A ingestão de fluorescente, nanopartículas magnéticas para determinar as capacidades de absorção de fluido em insetos

O objetivo geral deste procedimento é avaliar os parâmetros fisiológicos da alimentação em insetos que se alimentam de fluidos usando uma solução de sacarose misturada com nanopartículas magnéticas fluorescentes. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da entomologia, como estrutura, função, relações de partes bucais de insetos e mecanismos de alimentação de insetos. A principal vantagem dessa técnica é que ela nos permite determinar se os insetos são capazes de ingerir fluidos que estão presentes como piscinas ou como filmes líquidos.

Esta demonstração utiliza moscas azuis porque suas habilidades de absorção de fluidos e morfologia da parte da boca estão bem documentadas. Moscas domésticas, borboletas de repolho e outros insetos que se alimentam de fluidos podem ser usados. Obtenha pupas de mosca e coloque-as em uma câmara ambiental com 18 horas de luz por dia e a 23 graus Celsius.

Depois que os adultos emergirem de suas pupas, não os alimente antes do experimento. Para o alimento experimental, prepare solução de sacarose a 20% com 0,5 miligramas de nanopartículas por mililitro. Em seguida, prepare uma estação de alimentação composta por um manipulador, uma pinça e um estágio de alimentação.

Na fase de alimentação, segure os alimentos com uma lâmina côncava. Além disso, prepare vários filtros de rede de nylon e filtros de membrana de diferentes tamanhos de poros para cobrir a lâmina côncava. Comece embrulhando os corpos, pernas e asas do inseto em um lenço de papel dobrado.

Deixe apenas as partes da cabeça e da boca expostas. Ao fazer isso, mantenha o inseto seguro apertando suas asas. Agora, prenda as asas embrulhadas em papel de seda entre duas lâminas de microscópio.

Em seguida, prenda as duas corrediças e prenda a braçadeira a um manipulador. Em seguida, prenda o inseto acima do estágio de alimentação usando o manipulador. Em seguida, deposite 30 microlitros de solução de alimentação no meio da lâmina côncava e cubra a solução com um pedaço poroso de papel de filtro.

A gota se espalhará ao longo do papel de filtro preenchendo os poros. Em seguida, posicione o inseto de forma que as regiões distais das partes bucais possam entrar em contato com o papel de filtro molhado, de modo que apenas a parte plana da lâmina possa ser alcançada e o inseto não possa se alimentar da região côncava. Agora, use um alfinete de inseto para estender as partes bucais sobre o papel de filtro e deixe o inseto se alimentar por 45 segundos.

Se o inseto não manifestar interesse em se alimentar, segure o aparelho bucal no papel de filtro por 45 segundos usando o pino. Isso completa o protocolo de alimentação. Para a dissecação, carregue um vidro de relógio de 50 mililitros com PBS suficiente para cobrir o corpo do inseto.

Configure isso junto com todas as ferramentas de dissecação no microscópio. Agora, remova o inseto do papel de seda mantendo as asas fechadas. Em seguida, remova a cabeça, as pernas e as asas usando uma tesoura de microdissecação de mola e coloque o tórax e o abdômen no PBS.

Para dissecar o intestino, primeiro segure a cutícula distal do abdômen e corte a cutícula na direção anterior ao longo do lado lateral, da extremidade posterior até o tórax. Tome cuidado especial para garantir que apenas a cutícula seja cortada e que o canal alimentar não seja danificado. Em seguida, remova a cutícula abdominal, o corpo gorduroso e outras estruturas com a ajuda de alfinetes de insetos até que apenas o tórax e o canal alimentar permaneçam no vidro do relógio.

Agora, identifique a cultura. É uma estrutura semelhante a um saco, localizada perto da junção do tórax e do abdômen. Se necessário, faça incisões adicionais no tórax para revelar a colheita.

Em seguida, corte o tórax restante, deixando apenas o canal alimentar e a colheita. Para testar a presença de nanopartículas ingeridas, comece usando uma pinça de dissecação de ponta fina para transferir a cultura para uma lamínula para imagem. Tenha cuidado para evitar a ruptura da cultura.

Visualize imediatamente o corte em um microscópio confocal invertido com ampliação de 20 vezes usando o canal CY3 ou contraste de fase. Para identificar as nanopartículas ingeridas, acene com uma barra de agitação magnética a cerca de 10 milímetros da cultura. Faça com que cada movimento para frente e para trás leve aproximadamente um segundo.

Enquanto agita o ímã, mova lentamente o estágio de operação para verificar o movimento das nanopartículas dentro da colheita quase transparente. Se as nanopartículas estiverem presentes na cultura, elas ondularão em uníssono com a barra de agitação magnética. Um inseto que se alimenta de solução de uma superfície porosa deve criar uma ponte líquida estável por meio da instabilidade do platô para superar a pressão capilar que mantém o líquido nos poros.

Prevê-se que o tamanho do conduto de alimentação de um inseto determinará o menor tamanho de poro do qual ele pode se alimentar. Depois que os insetos foram dissecados para avaliar se as nanopartículas foram ingeridas, suas partes bucais foram fotografadas para medir o tamanho do conduto do canal alimentar. Para as moscas, o diâmetro da pseudotraqueia e a abertura oral foram medidos.

A análise das nanopartículas ingeridas sugere uma estreita relação entre o tamanho do conduto da parte bucal distal e o menor tamanho de poro do qual um inseto pode se alimentar. Essa relação não é observada com as partes proximais da boca. Consequentemente, a captação de líquidos para dípteros ocorreria primeiro na pseudotraqueia, em vez da abertura oral, e a ação capilar deve ter um papel importante na alimentação.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como alimentar os insetos com uma solução de nanopartículas, dissecá-los para isolar sua colheita e, em seguida, inspecionar a cultura em busca de nanopartículas. Ao tentar este procedimento, é importante ter cuidado durante as dissecções. Se a colheita for rompida, ela pode derramar o conteúdo líquido e as nanopartículas, arruinando assim sua amostra.