Name: Constitutivos e Inducible sistemas para modificação genética In Vivo dos hepatócitos de rato usando injeção de veia de cauda hidrodinâmica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Aprenda a transfecção estável de hepatócitos murinos in vivo usando injeção hidrodinâmica de veia caudal com vetores de transposon. Este método permite expressão induzível de transgenes e shRNA para pesquisa em câncer hepático e regeneração.

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Este trabalho foi apoiado pela Deutsche Krebshilfe, Alemanha (número de concessão 111289 a UE), a Lucile Packard Foundation para a saúde das crianças (Ernest e Amelia Gallo dotado Postdoctoral Fellowship - número de concessão CTSA UL1 RR025744 a UE). Agradecemos o Dr Mark A. Kay para construções de vetor e suporte experimental conselhos e Dr Julien Sage para ratos e experimental.

Todas as experiências em animais foram realizadas de acordo com as orientações para o cuidado e o uso de animais de laboratório e foram aprovadas pelas autoridades responsáveis (Regierung von Oberbayern, Munique, Alemanha e Stanford cuidados institucionais do Animal e usar Comité, Stanford, CA, EUA). Uma lista de todos os plasmídeos de clonagem (passo 1 a 4) é fornecida na tabela complementar S1.
1. a clonagem de um Transgene para expressão gênica constitutiva
<ol><li>Desenho de primers para amplificação de transgene13,14.</li>
	<li>Adicione restrição sites para PacI (TTAATTAA) à extremidade 5' do primer para a frente. Adicione sites de restrição para AscI (GGCGCGCC) ou FseI (GGCCGGCC) à extremidade 5' do primer reverso.</li>
	<li>Amplifica o transgene por PCR usando condições otimizadas para o transgene desejado14. Purifica usando um kit de purificação de DNA disponível comercialmente. Nota: Tempo de recozimento depende os primers desenhados na etapa 1.1., tempo de alongamento depende do comprimento da construção. Por exemplo, para uma construção de 1.000 bp comprimento uso 60 s de tempo de alongamento.</li>
	<li>Digerir o transgene e vector de expressão de gene constitutivo15 com nucleases de restrição respectiva (consulte a etapa 1.2) e buffer em um volume total de 50 µ l a 37 ° C durante a noite. Por exemplo, digerir construção com 5 unidades PacI e 5 unidades FseI se apropriado (consulte a etapa 1.2).</li>
	<li>Gel de purificar vetor digerido e insert usando um kit de extração do gel de comerciais de acordo com as instruções do fabricante. Execute uma ligadura padrão de 100 ng do vetor e 100 – 1.000 ng de insert usando 400 U T4 ligase a 14 ° C, durante 16 h. calor inativar a 65 ° C por 10 min.</li>
	<li>Transforme bactérias competentes, usando um padrão de calor-choque-protocolo16.</li>
	<li>Placa de ágar placas contendo ampicilina de 100 µ g/mL. Incube a 30 ° C por 24 h.</li>
	<li>Escolha única colônias, purificar DNA do plasmídeo usando um kit miniprep comercial de acordo com as instruções do fabricante e verificar a sequência de sequenciamento Sanger17 (cartilha de sequenciamento: 5' TGCTGGAGTTCTTCGCC 3').</li>
	<li>Use positivo colônias para maxi escala de amplificação do ADN do plasmídeo e purificam usando um kit preparação livre de endotoxinas plasmídeo18 de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Construção está pronta para a injeção, assim, continue com o passo 5.</li>
</ol>2. clonagem de um Transgene para expressão gênica Inducible
<ol><li>Desenho de primers para amplificação de transgene13,14.</li>
	<li>Adicione sites de restrição para SacI (GAGCTC), SpeI (ACTAGT) ou KpnI (GGTACC) à extremidade 5' do primer para a frente. Adicione sites de restrição para NotI (GCGGCCGC) ou XhoI (CTCGAG) à extremidade 5' do primer reverso.</li>
