Constitutivos e Inducible sistemas para modificação genética In Vivo dos hepatócitos de rato usando injeção de veia de cauda hidrodinâmica

O objetivo geral deste método é a transfecção estável de hepatócitos in vivo, com construções vetoriais para expressão gênica ou shRNA induzível. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da pesquisa do fígado. Por exemplo, pode ser aplicado para investigar mecanismos no câncer de fígado e regeneração.

A principal vantagem desta técnica é a expressão combinada de CreER juntamente com a expressão de um transgene induzível R shRNA em hepatócitos de camundongos in vivo obtida por injeção hidrodinâmica na veia da cauda. Demonstrando o procedimento estará Eric Hubner, um estudante de medicina de nosso laboratório. Comece combinando 150 nanogramas de vetor de entrada contendo o RNA de grampo curto para a proteína alvo com 150 nanogramas de vetor pTC Tet e tampão TE para um volume total de oito microlitros.

Em seguida, transfira a mistura de enzimas LR clonase II para o gelo e incube por dois minutos. Vórtice duas vezes durante a incubação. Em seguida, adicione dois microlitros de mistura de enzimas LR clonase II à reação e incube a 25 graus Celsius por uma hora.

Após a incubação, interrompa a reação adicionando um microlitro de solução de proteinase K. Em seguida, incube a 37 graus Celsius por dez minutos. Em seguida, transforme as bactérias competentes Stbl3 com dois microlitros de mistura de clonagem usando um protocolo padrão de choque térmico.

Após a transformação em placas de ágar contendo ampicilina, incubar a 30 graus Celsius por 24 horas. No dia seguinte, escolha colônias individuais e inocule pequenos volumes de meio de crescimento bacteriano para incubação durante a noite. Depois de isolar o DNA e confirmar a integridade do vetor por sequenciamento de Sanger, prepare preparações de DNA em escala máxima da construção para injeção.

Comece pesando os ratos. Em seguida, prepare uma solução salina estéril contendo 15 microgramas por mililitro de construção do vetor da Bela Adormecida livre de endotoxinas e um micrograma por mililitro de pchsB5 livre de endotoxinas. Prepare solução suficiente para injetar em cada camundongo um volume que seja 10% do seu peso corporal.

Encha uma seringa estéril de 3 mililitros com o volume necessário para um camundongo e coloque uma agulha de calibre 27. Depois de adicionar uma quantidade adequada de papel de seda para deixar espaço mínimo para movimento, mas espaço suficiente para respirar, insira o mouse em um limitador apropriado com orifícios de respiração. Aqueça a cauda usando uma lâmpada infravermelha por 30 a 60 segundos enquanto observa cuidadosamente os sinais de superaquecimento, como movimento rápido da cauda ou outros sinais de agitação.

Em seguida, limpe a cauda com um cotonete embebido em álcool. Insira a agulha quase horizontalmente em uma das duas veias laterais da cauda próximas à base da cauda. Se colocado com sucesso, uma pequena quantidade de sangue pode fluir de volta para o cone da agulha.

Injete o volume total na veia da cauda em oito a dez segundos. Após a injeção, remova imediatamente o mouse do limitador. Comprima a ferida injetável com gaze estéril por pelo menos 30 segundos ou até que o sangramento desapareça.

A injeção hidrodinâmica bem-sucedida da veia da cauda é crucial para a transfecção e depende especialmente da velocidade, volume e tempo de injeção. Para facilitar a injeção intravenosa, certifique-se de que os camundongos não estejam estressados ou desidratados no dia da injeção. Após 30 a 60 minutos de alojamento solo em uma gaiola de recuperação, transfira o mouse de volta para sua gaiola original.

Inicie a indução de Cre recombinase 10 a 15 dias após a injeção na veia da cauda para permitir a depuração de vetores não integrados. Dissolva dez miligramas de tamoxifeno em 40 microlitros de etanol e incube a 55 graus Celsius por dez minutos com agitação. Vortex várias vezes até que o tamoxifeno se dissolva.

Em seguida, adicione 960 microlitros de óleo de milho e incube por cinco minutos a 55 graus Celsius. Após o resfriamento, coloque a solução em uma seringa de insulina de 1 mililitro com uma agulha de calibre 20. Em seguida, mude para uma agulha de calibre 27.

Para injetar, primeiro empurre o mouse agarrando o pescoço do mouse cuidadosamente com o polegar e o segundo dedo, fixando a cauda entre a base da mão e o quarto e quinto dedo. Em seguida, injete intraperitonealmente 0,1 mililitros da solução no quadrante inferior esquerdo do abdômen. Para experimentos de menos de dez dias, administre continuamente doxiciclina através da água potável usando o seguinte protocolo.

Primeiro, dissolva cinco gramas de sacarose em 100 mililitros de água da torneira e autoclave. Em seguida, dissolva 100 miligramas de hiclato de doxiciclina em cinco mililitros da solução de sacarose em um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, use uma seringa de 10 mililitros para filtrar a solução estéril através de um filtro de 0,2 mícron.

Em seguida, adicione a solução de doxiciclina filtrada aos 95 mililitros restantes de solução de sacarose e forneça a solução ao camundongo em vez de beber água. Verifique diariamente e substitua imediatamente se a solução ficar turva, pois isso indica crescimento excessivo de bactérias. Prepare uma seringa de 1 mililitro com uma agulha de calibre 27 com um mililitro de solução de paraformaldeído a 4%.

Use tesouras de dissecação e pinças anatômicas para realizar uma laparotomia mediana e expor o fígado do camundongo sacrificado. Mova o intestino delgado para a direita para expor a veia porta e a veia cava inferior. Insira a agulha da seringa preparada na veia cava inferior e corte a veia porta.

Injete um mililitro de PFA lentamente para profundir o tecido hepático e remover os glóbulos vermelhos autofluorescentes. Após remover o fígado, lave-o em água e transfira para cinco a dez mililitros de solução de PFA a 4% para pós-fixação antes do corte. A injeção de uma construção de transposon que combina a expressão constitutiva de uma Cre recombinase induzível com a expressão induzível de um transgene ou um shRNA de escolha em camundongos repórter Cre mostrou expressão robusta do gene repórter GFP após a ativação da Cre recombinase pelo tamoxifeno.

Após o tratamento com doxiciclina, a expressão de transgenes induzíveis pode ser visualizada por anticorpos adequados em hepatócitos transfectados. Para a expressão de shRNA induzível, a expressão citoplasmática de GFP detectada por imunocoloração pode ser usada como um marcador substituto para a expressão de shRNA. Uma construção de transposon contendo um de expressão de luciferase sob o controle de uma construção promotora específica do fígado foi injetada.

Após a injeção com luciferina, os camundongos foram fotografados usando um sistema de imagem in vivo duas semanas após a injeção hidrodinâmica da veia da cauda. A imagem mostrou bioluminescência de luciferase robusta e estável no fígado 15 dias após a injeção, demonstrando que o sistema pode ser usado com sucesso para acompanhar a presença de células transfectadas in vivo por imagens de bioluminescência. Uma vez dominadas, as injeções hidrodinâmicas de veias da cauda podem ser realizadas em cerca de 15 minutos, enquanto todo o procedimento, desde a clonagem de nossa injeção de camundongos, indução da expressão do transgene R shRNA até a preparação do fígado, levará cerca de três a quatro semanas.

Ao tentar este procedimento, é importante manter o tamanho e a integridade da sequência dos plasmídeos em mente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como aplicar o sistema pTC Tet com seu transgene R shRNA de escolha a qualquer modelo de camundongo Crelux Pbase.