocapsídeos específicos do vírus a partir de um complexo purificado de nucleoproteína–fosfoproteína livre de RNA, sua purificação por cromatografia de exclusão por tamanho e a validação do RNA viral de comprimento completo dentro das partículas montadas.

Reconstituição In Vitro e Purificação de Partículas Semelhantes ao Nucleocapsídeo Viral

Descrevemos um protocolo para amplificar locais de integração retroviral a partir do DNA genômico de células infectadas, sequenciando as junções amplificadas vírus-hospedeiro e, em seguida, mapeando essas sequências para um genoma de referência. Também descrevemos técnicas para quantificar a distribuição de locais de integração em relação a várias anotações genômicas usando BEDTools.

Amplificação, sequenciamento de próxima geração, e Genomic DNA Mapeamento das retrovirais Integração Sites

Integrase retroviral recombinante e oligómeros de DNA imitando extremidades de DNA virais podem formar um complexo enzimaticamente ativo conhecido como um intasome. Intasomes pode ser utilizado para estudos bioquímicos, estruturais e cinéticos. Este protocolo fornece detalhes sobre como montar e purificar o protótipo vírus espumoso intasomes.

Montagem e purificação do protótipo vírus espumoso Intasomes

Descrevemos aqui a in vitro geração de HBV DNA através de um sistema de infecção de vírus de hepatite B e a detecção altamente sensível de sua integração (1 – 2 cópias) usando o inverso nested PCR.

Deteção de cópia baixa número de DNA Viral integrado formado por In Vitro infecção de hepatite B

O vírus adenoassociado recombinante (rAAV) é amplamente utilizado para liberação clínica e pré-clínica de genes. Um uso subestimado para rAAVs é a transdução robusta de células cultivadas sem a necessidade de purificação. Para pesquisadores iniciantes no rAAV, fornecemos um protocolo para clonagem de transgênico, produção bruta de vetores e transdução de cultura celular.

Expressão de Transgenes em Células Cultivadas Usando Vetores Virais Adenoassociados Recombinantes Não Purificados

Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para a geração e purificação de vetores virais adeno-associados usando um método otimizado de cromatografia de afinidade à base de heparina. Apresenta uma abordagem simples, escalável e econômica, eliminando a necessidade de ultracentrifugação. Os vetores resultantes exibem alta pureza e atividade biológica, comprovando seu valor em estudos pré-clínicos.

Isolamento de vetores virais adeno-associados por meio de um protocolo de cromatografia de afinidade de heparina de etapa única e semiautomatizada

A mutagênese insercional é uma ferramenta essencial na genética direta para identificar elementos genômicos funcionais. Aqui, descrevemos a Tela baseada em inserção para elementos funcionais e transcritos (InSET), um método para detectar locais de integração de lentivírus dentro de uma biblioteca de células de mutagênese de inserção baseada em lentivírus.

Identificação de locais de integração de lentivírus funcionalmente relevantes em uma biblioteca de células de mutagênese insercional

Aprenda a purificar a integrase do vírus espumoso protótipo livre de nucleases usando cromatografia de afinidade com heparina e ensaios de detecção. Este método garante preparações puras para estudos bioquímicos de integração retroviral.

Deteção e remoção de contaminação de Nuclease durante a purificação do protótipo recombinante vírus espumoso Integrase

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