	<li>Amplifica o transgene por PCR usando condições otimizadas para o transgene desejado14. Purifica a utilização de um kit de purificação de DNA comercial.</li>
	<li>Digerir o transgene purificado e 4 µ g do vetor de entrada (pEN_TTmcs-vetor, consulte Tabela de materiais)19 separadamente com nucleases de restrição apropriada (consulte a etapa 2.2) e buffer em um volume total de 50 µ l a 37 ° C durante a noite.</li>
	<li>Gel de purificar vetor digerido e insert usando um kit de extração do gel de comerciais de acordo com as instruções do fabricante. Realize a Ligadura padrão com 100 ng do vetor e 100 – 1.000 ng de insert usando 400 U T4 ligase a 14 ° C, durante 16 h. calor inativar a 65 ° C por 10 min.</li>
	<li>Transforme bactérias competentes, usando um padrão de calor-choque-protocolo16.</li>
	<li>Placa de ágar placas contendo gentamicina 15 µ g/mL. Incube a 37 ° C, durante 16 h.</li>
	<li>Escolha única colônias, purificar o Plasmídeo e verificar inserir por sequenciamento17 usando o primer frente pCEP: 5' AGAGCTCGTTTAGTGAACCG 3'. Nota: PCR em colônias simples pode ser realizada sem prévia purificação com pCEP primers para a frente e pCEP reversa (5' AGA AAG CTG GGT CTA GAT ATC TCG 3'). Esta etapa pode útil para pré-selecção das colônias positivas.</li>
	<li>Prossiga para a etapa 4.</li>
</ol>3. clonagem de um miR-shRNA para Inducible Gene Knock-down
<ol><li>Projeto miR-shRNA oligonucleotides de acordo com o pSLIK protocolo19de clonagem. Recoze e purificar oligonucleotides e diluir 01:20 em ddH2O.</li>
	<li>Digest 3 µ g do vetor de entrada com 5 U BfuAI, a 50 ° C por 3 h, então inativar a reação a 65 ° C por 20 min. Nota: Se for desejado co expressão da proteína verde fluorescente (GFP), uso pEN_TTGmiRc19 como um vetor de entrada, caso contrário use pEN_TTmiRc219.</li>
	<li>Gel de purificar vetor digerido como na etapa 2.5. Realizar a Ligadura padrão de 100 ng do vetor e 1 µ l de purificado e diluído oligonucleotides shRNA (passo 3.1) usando 400 U T4 ligase em temperatura ambiente por 1 h. calor inativar a 65 ° C por 10 min.</li>
	<li>Transforme bactérias competentes, usando um padrão de calor-choque-protocolo16.</li>
	<li>Placa de ágar placas contendo gentamicina 15 µ g/mL. Incube a 37 ° C, durante 16 h.</li>
	<li>Escolher o única colônias, purificar o Plasmídeo e verificar inserir por Sanger sequenciamento17 (cartilha de sequenciamento: 5' TAGTCGACTAGGGATAACAG 3').</li>
	<li>Prossiga para a etapa 4.</li>
</ol>4. recombinational clonagem para gerar Clones pronto-para-injeção
<ol><li>Mix 150 ng do vetor de entrada (da etapa 2 ou etapa 3) e 150 ng do pTC TET-vetor20.</li>
	<li>Adicionar um volume total de 8 µ l tampão TE (pH = 8).</li>
	<li>Transfira a mistura de enzima LR-clonase II (ver Tabela de materiais) para gelo, incubar por 2 min. Vortex duas vezes.</li>
	<li>Adicionar 2 µ l do mix de enzima LR-clonase II para a reação e incubar a 25 ° C, durante 1 h.</li>
	<li>Pare a reação adicionando 1 µ l de Proteinase K-solução. Incube a 37 ° C por 10 min.</li>
	<li>Transforme Stbl3 bactérias competentes com 2 µ l de clonagem recombinational misturam usando um padrão de calor-choque-protocolo16.</li>
	<li>Placa de ágar placas contendo ampicilina de 100 µ g/mL. Incube a 30 ° C por 24 h.</li>
	<li>Escolher o única colônias, purificar DNA do plasmídeo usando um kit preparação livre de endotoxinas plasmídeo18 de acordo com as instruções do fabricante e confirmar a integridade do vetor por Sanger sequenciamento17 (cartilha de sequenciamento 5' AGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGG 3').</li>
	<li>Construção está pronta para a injeção, continue com o passo 5.</li>
</ol>5. preparar solução injectável de veia de cauda hidrodinâmica
Nota: Preparação das construções para a expressão do gene constitutivo e inducible são descritas na etapa 1, 2, 3 e 4.
<ol><li>Preparar a solução salina 0,9% estéril para injeção (que não uso PBS). Use o volume correspondente a cerca de 10% do peso do corpo do mouse. Exemplo: para um mouse com 20 g, prepare-se 2 mL de solução.</li>
	<li>Prepare os vetores de injeção que foram purificados usando um plasmídeo livre de endotoxinas purificação kit18 (ver passo 1.8 ou 4.8, respectivamente).</li>
	<li>Adicionar 10 µ g ou 15 µ g de construção de vetor livre de endotoxinas a bela adormecida (do passo 1 uso 10 µ g, da etapa 4 µ 15 g uso, respectivamente) e 1 µ g de endotoxinas-free pc-HSB521 / mL de solução salina estéril.</li>
	<li>Solução de armazenamento para até 4 h a 4 ° C. Não congele.</li>
</ol>6. realizar a injeção de veia de cauda hidrodinâmica
<ol><li>Use uma retenção para injeção de veia de cauda (comercial ou preparada de um tubo cónico de 50 mL com furos para respirar e para a cauda). Preencha o fundo do tubo com papel absorvente.</li>
	<li>Para a injeção, use ratos de cerca de 8-10 semanas de idade com pesos de 20 – 25 g.</li>
	<li>Pesar os ratos antes da injeção e prepare-se volume de injeção de acordo com o peso corporal (correspondentes a 10% do peso corporal, consulte a etapa 5.1). Prepare um estéril 3 mL-seringa com uma agulha G 27 para injeção e encha-a com o volume necessário.</li>
	<li>Coloque o mouse a retenção. Ajustar a quantidade de papel tissue (consulte a etapa 6.1) para deixar um espaço mínimo para o movimento mas espaço suficiente para respirar.</li>
	<li>Certifique-se de que o rato está respirando regularmente.</li>
	<li>Quente a cauda usando uma lâmpada infravermelha para 30-60 s. cuidadosamente atenção aos sinais de superaquecimento.</li>
	<li>Limpe o rabo com um algodão embebido em álcool.</li>
	<li>Inserir a agulha quase horizontalmente em qualquer um das duas veias laterais da cauda perto da base da cauda. Nota: Se for colocado com êxito, uma pequena quantidade de sangue pode fluir de volta ao cone da agulha. Não é recomendável para aspirar ativamente como qualquer movimento adicional da agulha pode resultar em seu deslocamento e/ou lesão da veia.</li>
	<li>Injete o volume total da veia da cauda dentro de 8-10 s.</li>
	<li>Imediatamente, remova o mouse a retenção. Comprimir a injeção ferida pelo menos 30 s ou até algum sangramento diminui.</li>
	<li>Coloque o mouse em uma gaiola separada. Uma vez que o mouse se recuperou do procedimento (cerca de 30 a 60 min), transferi o mouse volta para sua gaiola original. Checar o mouse regularmente para as próximas 24 horas. Nota: A sedação leve do mouse é observada rotineiramente para até 2 h após a injeção.</li>
	<li>Antes de prosseguir com mais experiências (ou seja, passo 7), espere 10 a 15 dias para habilitação de vetores não-integrados.</li>
</ol>7. indução de CreER Transfectada com tamoxifeno
Atenção: O tamoxifeno é prejudicial, pode ser canceroso ou danificar a fertilidade. Por favor, consulte a ficha de dados de segurança.
<ol><li>Plano de injeções intraperitoneal tamoxifeno em três dias consecutivos.</li>
	<li>No dia 1, dissolvem-se 10 mg de tamoxifeno em etanol a 40 µ l. Incube a 55 ° C durante 10 min. Vortex várias vezes até que se dissolva o tamoxifeno.</li>
	<li>Adicione o óleo de milho 960 µ l. Incubar durante 5 min. a 55 ° C. Vórtice várias vezes para obter uma solução límpida.</li>
	<li>Prepare a solução em uma seringa de insulina 1 mL com agulha 27G.</li>
	<li>Nuca o mouse, agarrando o pescoço do mouse cuidadosamente com o polegar e o segundo dedo, fixação da cauda entre a base da mão e o quarto e o quinto dedo.</li>
	<li>Injete 0,1 mL (= 1 mg de tamoxifeno) da solução intraperitonealmente no quadrante inferior esquerdo do abdômen.</li>
	<li>Repeti as injeções nos dias 2 e 3.</li>
</ol>8. indução do Gene de tetraciclina dependente ou expressão de shRNA
Cuidado: A doxiciclina pode ser prejudicial. Por favor, consulte a ficha de dados de segurança.
Nota: Dependendo do tipo e duração do experimento, a doxiciclina pode ser fornecida em água potável (passo 8.1) ou chow (passo 8.2)
<ol><li>
Para experiências de curto prazo (< 10 dias) administrar doxiciclina através da água potável, utilizando o seguinte protocolo.
	<ol>
<li>Dissolva sacarose 5 g em 100 mL de água da torneira. Autoclave.</li>
		<li>Dissolva 100 mg de doxiciclina-hyclate em 5 mL de solução de sacarose (etapa 8.1.1) em um tubo cônico de 15 mL.</li>
		<li>Utilizando uma seringa de 10 mL, estéril filtrar a solução através de um filtro de 0,2 µm. Adicione a solução de sacarose, preparada na etapa 8.1.1.</li>
		<li>Fornecer a solução de sacarose-doxiciclina como água potável para o mouse. Verifique diariamente e substituir quando a solução torna-se turva, indicando o overgrowth bacteriano (substituir a solução clara depois de três dias no máximo).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para experimentos de longo prazo (> 10 dias) ou experimentos sensíveis a mudanças metabólicas, usar doxiciclina-chow comercial (por exemplo, Doxycycline Hyclate Chow 0,625 g/kg) para evitar a desidratação e/ou alterações induzidas pelo sacarose em fígados de animais tratados.</li>
</ol>9. preparação do fígado de rato para análise por imunocoloração
Cuidado: Paraformaldehyde pode ser prejudicial. Por favor, consulte a ficha de dados de segurança.
Nota: O commit quando ratos serão analisados varia de acordo com o experimento. Recomenda-se analisar o tecido hepático após não menos de três dias de tratamento doxiciclina para garantir suficiente da indução da expressão do transgene ou shRNA.
<ol><li>Prepare uma seringa de 1 mL com agulha 27G com 1 mL de solução de paraformaldeído 4% (PFA).</li>
	<li>Eutanásia o mouse por um método adequado de acordo com um protocolo aprovado do animal. Nota: Diretrizes para métodos adequados de eutanásia podem variar dependendo da instituição.</li>
	<li>Usando dissecação tesoura e pinça anatômica, abra cuidadosamente a cavidade abdominal com uma laparotomia mediana para expor o fígado. Mova o intestino delgado para o direito de expor a veia porta e a veia cava inferior (VCI).</li>
	<li>Insira a agulha da seringa preparada (ver passo 9.1) na veia cava inferior e corte a veia porta. 1 mL de PFA lentamente injete a veia cava inferior para perfundir o tecido do fígado e remover autofluorescente células vermelhas do sangue (desejáveis se coloração imunofluorescente será executada).</li>
	<li>Remova o fígado. Enxaguar em água e transferir para 5 a 10 mL de solução PFA 4%.</li>
	<li>Para cortes de parafina, tecido de correção para 36-48 h tecido está pronto para desidratação e incorporação de parafina.</li>
	<li>
Para seções congeladas, fixe o tecido em 4% PFA por 1h.
	<ol>
<li>Por cryoprotection, transferência para a solução de sacarose a 10%. Incube 60 min.</li>
		<li>Transferir a solução de sacarose 20%. Incube 60 min.</li>
		<li>Transferir a solução de sacarose de 30%. Incubar 12 – 16 h. Embed em incorporação composto por seções congeladas e congelar a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar

Transfecção de hepatócitos com injeção de veia de cauda hidrodinâmica tornou-se um método estabelecido desde a sua introdução há mais de 15 anos6. O volume injetado excede o débito cardíaco e flui da veia cava inferior para os sinusoides do fígado7, levando a transfeccao de cerca de 10-20%, em alguns casos até 40% dos hepatócitos25,26. Preditores de um bem sucedida do transfection são o volume injetado por vez injet...

Doença hepática crônica apresenta um fardo de saúde em todo o mundo1. Modelos de pesquisas com animais são ferramentas essenciais no estudo da doença hepática e ajudaram a responder questões complexas na regeneração hepática, inflamação hepática, esteatose hepática e câncer de fígado2. Um número substancial desses modelos animais depende da modificação genética das células do fígado. Portanto, ferramentas eficientes para manipular a expressão gênica em hepatócitos são úteis3. Estabelecidos métodos tais como a reprodução de linhagens geneticamente modificados do mouse ou a geração de vetores virais para a infecção do hepatócito são ou demorado, Porto preocupações de segurança, ou produzem expressão do transgene pobre em hepatócitos na vivo 4 , 5. injeção de veia de cauda hidrodinâmica (HTVI) é um método alternativo para transfeccao na vivo dos hepatócitos, permitindo a fácil, rápido e eficiente de interrogatório da função do gene no fígado. Para HTVI, um vetor carregando a sequência de DNA desejada é dissolvido em um volume de solução salina, correspondente a 10% do peso corporal do animal injetado. A solução então é injetada na veia da cauda dentro de 5-10 s6. Excedendo o débito cardíaco, o soro flui da veia cava inferior nas veias hepáticas, levando a expansão do fígado e transfection hidrodinâmico de hepatócitos7. Para conseguir a integração estável de genômica, o método foi combinado com transposon-com base em vetores, como o sistema de transposon dormir beleza. Este sistemas Medeia a recombinação de vetores de alvo com sites de recombinação genômica catalisadas por uma de8,de transposase dormir beleza -9. Para modelos de fibrose hepática ou carcinogênese, muitas vezes é desejável para genes overexpress ou silêncio em determinados pontos do tempo do modelo de doença. Para esta finalidade, ferramentas para expressão de gene inducible, tais como o sistema Cre/LoxP ou o sistema de expressão de gene tetraciclina-inducible (Tet-On) pode ser usado10.
Aqui, descrevemos um protocolo para transfeccao na vivo de hepatócitos murino usando HTVI de um sistema baseado em transposon bela adormecida . Além de um protocolo para a expressão estável, constitutiva de um transgene sob o controle de um promotor específico fígado, descrevemos um sistema mais avançado de vetor que combina expressão constitutiva da recombinase (CreER) do Cre tamoxifeno-dependente com o expressão inducible de um transgene ou microRNA-adaptado de shRNA (miR-shRNA), chamado o pTC TET-sistema11. Neste sistema de vetor, inducible transgenes ou miR-shRNAs para expressão dependente de tetraciclina são clonados no vetor coluna vertebral com um sistema de clonagem recombinational, permitindo a geração de novos vetores12rápida e fácil. Este guia em vídeo abrange a preparação de vetores apropriados, injeção e tratamento de ratos para alcançar expressão inducible do transgene/miR-shRNA e, finalmente, a preparação do tecido do fígado para análise. O método descrito neste protocolo foi projetado para permitir a combinação de qualquer sistema de rato Cre/loxP mediada com a expressão ou batida para baixo de qualquer gene de escolha, tornando-se um sistema amplamente aplicável na investigação de doença hepática.

<table><tbody><tr><td>Material Geral</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus Escada de DNA</td><td>Thermo Fisher</td><td>#SM1331</td><td>Escada de DNA para eletroforese</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T.</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td>incorporação de crio-seções</td></tr><tr><td>Biozym LE Agarose</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>brometo de etídio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637-1G</td><td></td></tr><tr><td>D (+) -Sacarose</td><td>Carl Roth</td><td>4621.1</td><td>Para adoçamento da solução de doxicilina</td></tr><tr><td>Ampicilina Sal de Sódio</td><td>AppliChem</td><td>A0839,0010</td><td>Para seleção de clones</td></tr> <tr>resistentes a Amp<td>LB Agar (Luria/Miller)</td><td>Carl Roth</td><td>X969.1</td><td></td></tr><tr><td>LB Caldo (Luria/Miller)</td><td>Carl Roth</td><td>X968.1</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C. Medium</td><td>Thermo Fischer</td><td>15544034</td><td></td></tr><tr><td>sulfato de gentamicina</td><td>AppliChem</td><td>A1492,0001</td><td>Para seleção de clones resistentes à gentamicina</td></tr><tr><td>Roti-Histofix 4 %</td><td>Fa. Roth</td><td>P087.6</td><td>solução de para-formaldeído</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mix</td><td>invitrogen/ThermoFisher</td><td>11791-020</td><td>contém LR-clonase enzyme mix II e proteinase K</td></tr><tr><td>DB3.1 Células competentes</td><td>Thermo Fisher</td><td>11782-018</td><td></td></tr><tr><td>Stbl3 E. coli quimicamente competente</td><td>Thermo Fisher</td><td>C737303</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Restriction Enzymes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PacI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0547S</td><td></td></tr><tr><td>AscI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0558S</td><td></td></tr><tr><td>FseI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0588S</td><td></td></tr><tr><td>SacI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0156S</td><td></td></tr><tr><td>SpeI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0133S</td><td></td></tr><tr><td>KpnI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0142S</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>BfuAI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0701S</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Kits</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Kit de extração de gel</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>para extração de DNA do gel</td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel e PCR Clean Up</td><td>Macherey & Nagel</td><td>740609.10</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond PC20</td><td>Macherey & Nagel</td><td>740571</td><td>Extração de plasmídeo (Mini preparação)</td></tr><tr><td>NucleoBond PC500</td><td>Macherey & Nagel</td><td>740574</td><td>Extração de plasmídeo (Maxi prep)</td></tr><tr><td>Phusion DNA polimerase de alta fidelidade</td><td>Thermo Fisher</td><td>F530S</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Materiais para experimentos com camundongos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringa Injekt F 1 ml</td><td>Braun</td><td>9166017V</td><td>Para injeção intraperitoneal</td></tr><tr><td>Omnifix Luer 3 ml</td><td>Braun</td><td>4616025V</td><td>Para injeção intravenosa</td></tr><tr><td>Cânula Sterican 24G</td><td>Braun</td><td>4657675</td><td></td></tr><tr><td>Cânula Sterican 27G</td><td>Braun</td><td>4657705</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifeno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5648-1G</td><td>Para ativação CreER</td></tr><tr><td>Óleo</td><td>de milho Sigma-Aldrich</td><td>C8267-500ML</td><td>Transportador para injeções de tamoxifeno</td></tr><tr><td>Hyclate de doxiciclina</td><td>AppliChem</td><td>A2951,0025</td><td>Ativação da expressão dependente de tetraciclina</td></tr><tr><td>Seringa Injekt 10 ml</td><td>Braun</td><td>4606108V</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur S 0.2</td><td>Sarstedt</td><td>831,826,001</td><td>Para filtração de doxiciclina</td></tr><tr><td>NaCl 0,9%</td><td>Braun</td><td>3200905</td><td>Transportador para injeções intravenosas</td></tr><tr><td>Falcon Conical Tube 50ml</td><td>Corning Life Science</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>Lâmpada infravermelha</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td>Para aquecimento da cauda do rato</td></tr><tr><td>IVIS</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td>Sistema de imagem in vivo</td></tr><tr><td>Nome<</td><td>strong>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Plasmídeos para clonagem de vetores de transposon da beleza adormecida para HTVI.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pTC</td><td></td><td>n/a</td><td>Vetor para expressão gênica constitutiva, ref. 15</td></tr><tr><td>pEN_TTmcs</td><td></td><td>Addgene #25755</td><td>Vetor de entrada para expressão gênica induzível, ref. 19</td></tr><tr><td>pEN_TTGmiRc2</td><td></td><td>Addgene #25753</td><td>Vetor de entrada para expressão induzível de miR-shRNA com co-expressão de GFP, ref. 19</td></tr><tr><td>pEN_TTmiRc2</td><td></td><td>Addgene #25752</td><td>Vetor de entrada para expressão induzível de miR-shRNA sem co-expressão de GFP, ref. 19</td></tr><tr><td>pTC ApoE-Tet</td><td></td><td>Addgene #85578</td><td>Vetor de expressão para expressão de gene induzível ou miR-shRNA com promotor ApoE.HCR.hAAT, ref. 11</td></tr><tr><td>pTC-CMV-Tet</td><td></td><td>Addgene #85577</td><td>Vetor de expressão para expressão de gene induzível ou miR-shRNA com promotor de CMV, ref. 11</td></tr></tbody></table>

constitutivos e inducible sistemas para modificação genética in vivo dos hepatócitos de rato usando injeção de veia de cauda hidrodinâmica

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Modelos de pesquisa de câncer de fígado, regeneração, inflamação e fibrose, sistemas flexíveis para a expressão do gene na vivo e silenciamento são altamente úteis. Injeção de veia cauda hidrodinâmica de construções baseadas em transposon é um método eficiente para manipulação genética dos hepatócitos em ratos adultos. Além de expressão constitutiva do transgene, este sistema pode ser usado para aplicações mais avançadas, tais como implicação de knock-down, mediada por shRNA gene do sistema CRISPR/Cas9 para induzir mutações genéticas, ou sistemas inducible. Aqui, a combinação de expressão constitutiva de CreER juntamente com expressão inducible de um transgene ou miR-shRNA de escolha é apresentado como um exemplo dessa técnica. Cobrimos o processo de várias etapa, a partir da preparação da bela adormecida-transposon constrói, a injeção e o tratamento de ratos e a preparação do tecido do fígado para análise por imunocoloração. O sistema apresentado é uma abordagem eficiente e confiável para realizar manipulações genéticas complexas nos hepatócitos. É especialmente útil em combinação com cepas de rato Cre/loxP-baseado e pode ser aplicado a uma variedade de modelos na pesquisa de doença hepática.

Eficácia transfection por injeção de veia de cauda hidrodinâmica: A porcentagem de hepatócitos murino que são transfectadas direccionado por uma única injeção é variável e depende de vários parâmetros tais como o volume de injeção, tempo de injeção, quantidade de DNA injetado e tamanho da construção injetado6, 22,23. Além disso, a eficiência de transfeccao é geralmente mais baix...

Permite a injeção de veia cauda hidrodinâmica de vetores de integração baseada em transposon transfection estável de hepatócitos murino in vivo. Aqui, apresentamos um protocolo prático para sistemas de transfeccao que permite a longo prazo expressão constitutiva de um transgene único ou expressão constitutiva e doxiciclina-inducible combinada de um transgene ou miR-shRNA no fígado.

Constitutivos e Inducible sistemas para modificação genética In Vivo dos hepatócitos de rato usando injeção de veia de cauda hidrodinâmica

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

O objetivo geral deste método é a transfecção estável de hepatócitos in vivo, com construções vetoriais para expressão gênica ou shRNA induzível. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da pesquisa do fígado. Por exemplo, pode ser aplicado para investigar mecanismos no câncer de fígado e regeneração.A principal vantagem desta técnica é a expressão combinada de CreER juntamente com a expressão de um transgene induzível R shRNA em hepatócitos de camundongos in vivo obtida por injeção hidrodinâmica na veia da cauda. Demonstrando o procedimento estará Eric Hubner, um estudante de medicina de nosso laboratório. Comece combinando 150 nanogramas de vetor de entrada contendo o RNA de grampo curto para a proteína alvo com 150 nanogramas de vetor pTC Tet e tampão TE para um volume total de oito microlitros.Em seguida, transfira a mistura de enzimas LR clonase II para o gelo e incube por dois minutos. Vórtice duas vezes durante a incubação. Em seguida, adicione dois microlitros de mistura de enzimas LR clonase II à reação e incube a 25 graus Celsius por uma hora.Após a incubação, interrompa a reação adicionando um microlitro de solução de proteinase K. Em seguida, incube

constitutive-inducible-systems-for-genetic-vivo-modification-mouse

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Este vídeo descreve um procedimento para nocaute do gene alvo usando um sistema de cre-recombinase induzível por tamoxifeno após injeção intraperitoneal de tamoxifeno em um modelo de camundongo.

Inativação do gene alvo baseada no sistema CreER-LoxP: um sistema Cre Recombinase induzível por tamoxifeno para nocaute do gene alvo em um modelo de camundongo

Este vídeo demonstra o sistema de expressão gênica da tetraciclina, ou Tet-On, em um modelo de camundongo. Na presença de doxiciclina, um derivado da tetraciclina, o sistema Tet-On que consiste na proteína transativadora reversa controlada por tetraciclina é ativado e expressa o gene de interesse.

Expressão gênica baseada em sistema regulável por tet-on induzível in vivo: um sistema de expressão gênica induzido por tetraciclina para ativação da transcrição do gene alvo em modelo de camundongo

Este vídeo descreve a técnica de transfecção genética in vivo de hepatócitos murinos por injeção hidrodinâmica da veia da cauda. Este sistema de transfecção gera uma expressão de longo prazo do transgene nos hepatócitos.

Entrega de genes hidrodinâmicos: uma técnica para transfecção in vivo de DNA exógeno em hepatócitos murinos via injeção de veia da cauda

Na transfecção in vivo de ADN nu por entrega de genes hidrodinâmico apresenta genes no tecido de um animal com uma resposta inflamatória mínima. Uma quantidade suficiente de produto do gene são gerados de tal forma que a função do gene e regulação, bem como a estrutura e função da proteína pode ser analisado.

Expressão transiente de proteínas por hidrodinâmica Gene Entrega em Ratos

Aqui, apresentamos um novo modelo de fígado de camundongo humanizado gerado em camundongos knockout celular mediado por receptor de toxina Alb (TRECK)/SCID após o transplante de células-tronco hepáticas humanas imaturas e expansíveis.

Geração de um humanizado rato Liver Usando células-tronco hepáticas humanas

O cluster regularmente intercaladas curta palíndromo repetições/CRISPR associado da proteína 9 (CRISPR/Cas9) sistema fornece uma ferramenta promissora para a engenharia genética e abre a possibilidade de integração específica de transgenes. Descrevemos um fim mediada por homologia, juntar-se (HMEJ)-baseado estratégia eficiente DNA alvo integração na vivo e alvo de terapias do gene usando CRISPR/Cas9.

Integração de alvo CRISPR/Cas9-mediada na Vivo usando uma estratégia de baseada em juntar-se mediada por homologia final

Aqui nós apresentamos um protocolo para a manipulação do gene específico cardíaca em ratos. Sob anestesia, os corações de rato foram exteriorizados através do quarto espaço intercostal. Posteriormente, adenovírus codificação de genes específicos foram injetados com uma seringa o miocárdio, seguido por medição de expressão de proteínas via na vivo de imagem e Western blot análise.

Um método simples e eficiente para In Vivo cardíaco-específicas do Gene manipulação por injeção Intramiocárdica em ratos

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar um modelo de rato quimérico fígado humano de hipercolesterolemia familiar, usando hepatócitos de células-tronco derivadas de humanas pluripotentes induzidas. Este é um modelo valioso para testar novas terapias para hipercolesterolemia.

Um modelo de Mouse quimérico fígado humano de hipercolesterolemia familiar usando hepatócitos de derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

Traduzir a purificação da afinidade do Ribossoma (armadilha) permite a isolação rápida e eficiente do tipo de pilha-específico que traduz o mRNA. Aqui, Nós demonstramos um método que combine a injeção hidrodinâmico da cauda-veia em um modelo do rato do repovoamento do fígado e da armadilha para examinar o perfil da expressão de repovoamento hepatocytes.

Perfil de expressão gênica específica do tipo de célula no fígado do mouse

Este protocolo descreve técnicas para isolar hepatócitos primários do fígado e eletroporar CRISPR-Cas9 como ribonucleoproteínas e mRNA para interromper um gene alvo terapêutico associado a uma doença metabólica herdada do fígado. Os métodos descritos resultam em alta viabilidade e altos níveis de modificação genética após a eletroporação.

Entrega mediada por eletroporação de cas9 ribonucleoproteínas e mRNA em hepatócitos de rato primário recém-isolados

Este protocolo descreve microinjeção e eletroporação in vivo para edição do genoma mediada por CRISPR regionalmente restrita no oviduto de camundongos.

Modelos de camundongos com engenharia genômica somática usando microinjeção e eletroporação in vivo

Aprenda a transfecção estável de hepatócitos murinos in vivo usando injeção hidrodinâmica de veia caudal com vetores de transposon. Este método permite expressão induzível de transgenes e shRNA para pesquisa em câncer hepático e regeneração.

Constitutivos e Inducible sistemas para modificação genética In Vivo dos hepatócitos de rato usando injeção de veia de cauda hidrodinâmica (Vídeo) | JoVE Journal

Constitutivos e Inducible sistemas para modificação genética In Vivo dos hepatócitos de rato usando injeção de veia de cauda hidrodinâmica

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